Nghiên cứu sử dụng vi khuẩn pseudomonas sp đa 3 1 trong kiểm soát nấm hại cây trồng rhizoctonia và fusarium

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT - LÊ ĐÌNH QUYỀN NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI KHUẨN Pseudomonas SP ĐA3.1 TRONG KIỂM SOÁT NẤM HẠI CÂY TRỒNG Rhizoctonia VÀ Fusarium LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2012 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT - LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI KHUẨN Pseudomonas SP ĐA3.1 TRONG KIỂM SOÁT NẤM HẠI CÂY TRỒNG Rhizoctonia VÀ Fusarium Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: Học viên: 60 42 30 Lê Đình Quyền Hƣớng dẫn khoa học: PGS TS QUYỀN ĐÌNH THI Hà Nội - 2012 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận văn này, tơi nhận giúp đỡ PGS TS Quyền Đình Thi, Trưởng phịng Cơng nghệ Sinh học Enzyme, Phó Viện trưởng Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, người định hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn, sửa luận văn tạo điều kiện kinh phí, hóa chất trang thiết bị nghiên cứu giúp tơi hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ tận tình TS Đỗ Thị Tun tập thể Phịng Cơng nghệ sinh học enzyme Tôi xin gửi lời cảm ơn đến thầy, cô viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật, trường Đại học Thái Nguyên tạo điều kiện cho tơi q trình học tập Tơi xin cảm ơn gia đình, bạn bè quan công tác, động viên động lực tinh thần để tơi hồn thành luận văn Hà Nội, tháng 12 năm 2012 Học viên Lê Đình Quyền Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 10 CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 12 1.1 Bệnh trồng nấm Fusarium Rhizocronia gây 12 1.1.1 Đặc điểm sinh học nấm Fusarium Rhizocronia hại trồng .12 1.1.2 Tình hình bệnh hại trồng nấm Fusarium Rhizocronia gây Việt Nam 15 1.1.3 Biện pháp phòng trừ nấm bệnh hại trồng 16 1.2 Vi khuẩn Pseudomonas 18 1.2.1 Khái quát vi khuẩn Pseudomonas .18 1.2.2 Tình hình nghiên cứu ứng dụng chủng Pseudomonas kiểm soát nấm bệnh giới .19 1.2.3 Tình hình nghiên cứu ứng dụng chế phẩm sinh học kiểm soát nấm bệnh Việt Nam .22 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 24 2.1 Chủng giống 24 2.2 Hóa chất 24 2.2.1 Dung dịch đệm 24 2.2.2 Môi trƣờng nuôi cấy 25 2.3 Thiết bị 25 2.4 Sàng lọc chủng Pseudomonas có khả ức chế nấm F oxysporum R solani cao .26 2.5 Phƣơng pháp thử hoạt tính ức chế nấm 26 2.6 Các phƣơng pháp sinh học phân tử 26 2.6.1 Tách chiết DNA tổng số 26 2.6.2 Khuếch đại gen PCR .27 2.6.3 Gắn sản phẩm PCR vào pJET1.2 .27 2.6.4 Biến nạp plasmid 27 2.6.5 Tách chiết plasmid 28 2.6.6 Cắt plasmid enzyme giới hạn 29 2.6.7 Điện di gel agarose 29 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.6.7 Đọc trình tự nucleotide 29 2.7 Tách chiết hoạt chất thứ cấp dung môi phân cực 30 2.8 Sắc kí cột 30 2.9 Sắc kí mỏng 30 2.10 Sắc ký khối phổ .30 2.11 Phân tích cấu trúc cộng hƣởng từ hạt nhân 31 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 Sàng lọc chủng vi khuẩn có độc lực cao với nấm F oxysporum R solani 32 3.2 Định tên chủng 32 3.3 Hoạt tính ức chế nấm dịch lọc ngoại bào chủng Pseudomonas sp ĐA3.1 .34 3.4 Đánh giá tính chất lí hóa dịch lọc ngoại bào chủng Pseudomonas sp ĐA3.1 35 3.4.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ 35 3.4.2 Ảnh hƣởng pH 37 3.4.3 Ảnh hƣởng proteinase K 38 3.5 Tinh hoạt chất thứ cấp ngoại bào ức chế nấm .39 3.5.1 Tách chiết tinh hoạt chất từ dịch nuôi cấy ngoại bào từ chủng Pseudomonas sp ĐA3.1 39 3.5.2 Xác định cấu trúc hoạt chất tinh từ Pseudomonas sp ĐA3.1 40 3.5.3 Đánh giá tính chất lí hóa hoạt chất tinh .44 3.5.4 Hoạt tính ức chế tối thiểu (MIC) hoạt chất PCA với nấm R solani F oxysporum .45 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 48 KẾT LUẬN 48 ĐỀ NGHỊ .48 TÀI LIỆU THAM KHẢO .49 Tài liệu tiếng việt: 49 Tài liệu tiếng Anh: 50 PHỤ LỤC………………………………………………………………………… 54 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1 Các dung dịch đệm đƣợc sử dụng .24 Bảng 2.2 Các thiết bị đƣợc sử dụng .25 Bảng 3.1 Ảnh hƣởng nồng độ dịch lọc tế bào Pseudomonas sp ĐA3.1 lên sinh trƣởng F oxysporum 35 Bảng 3.2 Ảnh hƣởng nồng độ dịch lọc tế bào Pseudomonas sp ĐA3.1 lên sinh trƣởng sợi nấm R solani 35 Bảng 3.3 Dữ liệu phổ NMR hoạt chất ức chế nấm tinh từ Pseudomonas sp ĐA3.1 (CDCl3, 1H: 500 MHz; 13C: 125,76 MHz) δppm 41 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1 Hình thái nấm F oxysporum đĩa PDA (A) bào tử nấm F oxysporum soi kính hiển vi (B) 12 Hình 1.2 Hình thái nấm R solani đĩa PDA (A) sợi nấm R solani soi kính hiển vi (B) 13 Hình 1.3 Hình ảnh khuẩn lạc chủng Pseudomonas sp ĐA3.1 đĩa thạch (A) hình thái tế bào (B) 18 Hình 3.1 Chọn lọc chủng vi khuẩn ức chế nấm F oxysporum (A) R solani (B) 32 Hình 3.2 Điện di đồ DNA tổng số (A); Sản phẩm PCR (B): với khuôn DNA tách chiết từ chủng Pseudomonas sp ĐA3.1; Dòng plasmid tái tổ hợp đƣợc lựa chọn (C); Sản phẩm cắt vector tái tổ hợp XbaI XhoI (D) M: Marker 33 Hình 3.3 Cây phân loại chủng Pseudomonas sp ĐA3.1 (HQ914782.1: P aeruginosa strain TAUC7; HM597240.1: Pseudomonas sp MB65; HM439411.1: P aeruginosa strain PCP26; FN645730: P aeruginosa) 33 Hình 3.4 Hoạt tính ức chế sinh trƣởng F oxysporum R solani chủng Pseudomonas sp ĐA3.1 nồng độ khác sau ngày nuôi cấy 34 Hình 3.5 Hình ảnh ức chế phát triển dị ch nuôi cấy ngoại bào tƣ̀ chủng Pseudomonas sp ĐA3.1 với nấm F oxysporum (AD) R solani (EH) sau ngày nuôi cấy nồng độ khác (A, E: nồng độ 1%; B, F: nồng độ 10%; C, G: nồng độ 20%; D, H: nồng độ 50%; 1: đĩa đối chứng, 2: đĩa thí nghiệm) .34 Hình 3.6 Hoạt tính ức chế sinh trƣởng F oxysporum R solani chủng Pseudomonas sp ĐA3.1 sau xử lí nhiệt độ sau ngày ni cấy 36 Hình 3.7 Hoạt tính ức chế sinh trƣởng dịch ngoại bào Pseudomonas sp ĐA3.1 sau xử lí 100°C F oxysporum R solani sau ngày nuôi cấy (A, C: F oxysporum; B, D: R solani; C: không xử lý; D: Đối chứng âm) 36 Hình 3.8 Hoạt tính ức chế sinh trƣởng F oxysporum R solani dịch lọc ngoại bào Pseudomonas sp ĐA3.1 sau xử lí độ pH khác 37 Hình 3.9 Hoạt tính ức chế sinh trƣởng dịch lọc ngoại bào chủng Pseudomonas sp ĐA3.1 sau xử lí pH F oxysporum (AD) R solani (EH) sau Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ngày thử nghiệm (A, E: pH 2; B, F: pH 4; C, G: pH 8; D, H: pH 10) 1: Môi trƣờng nuôi cấy ban đầu; 2: Dịch nuôi cấy 37 Hình 3.10 Hoạt tính ức chế sinh trƣởng F oxysporum R solani dịch lọc ngoại bào Pseudomonas sp ĐA3.1 sau xử lí với proteinase K nồng độ khác sau ngày xử lý 38 Hình 3.11 Hoạt tính ức chế sinh trƣởng dịch lọc ngoại bào Pseudomonas sp ĐA3.1 sau xử lí proteinase K nấm F oxysporum (A, B) R solani (C, D) (A,C: 0,1 mg/ml proteinase K; B,D: 0,5 mg/ml Proteinase K; 1,2: Đĩa thí nghiệm; 3: Dịch khơng xử lý; 4: Đối chứng âm) 39 Hình 3.12 Sắc ký đồ TLC hoạt chất tinh từ Pseudomonas sp ĐA3.1 (A) (1: hoạt chất tinh sạch, 2: dịch chiết) Thử hoạt tính ức chế F oxysporum phân đoạn tinh (B) (1: đối chứng nƣớc cất, 2: methanol, 3: dịch sau chiết, 4: dịch nuôi cấy; 5-7: phân đoạn tinh sạch) 40 Hình 3.13 Phổ 13C (A) phổ 1H (B) hoạt chất ức chế nấm tinh từ chủng P aeruginosa ĐA3.1 .41 Hình 3.14 So sánh liệu phổ NMR (A, B) cấu tạo phân tử (C, D) hoạt chất tinh từ chủng P fluorescens 2-79 (A), (C) chủng Pseudomonas sp ĐA3.1 (B), (D) .42 Hình 3.15 Cấu trúc phân tử PCA tinh từ chủng P aeruginosa ĐA3.1 42 Hình 3.16 Qui trình tinh hoạt chất PCA từ dịch nuôi cấy Pseudomonas sp ĐA3.1 phân lập Việt Nam 43 Hình 3.17 Hoạt tính kháng nấm F oxysporum R solani hoạt chất PCA tinh sau xử lí với nhiệt độ (A), với pH khác (B), với proteinase K (C) 44 Hình 3.18 Hoạt tính kháng nấm F oxysporum (AD) R solani (EH) hoạt chất PCA tinh xử lý với nhiệt độ (A, E), với pH khác (B, C, F, G), với proteinase K (D, H) sau ngày nuôi cấy .44 Hình 3.19 Khả ức chế nấm F oxysporum R solani hoạt chất PCA tinh từ chủng Pseudomonas sp ĐA3.1 45 Hình 3.20 Hoạt tính ức chế tối thiểu PCA với F oxysporum (A) R solani (B) tách chiết tinh từ dịch nuôi cấy chủng Pseudomonas sp ĐA3.1 nồng độ: 30, 40, 50, 60, 70, 80 g/ml 46 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn BẢNG CHỮ VIẾT TẮT bp Base pair DNA Deoxyribonucleic acid RNase Ribonuclease dNTP 2-Deoxynucleoside 5-triphosphate ĐC Đối chứng EtBr Ethidium bromide HCN Hydrogen Cyanide MIC Minimum Inhibition Concentrate IPM Integrated Pests Management PCR Polymerase chain reaction PCA Phenazine-1-Carboxylic Axit TLC Thin Layer Chromagraphy Taq Thermus aquaticus TE Tris EDTA TBE Tris boric acid EDTA v/v volume/volume (thể tích/thể tích) w/v weight/volume (khối lƣợng/thể tích) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Hàng năm giới, bệnh gây tổn thất to lớn cho sản xuất nông nghiệp Chúng phá hủy đến 537,3 triệu loại nông sản chủ yếu, chiếm 11,6% tổng sản lƣợng nông nghiệp giới Trong loại bệnh bệnh nấm gây chiếm khoảng 83%, bệnh nấm Fusarium Rhizocronia gây chiếm tỉ lệ tƣơng đối lớn Nấm bệnh Fusarium Rhizoctonia gây bệnh nhiều loại rau lƣơng thực nhƣ lạc, cà chua, khoai tây, cà phê, tiêu Chúng có khả tồn đất thời gian dài, phát sinh gây hại từ giai đoạn kéo dài thu hoạch không áp dụng biện pháp phòng trừ triệt để Biện pháp phòng trừ bệnh hại trồng phổ biến sử dụng loại thuốc hóa học Mặc dù có ƣu điểm phổ tác dụng rộng, hiệu tác dụng nhanh, nhƣng thuốc hóa học ngày bộc lộ rõ nhƣợc điểm nhƣ hiệu phòng trừ thấp loại nấm bệnh đất, nhanh bị ức chế nấm bệnh sau thời gian sử dụng, gây ô nhiễm môi trƣờng, ảnh hƣởng xấu đến sức khỏe ngƣời Bên cạnh việc làm giảm chất lƣợng lƣơng thực, thực phẩm, loại hóa chất cịn tích tụ đất, gây ô nhiễm môi trƣờng làm cho sản xuất bền vững Hiện giới nhƣ Việt Nam, việc sử dụng chế phẩm vi sinh thay phần thuốc hóa học để phịng trừ số bệnh trồng vi sinh vật gây xu hƣớng chủ yếu Các chế phẩm đƣợc sử dụng rộng rãi nhằm tạo nơng nghiệp hữu an tồn bền vững Pseudomonas chi vi khuẩn phổ biến môi trƣờng, đƣợc sử dụng kiểm soát nhiều bệnh hại trồng khác Từ năm 1970, giới có nhiều cơng trình nghiên cứu ứng dụng Pseudomonas để phòng trừ nấm bệnh bảo vệ trồng, nhiều sản phẩm đƣợc sản xuất thƣơng mại hóa (Kommedahl, Chang-Mew, 1975; Cook, Rovira, 1976; Howell, Stipanovic, 1980; Aziz et al., 2012) Tuy nhiên, kết đạt đƣợc nghiên cứu sử dụng chế phẩm sinh học bảo vệ thực vật hạn chế Chi phí thuốc bảo vệ thực vật giới đạt 39,4 tỷ USD năm 2007, giá trị thƣơng mại thuốc bảo vệ thực vật sinh học đƣợc sử dụng toàn giới chiếm 1,9% tổng giá trị loại thuốc bảo vệ thực vật (Kiely et al., 2004; Grube et al., 2011) Vì vậy, việc tăng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 100 100 80 80 60 F oxysporum R solani 40 20 Hoạt tính ức chế (%) Hoạt tính ức chế (%) 3.5.3 Đánh giá tính chất lí hóa hoạt chất tinh 60 F oxysporum R solani 40 20 0 10 30 60 90 Thời gian xử lý (phút) 10 pH xử lý A B Hoạt tính ức chế (%) 100 80 60 F oxysporum R solani 40 20 0 0,1 0,5 1,0 Nồng độ proteinase K (mg/ml) C Hình 3.17 Hoạt tính kháng nấm F oxysporum R solani hoạt chất PCA tinh sau xử lí với nhiệt độ (A), với pH khác (B), với proteinase K (C) A B C D E F G H Hình 3.18 Hoạt tính kháng nấm F oxysporum (AD) R solani (EH) hoạt chất PCA tinh xử lý với nhiệt độ (A, E), với pH khác (B, C, F, G), với proteinase K (D, H) sau ngày ni cấy Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Hoạt chất PCA tinh đƣợc sử dụng để đánh giá hoạt tính kháng nấm sau ủ nhiệt độ, pH proteinase K, hoạt chất sau xử lý đƣợc đánh giá khả ức chế nấm F oxysporum R solani phƣơng pháp ức chế theo nồng độ bổ sung Kết cho thấy hoạt chất PCA bền xử lý với yếu tố lý hóa nhƣ nhiệt độ, pH proteinase K (Hình 3.17 Hình 3.18) Hoạt chất PCA đƣợc xử lý với nhiệt độ 100°C thời gian khác hình 3.17A, sau xử lý hoạt tính giữ đƣợc 80-90% so với mẫu đối chứng Ở pH hoạt tính hoạt chất PCA tăng nhẹ, pH hoạt tính ức chế nấm PCA giảm nhẹ, pH 10 hoạt chất PCA giữ 90% hoạt tính Khi xử lý PCA với proteinase K nồng độ từ 0,1-1,0 mg/ml hoạt tính ức chế hầu nhƣ khơng thay đổi, điều giải thích cấu tạo PCA khơng có cấu trúc protein nên khơng bị ảnh hƣởng proteinase K xử lý So với dịch lọc từ chủng P aeruginosa ĐA3.1 hoạt chất PCA bền xử lý với yếu tố nhiệt độ, pH, proteinase K Hoạt tính giảm nhiều xử lý với nhiệt độ pH, proteinase K hầu nhƣ khơng ảnh hƣởng tới hoạt tính PCA Từ thấy hoạt chất PCA có khả sử dụng điều kiện nhiệt độ pH rộng, điều tạo điều kiện thuận lợi cho trình tách chiết, tinh nhƣ bảo quản sử dụng hoạt chất PCA 3.5.4 Hoạt tính ức chế tối thiểu (MIC) hoạt chất PCA với nấm R solani F oxysporum Hoạt chất tinh PCA đƣợc thử nghiệm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) với nấm R solani F oxysporum phƣơng pháp ức chế theo nồng độ bổ sung Hoạt tính ức chế (%) 100 80 60 F oxysporum R solani 40 20 30 40 50 60 70 80 Nồng độ PCA (microgram/ml) Hình 3.19 Khả ức chế nấm F oxysporum R solani hoạt chất PCA tinh từ chủng Pseudomonas sp ĐA3.1 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Kết hình 3.19 hình 3.20 cho thấy hoạt chất PCA tinh từ chủng P aeruginosa ĐA3.1 có khả ức chế sinh trƣởng phát triển nấm F oxysporum R solani tốt Ở nồng độ 30 μg/ml hoạt chất PCA ức chế 71% với nấm F oxysporum 76% với nấm R solani Ở nồng độ 50μg/ml hoạt chất PCA ức chế đƣợc 95% với nấm F oxysporum 97% với nấm R solani Khi nồng độ 80 g/ml hoạt chất PCA tinh đƣợc có khả ức chế hồn tồn sinh trƣởng phát triển nấm R solani ức chế đƣợc 97% với nấm F oxysporum Qua cho thấy khả ức chế nấm F oxysporum hoạt chất PCA nồng độ cao giảm mạnh, nồng độ tăng dần từ 50 μg/ml đến 80 μg/ml khả ức chế thêm PCA tăng thêm 2% khó xác định đƣợc nồng độ MIC PCA với nấm F oxysporum Makarand cộng (2007) công bố cho thấy giá trị MIC PCA từ chủng P aeruginosa ID 4365 với nấm S rolfssi nồng độ 29 μg/ml, nồng độ 50 μg/ml PCA ức chế F oxysporum đạt 92% (Makarand et al., 2007) A B Hình 3.20 Hoạt tính ức chế tối thiểu PCA với F oxysporum (A) R solani (B) tách chiết tinh từ dịch nuôi cấy chủng Pseudomonas sp ĐA3.1 nồng độ: 30, 40, 50, 60, 70, 80 g/ml Theo số công bố giới giá trị MIC hoạt chất PCA đƣợc xác định số loài nấm thử nghiệm Keel cộng (1992) cho hoạt chất 2,4-diacetylphloroglucinol tinh từ chủng P fluorescens có giá trị MIC với nấm F oxysporum sp lycopersici F oxysporum sp lini 128 μg/ml, với nấm R solani 128 μg/ml (Keel et al., 1992) Makarand cộng (2007) hoạt chất phenazine-1-carboxylic acid tinh từ chủng P aeruginosa ID 4365 có khả ức chế nấm A niger, F oxysporum, S Rolfssi C falcatum Giá trị MIC PCA với nấm S rolfssi nồng độ 29 μg/ml, nồng độ 50 μg/ml PCA có khả ức chế sinh trƣởng với nấm A niger đạt 96%, C falcatum đạt 97%, F oxysporum đạt 92% (Makarand et al., 2007) Uzair cộng (2008) công bố chủng P aeruginosa CMG1055 sinh tổng hợp hoạt chất ức chế nấm có khả ức chế nấm A niger, T Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn mentagrophytes, Rhizopus, dịch chiết acetone từ dịch ni cấy có giá trị MIC từ 5075 μg/ml với nấm thử nghiệm (Uzair et al., 2008) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN Tuyển chọn đƣợc chủng Pseudomonas sp ĐA3.1 có khả đối ức chế mạnh với nấm bệnh F oxysporum R solani Định danh 16S rRNA cho thấy chủng Pseudomonas sp ĐA3.1 có độ tƣơng đồng 98% với lồi P aerigunosa strain TAUC7 có mã số HQ914782.1 Trình tự 16S rRNA từ chủng Pseudomonas sp ĐA3.1 đƣợc đăng ký Genbank với mã số JN592444.1 Dịch lọc ngoại bào chủng Pseudomonas sp ĐA3.1 có khả ức chế nấm F oxysporum R solani hiệu quả, ức chế sinh trƣởng phát triển chủng nấm tƣơng ứng đạt 88% 95% thử nồng độ 10% Dịch lọc ngoại bào bền với nhiệt độ, pH proteinase K Xây dựng đƣợc quy trình tách chiết, tinh hoạt chất PCA từ dịch ngoại bào chủng Pseudomonas sp ĐA3.1 với thông số kỹ thuật: hoạt chất đƣợc chiết với ethyl axetat với tỷ lệ dung môi/nguyên liệu 1:1 v/v; thời gian chiết giờ, cặn quay đƣợc hịa methanol đƣợc tinh qua cột silicagel với hệ dung môi chloroform:ethyl axetat Từ phổ 1H-NMR, 13C-NMR kết hợp với phổ DEPT, HSQC, HMBC đặc trƣng lý hóa xác định hoạt chất tinh đƣợc phenazine-1-carboxylic axit Hoạt chất PCA tinh bền với nhiệt độ, ủ 100°C khoảng thời gian khác hoạt tính kháng nấm trì đƣợc 80-90% Hoạt chất PCA hoạt động dải pH rộng từ 2-10, proteinase K không ảnh hƣởng nhiều đến hoạt tính ức chế nấm PCA Giá trị MIC hoạt chất PCA tinh với nấm R salani 80 μg/ml Ở nồng độ 80 μg/ml hoạt chất PCA ức chế đƣợc 97% sinh trƣởng phát triển nấm F oxysporum ĐỀ NGHỊ Nghiên cứu phối trộn với chất phụ gia phù hợp để tạo thành chế phẩm có khả diệt nấm cao với thông số kỹ thuật phù hợp với điều kiện khí hậu Việt Nam Thử nghiệm nhà lƣới với nồng độ chế phẩm khác để đánh giá hiệu sử dụng chế phẩm bƣớc đầu thử nghiệm chế phẩm diện hẹp đồng ruộng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt: Bùi Thị Ngần (2001) Nghiên cứu số bệnh hại quan trọng (giác ban, đốm – cháy lá, mốc trắng) phía Nam biện pháp phòng trừ Viện Khoa học Kỹ thuật Nơng nghiệp Việt Nam Cục Y Tế Dự Phịng Và Môi Trƣờng – Bộ Y Tế (2009) Gần 5000 ngƣời nhiễm độc thuốc bảo vệ thực vật http://www.thuocbietduoc.com.vn/home/newdt8490tt2ev4.aspx Đại học Quốc gia Hà Nội, 2009, Nguy nhiễm độc thuốc bảo vệ thực vật ngày gia tăng URL có http://ca.cand.com.vn/viVN/thoisuxahoi/tintucsukien/2009/12/155481.cand Đào Kiều Dung (1999) Kết bƣớc đầu khảo sát phân bố dòng nấm Trichoderma Bến Tre Tiền Giang Tạp chí NN CN Thực phẩm 4: 158-159 Đỗ Tấn Dũng (2007) Nghiên cứu bệnh lở cổ rễ (Rhizoctonia solani Kuhn) hại số trồng vùng Hà Nội năm 2005-2006 Tạp chí bảo vệ thực vật Đỗ Thị Tuyên, Lê Đình Quyền, Quyền Đình Thi, Nguyễn Huy Hồng, Nguyễn Ngọc Dũng (2011) Pseudomonas aeruginosa strain ĐA3.1 16S ribosomal RNA gene, partial sequence GenBank: JN592444.1 Đoàn Thị Thanh (2005) Nghiên cứu đa dạng sinh học isolates nấm Fusarium spp Việt Nam số nƣớc khác Tập san bảo vệ thực vật Lê Thị Hồng Minh, Phạm Việt Cƣờng, Nguyễn Thị Kim Cúc (2005) Tách dòng giải trình tự đoạn gen PhlD mã hóa cho 2,4-diacetylphloroglucinol từ Serratia marcescens kháng Fusarium oxysporum In: Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống, Báo cáo khoa học, Hội nghị toàn quốc, pp 1315-1317 Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Kim Vân (2003) Nghiên cứu chủng nấm Rhicoctonia solani Kühn gây hại cải bắp bƣớc đầu khảo sát biện pháp phịng trừ Tạp chí bảo vệ thực vật 192: 18-21 Nguyễn Minh Anh, Nguyễn Thị Tuyết Nhung, Lê Thanh Hòa, Nguyễn Ngọc Dũng (2003) Xác định mối quan hệ di truyền chủng Pseudomonas fluorescens Ps7-1 P chlororaphis Ps9-1 sở phân tích trình tự nucleotide gene 16S rRNA In: Tuyển tập Hội thảo Những vấn đề nghiên cứu sinh học lần thứ hai, pp 818-821 Nguyễn Ngọc Dũng, Nguyễn Minh Anh (2007) Khả phân hủy sợi nấm mối quan hệ di truyền chủng Bacillus sp TD67 In: Tuyển tập Hội thảo vấn đề nghiên cứu khoa học sống Nxb Khoa học Kỹ thuật Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Nguyễn Ngọc Dũng, Nguyễn Minh Anh, Nguyễn Mạnh Cƣờng (2005) Xác định đặc điểm chủng Bacillus sp TD67 In: Tuyển tập hội thảo Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống, pp 106-108 Nxb Khoa học Kỹ thuật Nguyễn Ngọc Dũng, Nguyễn Thị Tuyết Nhung, Nguyễn Minh Anh (2003) Sử dụng vi khuẩn Pseudomonas huỳnh quang phòng chống nấm gây bệnh trồng In: Tuyển tập Báo cáo khoa học hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc 2003 Nxb Khoa học Kỹ thuật Nguyễn Thị Tuyết Nhung, Nguyễn Minh Anh, Nguyễn Thị Quỳnh Mai, Phạm Thanh Hà, Nguyễn Ngọc Dũng (2004) Sự diện vi khuẩn Pseudomonas sinh huỳnh quang mẫu khác khả đối kháng nấm gây bệnh trồng Fusarium oxysporum chúng Tạp chí Sinh học 26: 67-71 Nguyễn Thị Tuyết Nhung, Nguyễn Minh Anh, Phan Thị Hoài Anh, Nguyễn Ngọc Dũng (2006) Nghiên cứu chế kháng nấm Fusarium oxysporum gây bệnh trồng số chủng vi khuẩn Pseudomonas huỳnh quang chọn lọc Tạp chí Sinh học 28: 77-81 Trần Phƣơng Thảo, Nguyễn Minh Anh, Nguyễn Ngọc Dũng (2007) Sự tác động tƣơng tác chủng Bacillus sp TD67 nấm gây bệnh Fusarium oxysporum điều kiện in vitro Tạp chí CNSH 5: 447-452 Trần Thị Thuần (1997) Cơ chế nấm đối kháng Trichoderma viride với nấm bệnh hại trồng Tạp chí bảo vệ thực vật 4: 33-35 Trần Thị Thuần, Phạm Ngọc Dung, Nguyễn Thị Ly (2004) Qui trình sản xuất hiệu phòng trừ số bệnh chế phẩm nấm đối kháng Trichoderma Tạp chí NN PTNT Tài liệu tiếng Anh: Abbott WS (1925) A method of computing the effectiveness of an insecticide J Econ Entomol 18: 265-267 Andrews JH (1992) Biological control in the phyllosphere Annu Rev Phytopathology 30: 603–635 Aziz LM, Hamza SJ, Abdul-Rahman IA (2012) Isolation and characterization of phenazine produced from mutant Pseudomonas aeruginosa Al-Anbar J Vet Sci Baltch AL, Smith RP (1995) Pseudomonas aeruginosa : Infections and Treatment N Engl J Med 332: 616-617 Blazevic DJ, Köpcke MH, Matsen JM (1973) Incidence and identification of Pseudomonas fluorescens and Pseudomonas putida in the clinical laboratory Appl Microbiol 25: 107 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Breidenstein EB, Fuente-Núñez C, Hancock RE (2011) Pseudomonas aeruginosa: all roads lead to resistance Trends Microbiol 19: 419–26 Budzikiewicz H (1993) Secondary metabolites from fluorescent Pseudomonads FEMS Microbiol Rev 104: 209-228 Carrasco C (1989) Pesticide Productivity Revisited In MA, University of Massachusetts Ceresini P (2011) "Rhizoctonia Solani." Rhizoctonia Solani In NC State University Chythanya R, Karunasagar I (2002) Inhibition of shrimp pathogenic vibrios by a marine Pseudomonas I-2 strain Aquaculture 208: 1-10 Cook RJ, Rovira AD (1976) The role of bacteria in the biological control of Gaeumannomyces graminis by suppressive soils Soil Biol Biochem 8: 269273 De Lucca AJ, Jacks TJ, Takemoto JY, al e (1999) Fungal lethality, binding, and cytotoxicity of syringomycin-E Antimicrob Agents Chemother 43: 371-373 Doring G, Holder IA, Botzenhart K (1987) Basic Research and Clinical Aspects of Pseudomonas aeruginosa Antibiot Chemother 39: 1-15 Dowling DN, O’Gara F (1994) Metabolites of Pseudomonas involved in the biocontrol of plant disease Trends Biotechnol 12: 133–141 Farr DF, Bills GF, Chamuris GP, Rossman AY (1989) Fungi on plants and plant products in the United States In American Phytopathological Society, St Paul, Minn Fenton AM, Stephens PM, Crowley J, O’Callaghan M, O’Gara F (1992) Exploitation of gene(s) involved in 2,4-diacetylphloroglucinol biosynthesis to confer a new biocontrol capability to a Pseudomonas strain Appl Environ Microbiol 58: 3873–3878 Gerhardson B (2002) Biological substitutes for pesticides Trends Biotechnol 20: 338-343 Gordon TR, Martyn RD (1997) The evolutionary biology of Fusarium oxysporum Annu Rev Phytopathol 35: 111-128 Grube A, Donaldson D, Kiely T, Wu L (2011) Pesticides industry sales and usage, 2006 and 2007 market estimates Gupta CP, Dubey RC, Kang SC, Maheshwari DK (2001) Antibiosis-mediated necrotrophic effect of Pseudomonas GRC2 against two fungal plant pathogens Curr Sci 81: 91-94 Handelsman J, Stabb EV (1996) Biocontrol of Soilborne Plant Pathogens Plant Cell 8: 1855-1869 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Hart K, Pimentel D (2002) Public health and costs of pesticides In, pp 677-679 Encyclopedia of Pest Management, Marcel Dekker, New York Henkes GJ, Jousset A, Bonkowski M, Thorpe MR, Scheu S, Lanoue A, Schurr U, Rose USR (2011) Pseudomonas fluorescens CHA0 maintains carbon delivery to Fusarium graminearum-infected roots and prevents reduction in biomass of barley shoots through systemic interactions J Exp Bot 62: 4337– 4344 Hill DS, Stein JI, Torkewitz NR, Morse AM, Howell CR, Pachlatko JP, Becker JO, Ligon JM (1994) Cloning of genes involved in the synthesis of pyrrolnitrin from Pseudomonas fluorescens and role of pyrrolnitrin synthesis in biological control of plant disease Appl Environ Microbiol 60: 78-85 Howell CR, Stipanovic RD (1980) Suppression of Pythium ultimum-induced damping-off of cotton seedlings by Pseudomonas fluorescens and its antibiotic, pyoluteorin Phytopathology 70: 712-715 Keel C, Schnider U, Maurhofer M, Voisard C, Laville J, Burger U, Wirthner P, Haas D, Defago G (1992) Suppression of root diseases by Pseudomonas fluorescens CHA0: importance of the bacterial secondary metabolite 2,4diacetylphloroglucinol Mol Plant Microbe In 5: 4-13 Kiely T, Donaldson D, Grube A (2004) Pesticides industry sales and usage, 2000 and 2001 market estimates Kiprianova EA, Rabionvich AS (1969) Production of phenazine-1-carboxylic acid by Pseudomonas fluorescens Mikrobiologiia 38: 224-7 Kommedahl T, Chang-Mew IP (1975) Biocontrol of corn root infection in the field by seed treatment with antagonists Phytopathology 65: 296-300 Kraus J, Loper JE (1995) Characterization of a genomic region required for production of the antibiotic pyoluteorin by the biological control agent Pseudomonas fluorescens Pf-5 Appl Environ Microbiol 61: 849-854 Lanteigne C, Gadkar VJ, Wallon T, Novinscak A, Filion M (2012) Production of DAPG and HCN by Pseudomonas sp LBUM300 contributes to the biological control of bacterial canker of tomato Phytopathology 102: 96773 Larkin RP, Hopkins DL, and Martin FN (1993) Effect of successive watermelon plantings on Fusarium oxysporum and other microorganisms in soils suppressive and conducive to fusarium wilt of watermelon Phytopathology 83: 1097-1105 Lee JY, Moon SS, Hwang BK (2003) Isolation and in vitro and in vivo activity against Phytophthora capsici and Colletotrichum orbiculare of phenazine-1carboxylic acid from Pseudomonas aeruginosa strain GC-B26 Pest Manag Sci 59: 872-82 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Ligon J, Lam S, Gaffney T, Hill S, Hammer R, Torkewitz N (1996) Biocontrol: modifications for enhanced antifungal activity Tacey G, Mullin B, Gresshoff P (eds) Biology of plant-microbe interactions International Society for Molecular Plant-Microbe Interactions St Paul, Minn Makarand RR, Prashant SD, Bhushan CL, Sudhir CB (2007) Detection, isolation and indentification of phenazine-1-carboxylic acid produced by biocontrol strains of Pseudomonas aeruginosa Journal of Scientific & Industrial Research 66: 627-631 Mavrodi DV, Blankenfeldt W, Thomashow LS (2006) Phenazine compounds in fluorescent Pseudomonas spp biosynthesis and regulation Annu Rev Phytopathol 44 Mavrodi DV, Ksenzenko V, Chatuev B, Thomashow LS, Boronin AM (1997) Structural and functional organization of Pseudomonas fluorescens genes encoding enzymes of phenazine-1-carboxylic acid biosynthesis Mol Biol 31: 62-68 Mavrodi DV, Ksenzenko VN, Bonsall RF, Cook RJ, Boronin AM, Thomashow LS (1998) A seven-gene locus for synthesis of phenazine-1-carboxylic acid by Pseudomonas fluorescens 2-79 J Bacteriol 180: 2541-8 Mussen E (1990) California crop pollination Gleanings in Bee Culture 118: 646647 Ogoshi A (1987) Ecology and phathogenicity of anastomosis and intraspecific groups of Rhizoctonia solani KUHN Annual Reviews of Phytopathology 25: 125-43 Pal'chykovs'ka LH, Aleksieieva IV, Kostina VH, Platonov MO, Nehruts'ka VV, Deriabin OM, Tarasov OA, Shved AD (2008) New amides of phenazine-1carboxylic acid: antimicrobial activity and structure-activity relationship Ukr Biokhim Zh 80: 140-7 Paul D, Sarma YR (2006) Antagonistic effects of metabolites of Pseudomonas fluorescens strains on the different growth phases of Phytophthora capsici, foot rot pathogen of black pepper (Piper nigrum L.) Arch Phytopathol Plant Protect 39: 1-6 Pimentel D, Acquay H, Biltonen M, Rice P, Silva M, Nelson J, Lipner V, Giordana S, Horowitz A, D’amore M (1993) Assessment of environmental and economic impacts of pesticide use In, pp 47-84 The Pesticide Question: Environment, Economics and Ethics, Chapman & Hall, New York Quan CS, Zheng W, Liu Q, Ohta Y, Fan SD (2006) Isolation and characterization of a novel Burkholderia cepacia with strong antifungal activity against Rhizoctonia solani Appl Microbiol Biotechnol 72: 1276–1284 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Rattanachuay P, Kantachote D, Tantirungkij M, Nitoda T, Kanzaki H (2010) Inhibition of shrimp pathogenic vibrios by extracellular compounds from a proteolytic bacterium Pseudomonas sp W3 Electronic Journal of Biotechnology 13 Richter ED (2002) Acute human pesticide poisonings In, pp 3-6 Encyclopedia of Pest Management, Dekker, New York Sandgren M, Guafetti PJ, Paech C, S P, Shaw A, L G, Saldajeno M, Berglund G, Jones T, Mitchinson C (2003) The Humicola grisea Cel12A enzyme structure at 1.2 A resolution and the impact of its free cysteine residues on thermal stability Protein Sci 12: 2782-2793 Seema D, Alam M, Kalani K, Khaliq A, Samad A, Srivastava SK, Patra DD (2012) Production, Purification, and Characterization of Antifungal Metabolite from Pseudomonas aeruginosa SD12, a New Strain Obtained from Tannery Waste Polluted Soil J Microbiol Biotechnol 22: 674–683 Segre A, Bachman RC, Ballio A, et al (1989) The structure of syringomycins A1, E, and G FEBS Lett 255: 27-31 Smirnov V, Kiprianova E (1990) Bacteria of Pseudomonas genus Naukova Dumka, Kiev Snyder WC, Hansen HN (1940) The species concept in Fusarium Amer J Bot 27: 64-67 Sorensen K, Kim K-H, Takemoto JY (1996) In vitro antifungal and fungicidal activities and erythrocyte toxicities of Pseudomonas syringae pv syringae Antimicrob Agents Chemother 40: 2710-2713 Stuart S (2003) Development of Resistance http://www.nd.edu/%01chem191/e2.html in Pest Populations In Thomashow LS, Weller DM (1988) Role of a phenazine antibiotic from Pseudomonas fluorescens 2-97 in biological control of Gaeumannomyces graminis var tritici J Bacteriol 170: 3499-3508 Upadhyay A, Srivastava S (2011) Phenazine-1-carboxylic acid is a more important contributor to biocontrol Fusarium oxysporum than pyrrolnitrin in Pseudomonas fluorescens strain Psd Microbiol Res Uzair B, Amed N, Mohammad FV, Ahmad VU (2008) Detection, isolation and partial characterization of antifungal compounds produced by Pseudomonas aeruginosa CMG1055 J Chem Soc Pak 30 Vander WC, Piérard A, Kley-Raymann M, Haas D (1984) Pseudomonas aeruginosa mutants affected in anaerobic growth on arginine: evidence for a four-gene cluster encoding the arginine deiminase pathway J Bacteriol 160: 928–34 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Vijayana KK, Bright Singhb IS, Jayaprakashb NS, Alavandic SV, Somnath Paib S, Preethab R, Rajanc JJS, Santiago TC (2006) A brackishwater isolate of Pseudomonas PS-102, a potential antagonistic bacterium against pathogenic vibrios in penaeid and non-penaeid rearing systems Aquaculture 251: 192200 Walker TS, Bais HP, Déziel E, Schweizer HP, Rahme LG, Fall R, Vivanco JM (2004) Pseudomonas aeruginosa-plant root interactions Pathogenicity, biofilm formation, and root exudation Plant Physiol 134: 320-331 Weller DM (1988) Biological Control of Soilborne Plant Pathogens in the Rhizosphere with Bacteria Annual Review of Phytopathology 26: 379-407 Yang ZJ, Wang W, Jin Y, Hu HB, Zhang XH, Xu YQ (2007) Isolation, identification, and degradation characteristics of phenazine-1-carboxylic acid-degrading strain Sphingomonas sp DP58 Curr Microbiol 55: 284-7 Zhou P, Zhao Y, Li J, Wu G, Zhang L, Liu Q, Fan S, Yang X, Li X, Wu Y (2011) Dietary exposure to persistent organochlorine pesticides in 2007 Chinese total diet study Environ Int Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn PHỤ LỤC 4.1 Trình tự nucleotid phân đoạn 16S rRNA chủng Pseudomonas sp ĐA3.1 CCAGCAGCCC CCGGTAATAC GAAGGGTGCA AGCGTTAATC GGAATTTCTG 51 GGGCGTAAAA GCGCGCGTAG GTGGTTCAGC AAGTTGGATG TTAAAATCCC 101 CGGGCTCAAC CTGGGGAATG CATCCCAAAA ACTACTGAGC TAGAGTTACG 151 GTAGAGGGTG GTGGGAATTT CCTGGTAGCG GGAAATGCGT AGATATAGGA 201 AGGAAACACC AGTGGCGAAG GCGACCACCT GGACTGATAC TGACACTGAG 251 GTGCGAAAGC GTGGGGAGCA AACAGGATTA GATACCCTGG TAGTCCACGC 301 CGTAAACGAT GTCGACTAGC CGTTGGGATC CTTGAAGATC TTAGTGGCGC 351 AGCTAACGCG ATAAGTCGAC CGCCTGGGGA GTACGGCCGC AAGGTTAAAA 401 CTCAAATGAA TTGACGGGGG CCCGCACAAG CGGTGGAGCA TGTGGTTTAA 451 TTGAAGCAAC GCGAAGAACC TTACCTGGCC TTGACATGCT GAGAACTTTC 501 CAGAGATGGA TTGGTGCCTT CGGGAACTCA GACACAGGTG CTGCATGGCT 551 GTCGTCAGCT CGTGTCGTGA GATGTTGGGT TAAGTCCCGT AACGAGCGCA 601 ACCCTTGTCC TTAGTTACCA GCACCTCGGG TGGGCACTCT AAGGAGACTG 651 CCGGTGACAA ACCGGAGGAA GGTGGGGATG ACGTCAAGTC ATCATGGCCC 701 TTACGGCCAG GGCTACACAC GTGCTACAAT GGTCGGTACA AAGGGTTGCC 751 AAGCCGCGAG GTGGAGCTAA TCCCATAAAA CCGATCGTAG TCCGGATCGC 801 AGTCTGCAAC TCGACTGCGT GAAGTCGGAA TCGCTAGTAA TCGTGAATCA 851 GAATGTCACG GTGAATACGT TCCCGGGCCT TGTACACACC GCCCGTCACA 901 CCATGGGAGT GGGTTGCTCC AGAAGTAGCT AGTCTAACCG CAAGGGGGAC 951 GGTTACCACG GAGTGATT 4.2 Khả ức chế nấm F oxysporum R solani dịch lọc từ chủng Pseudomonas sp ĐA3.1 nồng độ khác sau ngày nuôi cấy Nấm TN Mẫu TN (%) 10 20 50 F oxysporum d0 (cm) d1 (cm) 7,70 6,55 7,55 2,60 7,45 2,25 6,95 1,80 % ức chế 28 88 91 93 R solani d0 (cm) 8,25 8,20 8,30 8,30 d1 (cm) 5,85 1,65 1,00 0,00 % ức chế 50 96 99 100 4.3 Khả ức chế nấm F oxysporum R solani dịch lọc từ chủng Pseudomonas sp ĐA3.1 xử lý với nhiệt độ với thời gian khác sau ngày nuôi cấy Nấm TN T xử lý (phút) 10 30 F oxysporum d0 (cm) d1 (cm) 7,60 2,60 7,60 2,70 7,60 2,70 % ức chế 88 87 87 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên R solani d0 (cm) 8,20 8,20 8,20 d1 (cm) 1,50 1,50 1,30 % ức chế 97 97 97 http://www.lrc-tnu.edu.vn 60 90 7,60 7,60 2,75 2,80 87 86 8,20 8,20 1,35 1,60 97 96 4.4 Khả ức chế nấm F oxysporum R solani dịch lọc từ chủng P aeruginosa ĐA3.1 xử lý với pH khác sau ngày nuôi cấy Nấm TN pH xử lý ĐC 10 F oxysporum d0 (cm) d1 (cm) 7,4 2,81 4,10 1,60 6,00 2,10 6,20 2,00 5,40 1,80 % ức chế 86 85 88 90 89 R solani d0 (cm) 8,3 6,20 7,20 7,45 7,55 d1 (cm) 1,53 1,65 1,35 1,20 0,95 % ức chế 97 93 96 97 98 4.5 Khả ức chế nấm F oxysporum R solani dịch lọc từ chủng P aeruginosa ĐA3.1 xử lý proteinase K với nồng độ khác sau ngày nuôi cấy Nấm TN Proteinase K (μg/ml) 0,1 0,5 F oxysporum d0 (cm) d1 (cm) 7,4 2,81 7,5 2,81 7,5 2,83 % ức chế 86 86 86 R solani d0 (cm) 8,3 8,3 8,3 d1 (cm) 1,53 1,48 1,30 % ức chế 97 97 97 4.6 Khả ức chế nấm F oxysporum R solani PCA từ chủng Pseudomonas sp ĐA3.1 xử lý nhiệt độ thời gian khác sau ngày nuôi cấy Nấm TN T xử lý (phút) 10 30 60 90 F oxysporum d0 (cm) d1 (cm) 8,00 5,20 8,00 5,40 8,00 5,40 8,00 5,60 8,00 5,80 R solani d0 (cm) 8,40 8,40 8,40 8,40 8,40 % ức chế 58 54 54 51 47 d1 (cm) 3,40 4,20 4,50 4,80 5,00 % ức chế 84 75 71 67 65 4.7 Khả ức chế nấm F oxysporum R solani PCA từ chủng Pseudomonas sp ĐA3.1 xử lý pH khác sau ngày nuôi cấy Nấm TN pH xử lý ĐC 10 F oxysporum d0 (cm) d1 (cm) 8,00 5,20 7,80 5,30 8,00 5,40 8,00 5,50 8,00 5,60 % ức chế 57 54 54 53 51 R solani d0 (cm) 8,40 8,40 8,40 8,40 8,40 d1 (cm) 3,90 3,80 4,10 3,90 4,40 % ức chế 78 80 76 78 73 4.8 Khả ức chế nấm F oxysporum R solani PCA từ chủng Pseudomonas sp ĐA3.1 xử lý proteinase K với nồng độ khác sau ngày nuôi cấy Nấm TN Proteinase K (μg/ml) 0,1 F oxysporum d0 (cm) d1 (cm) 8,00 5,30 8,00 5,50 % ức chế 56 53 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên R solani d0 (cm) d1 (cm) 8,40 3,90 8,40 4,20 % ức chế 78 75 http://www.lrc-tnu.edu.vn 0,5 1,0 8,00 8,00 5,50 5,40 53 54 8,40 8,40 4,20 3,80 75 80 4.9 Khả ức chế nấm F oxysporum R solani PCA từ chủng Pseudomonas sp ĐA3.1 nồng độ khác sau ngày nuôi cấy Nấm TN [PCA] (μg/ml) 30 40 50 60 70 80 F oxysporum d0 (cm) d1 (cm) 8,40 4,50 8,40 3,00 8,20 1,80 8,20 1,70 8,20 1,60 8,20 1,40 % ức chế 71 87 95 96 96 97 R solani d0 (cm) 8,40 8,40 8,20 8,20 8,20 8,20 d1 (cm) 4,10 3,20 1,30 1,20 1,00 0,00 % ức chế 76 85 97 98 99 100 4.10 Phổ HMBC, HSQC, DEPT, COY hoạt chất PCA tinh từ chủng Pseudomonas sp ĐA3.1 v A B Hình 4.1 Phổ HMBC (A) phổ HSQC (B) hoạt chất ức chế nấm tinh từ chủng Pseudomonas sp ĐA3.1 A B Hình 4.2 Phổ DEPT-13CCPD (A) COYGP (B) hoạt chất ức chế nấm tinh từ chủng Pseudomonas sp ĐA3.1 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ... δ = 8 ,30 ppm Phổ 13 C-NMR (CDC 13 , 500MHz), δ (ppm): 12 4.9 (C -1) ; 13 7 .3 (C-2); 13 0 .2 (C -3) ; 13 5 .0 (C-4); 1 43. 3 (C-4a); 14 4.0 (C-5a); 12 7.9 (C-6); 13 1 .7 (C-7); 13 3 .2 (C-8); 13 0 .0 (C-9); 13 9 .7 (C-9a);... 1. 5 Hz) 13 0 .2 8. 01 dd (9.0 and 7.0 Hz) 13 5 .0 8.49 dd (9.0 and 1. 5 Hz) 4a 1 43. 3 5a 14 4.0 12 7.9 8.24 m 13 1 .7 7.98 m 13 3 .2 7.96 m 13 0 .0 8 .30 m 9a 13 9 .7 10 a 13 9 .9 COOH 16 5.8 15 . 41 s (s: singlet;.. .VI? ??N KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VI? ??T NAM VI? ??N SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT - LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG VI KHUẨN Pseudomonas SP ĐA3 .1 TRONG KIỂM SOÁT NẤM HẠI CÂY TRỒNG