Nghiên cứu xây dựng qui trình tạo sinh khối thông qua hệ thống nuôi cấy rễ tơ của cây bá bệnh eurycoma longifolia

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT - - HOÀNG HÀ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TẠO SINH KHỐI THƠNG QUA HỆ THỐNG NI CẤY RỄ TƠ CỦA CÂY BÁ BỆNH (Eurycoma longifolia) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2012 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT - - LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TẠO SINH KHỐI THÔNG QUA HỆ THỐNG NUÔI CẤY RỄ TƠ CỦA CÂY BÁ BỆNH (Eurycoma longifolia) Chuyên ngành: Mã số: Sinh học thực nghiệm 624230 Học viên: Hƣớng dẫn khoa học: Hoàng Hà PGS TS Chu Hoàng Hà Hà Nội - 2012 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến người hướng dẫn, giúp đỡ tận tình để tơi hồn thành luận văn này: Người thầy tơi, PGS TS Chu Hồng Hà, Phó Viện trưởng Viện cơng nghệ sinh học, trưởng phịng Cơng nghệ Tế bào Thực vật - Viện Cơng nghệ Sinh học, hướng dẫn hỗ trợ tận tình, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu suốt trình thực đề tài GS TS Lê Trần Bình, TS Lê Văn Sơn, TS Phạm Bích Ngọc, CN Nguyễn Đình Trọng cán phịng Cơng nghệ Tế bào Thực vật bảo tận tình chun mơn, ln theo sát thí nghiệm tơi để có lời khun bổ ích kịp thời Trong năm học tập nghiên cứu phòng Công nghệ tế bào thực vật, nhận nhiều quan tâm giúp đỡ, động viên chân thành tập thể cán phòng Các thực tập sinh ln thân thiện, nhiệt tình, tạo nên mơi trường nghiên cứu chủ động, hăng say Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến phòng Tổng hợp hữu Viện Hóa học - Viện Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, phịng Sắc ký khối phổ phân giải cao khoa Hóa học - Đại học Khoa học tự nhiên tạo điều kiện cho hồn thành đề tài Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đến thầy cô giáo sở viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật truyền đạt cho kiến thức quý báu thời gian học tập vừa qua Bằng tình cảm chân thành, tơi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình bạn bè bên, động viên, giúp đỡ suốt thời gian thực luận văn Hà Nội, tháng năm 2012 Học viên Hoàng Hà Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn NHỮNG KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT API Atmospheric Pressure Ionization Bp Base pairs CTAB Cetyl trimethylammonium bromide COI Cytochrome c oxidase subunit I dNTP 2‟- deoxyribonucleoside - 5‟triphosphate EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid ITS Internal Transcribed Spacer Kb Kilobase MS Mass Spectrometry MS Murashige and Skoog WPM Woody Plant Medium Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY BÁ BỆNH .4 1.1.1 Giới thiệu phân bố địa lý 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Hình thái 1.1.4 Tác dụng dƣợc lý bá bệnh 1.1.5 Tính cấp thiết nghiên cứu, bảo tồn sản xuất bền vững bá bệnh 1.2 NUÔI CẤY SINH KHỐI RỄ TƠ - GIẢI PHÁP TẠO NGUỒN DƢỢC PHẨM SẠCH PHỤC VỤ SỨC KHỎE CỘNG ĐỒNG .6 1.2.1 Giới thiệu nuôi cấy sinh khối tế bào 1.2.2 Giới thiệu Agrobacterium rhizogenes - phƣơng pháp tạo rễ tơ tế bào thực vật 1.2.3 Cơ chế chuyển gen vùng T-DNA vào tế bào thực vật 1.2.4 Nuôi cấy sinh khối rễ tơ .10 1.3 CÁC NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CHỈ THỊ DNA VÀO VIỆC ĐỊNH DANH LOÀI 13 1.4 PHƢƠNG PHÁP KHỐI PHỔ (MASS SPECTROMETRY-MS) 15 Chương 2: VẬT LIỆU - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .18 2.1 VẬT LIỆU .18 2.2 DỤNG CỤ - HÓA CHẤT .18 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.3.1 Thu thập định danh loài thị phân tử 18 2.3.2 Phƣơng pháp khử trùng hạt đƣa mẫu vào nuôi cấy in vitro .19 2.3.3 Phƣơng pháp chuyển gen thông qua Agrobacterium rhizogenes 20 2.3.4 Đánh giá dịng rễ tơ chuyển gen phịng thí nghiệm 20 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 3.1 THU THẬP VÀ ĐỊNH DANH LOÀI BÁ BỆNH BẰNG CHỈ THỊ DNA 26 3.1.1 Thu thập mẫu 26 3.1.2 Định danh loài thị DNA 27 3.2 KẾT QUẢ KHỬ TRÙNG HẠT VÀ ĐƢA CÁC MẪU BÁ BỆNH VÀO NUÔI CẤY IN VITRO LÀM NGUYÊN LIỆU CHO NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO VÀ CHUYỂN GEN TẠO RỄ TƠ 31 3.3 TỐI ƢU HÓA QUY TRÌNH CHUYỂN GEN VÀ TIẾN HÀNH CHUYỂN GEN TẠO RỄ TƠ THÔNG QUA Agrobacterium rhizogenes 33 3.3.1 Tối ƣu hóa quy trình chuyển gen thơng qua A rhizogenes 33 3.3.2 Kết chuyển gen tạo rễ tơ thông qua vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 35 3.3.3 Kết thử nghiệm môi trƣờng nuôi cấy rễ tơ bá bệnh 37 3.3.4 Các hình thái rễ tơ bá bệnh 39 3.3.5 Kiểm tra dòng rễ tơ chuyển gen 40 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.3.6 Kết nuôi sinh khối rễ tơ bá bệnh môi trƣờng WPM lỏng 42 3.4 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP CĨ TRONG DỊNG RỄ TƠ BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ BẢN MỎNG VÀ KHỐI PHỔ KẾ 42 3.4.1 Kết sắc ký mỏng 42 3.4.2 Kết phân tích hợp chất tự nhiên rễ bá bệnh 43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn Thạc sỹ Hoàng Hà MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Cây bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack) hay Tongkat Ali thảo dƣợc phân bố chủ yếu khu vực Đông Nam Á Cây Bá bệnh thuốc quý với khả trị bách bệnh, đƣợc tìm thấy Việt Nam Vƣờn quốc gia Bái Tử Long từ năm 2000, mọc tự nhiên hầu hết diện tích đất rừng Trên giới, từ lâu đƣợc biết đến nhƣ nhân sâm Malaysia, nhƣ nhiều nƣớc Đông Nam Á nhƣ Indonesia, Brunei, Thái lan, Cămpuchia, Lào… với tác dụng giúp nam giới tăng cƣờng chức sinh lý sức khoẻ tình dục Các phận đƣợc sử dụng nhiều thuốc truyền thống chữa bệnh sốt rét, bệnh tiểu đƣờng, kháng lại bệnh vi sinh vật tăng cƣờng chức sinh lý sức khoẻ tình dục, bổ sung lƣợng cho thể, giúp giảm stress, mệt mỏi, tăng cƣờng miễn dịch, ngăn ngừa khối u phòng chống lão hố Các hợp chất có hoạt tính sinh học đƣợc tìm thấy từ phận khác nhƣ eurycomaoside, eurycolactone, eurycomalactone, eurycomanone, pasakbumin-B, với alkaloid quassinoid Cây Bá bệnh đƣợc sản xuất sử dụng dƣới dạng thực phẩm chức nhiều nƣớc châu Á, Tây Âu Hoa Kỳ Ở Việt Nam, kết nghiên cứu ban đầu nhà khoa học trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội vào năm 2006 cho thấy bá bệnh Việt Nam có tác dụng khơng thua nƣớc khu vực Hiện nay, giá trị y dƣợc quý Bá bệnh đƣợc nhiều ngƣời biết đến; cần quản lý sử dụng phƣơng pháp khoa học để khai thác bền vững nguồn tài nguyên Trƣớc tình hình trên, bên cạnh việc nghiên cứu giá trị Bá Bệnh Việt Nam, phân tích tác dụng dƣợc lý để đƣa hƣớng dẫn chiết xuất, sử dụng phù hợp với sức khoẻ cộng đồng, cần sớm nghiên cứu áp dụng nuôi cấy sinh khối tế bào thực vật tạo nguồn nguyên liệu ổn định, đáp ứng nhu cầu làm thuốc Những năm gần đây, với xu hƣớng chung giới, nƣớc ta hƣớng nghiên cứu công nghệ sinh khối tế bào thực vật để sản xuất sản phẩm thứ cấp bắt đầu đƣợc quan tâm đầu tƣ phát triển Tuy nhiên trình ni cấy tạo sinh khối tế bào thực vật nhằm làm giảm tính biệt hóa mơ tế bào Luận văn Thạc sỹ Hồng Hà ni cấy cần bổ sung chất điều hịa sinh trƣởng vào môi trƣờng nuôi cấy Vấn đề trở ngại lớn tồn dƣ chất điều hòa sinh trƣởng sinh khối tế bào nuôi cấy ảnh hƣởng trực tiếp đến sản phẩm sức khỏe ngƣời sử dụng Việc hoàn tồn khắc phục ni cấy sinh khối từ rễ tơ Rễ tơ bệnh thực vật đƣợc gây trình tƣơng tác vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes tế bào vật chủ Rễ tơ có khả sinh trƣởng nhanh, phát triển tốt môi trƣờng không cần bổ sung chất điều hịa sinh trƣởng ni cấy tạo sinh khối liên tục điều có ý nghĩa dây chuyền sản xuất hợp chất thứ cấp hay dƣợc phẩm sinh học tái tổ hợp Rễ tơ sản xuất lƣợng lớn hợp chất thứ cấp quan biệt hóa nên rễ tơ có di truyền ổn định ni cấy tế bào huyền phù mô sẹo Xuất phát từ ƣu điểm hợp chất dƣợc lý quý Bá bệnh chủ yếu thu đƣợc từ rễ, thực đề tài: “Nghiên cứu xây dựng qui trình tạo sinh khối thơng qua hệ thống ni cấy rễ tơ bá bệnh (Eurycoma longifolia)” Công trình đƣợc thực phịng Cơng nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học Cơng nghệ Việt Nam Mục đích nghiên cứu Mục tiêu tổng quát: Nghiên cứu sở khoa học thực nghiệm việc tạo sinh khối bá bệnh làm nguyên liệu dƣợc thực phẩm chức công nghệ nuôi cấy rễ tơ Mục tiêu cụ thể: - Thu thập đƣợc mẫu Bá Bệnh làm nguyên liệu cho nuôi cấy mô tế bào chuyển gen tạo rễ tơ - Tối ƣu hóa đƣợc quy trình chuyển gen thơng qua Agrobacterium rhizogenes tạo đƣợc dòng rễ tơ - Đánh giá điều kiện ni cấy chọn lọc đƣợc số dịng rễ tơ có khả sinh trƣởng nhanh để ni cấy tạo sinh khối - Bƣớc đầu đánh giá hàm lƣợng hoạt chất sản phẩm nuôi cấy thu đƣợc so với dƣợc liệu tự nhiên Nội dung nghiên cứu - Thu thập định danh mẫu bá bệnh thị phân tử - Đƣa mẫu bá bệnh vào nuôi cấy in vitro Luận văn Thạc sỹ Hồng Hà - Nghiên cứu tối ƣu quy trình chuyển gen sử dụng Agrobacterium rhizogenes, tạo rễ tơ bá bệnh xác định điều kiện mơi trƣờng thích hợp cho sinh trƣởng - Đánh giá sơ hàm lƣợng hoạt chất sản phẩm nuôi cấy thu đƣợc so với dƣợc liệu tự nhiên Ý nghĩa khoa học Làm sở cho việc sản xuất quy mô công nghiệp sinh khối rễ tơ bá bệnh cho mục đích làm nguyên liệu dƣợc thực phẩm chức Luận văn Thạc sỹ Hoàng Hà CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan bá bệnh 1.1.1 Giới thiệu phân bố địa lý Cây bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack) hay Tongkat Ali thảo dƣợc phân bố chủ yếu khu vực Đông Nam Á Bá bệnh thuốc đƣợc sử dụng dân gian từ lâu, cịn đƣợc gọi với tên khác là: mật nhân, hay bách bệnh Tại Việt Nam bá bệnh có mặt vƣờn quốc gia Bái Tử Long, khu Bảo tồn thiên nhiên Đồng Sơn- Kỳ Thƣợng, Hoành Bồ, Quảng Ninh, số rừng Tây Nguyên Cây Bá bệnh từ lâu đƣợc biết đến nhƣ nhân sâm Malaysia, nhƣ nhiều nƣớc Đông Nam Á nhƣ Indonesia, Brunei, Thái lan, Cămpuchia, Lào… với tác dụng giúp Nam giới tăng cƣờng chức sinh lý sức khoẻ tình dục Các phận đƣợc sử dụng nhiều thuốc truyền thống chữa bệnh sốt rét, bệnh tiểu đƣờng, kháng lại bệnh vi sinh vật [21] tăng cƣờng chức sinh lý sức khoẻ tình dục, bổ sung lƣợng cho thể, giúp giảm stress, mệt mỏi, tăng cƣờng miễn dịch, ngăn ngừa khối u phịng chống lão hóa 1.1.2 Phân loại Giới: Plantae Ngành: Magnoliophyta Lớp: Magnoliopsida Bộ: Sapindales Họ: Simaroubaceae Chi: Eurycoma Lồi: E longifolia Hình Cây Bá bệnh Tên hai phần: Eurycoma longifolia Jack Luận văn Thạc sỹ Hoàng Hà Tiếp tục tối ƣu qui trình tạo rễ tơ với mục đích thu đƣợc sinh khối lớn dƣợc tính cao Ứng dụng cơng nghệ tạo sinh khối thông qua nuôi cấy với thuốc Đây hƣớng tiềm có giá trị ứng dụng cao sản xuất dƣợc liệu Việt Nam TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Bộ Y tế (1996) "Ðịnh hƣớng chiến lƣợc công tác chăm sóc bảo vệ sức khoẻ nhân dân đến năm 2000 2020" Tạp chí Dƣợc học 8(2) Nguyễn Ánh Hồng (2000), Cơ sở Khoa học Công nghệ chuyển gen thực vật, NXB Nông nghiệp Hà Nội Phạm Gia Huệ, Mass Spectrometry & LC-MS, giảng khối phổ Nguyễn Văn Minh cs (2010) Báo cáo tổng kết đề tài: “Hợp tác nghiên cứu xây dựng quy trình tạo khối tế bào sâm Ngọc Linh làm nguyên liệu sản xuất chế phẩm phục vụ sức khỏe cộng đồng” Học Viện Quân Y Trần Công Luận (2010) “Công nghệ sinh học thực vật với tài nguyên thuốc” Kỷ yếu hội thảo quốc tế tháng 4/2010 Nguyễn Đức Thành (2003), Chuyển gen thực vật, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Tài liệu tiếng Anh Ang, H H and H S Cheang (1999) "Studies on the anxiolytic activity of Eurycoma longifolia Jack roots in mice" Jpn J Pharmacol 79(4): 497-500 Ang, H H., H S Cheang, et al (2000) "Effects of Eurycoma longifolia Jack (Tongkat Ali) on the initiation of sexual performance of inexperienced castrated male rats" Exp Anim 49(1): 35-38 Ang, H H., K L Chan, et al (1995) "In vitro antimalarial activity of quassinoids from Eurycoma longifolia against Malaysian chloroquine-resistant Plasmodium falciparum isolates" Planta Med 61(2): 177-178 46 Luận văn Thạc sỹ Hoàng Hà 10 Ang, H H., S Ikeda, et al (2001) "Evaluation of the potency activity of aphrodisiac in Eurycoma longifolia Jack" Phytother Res 15(5): 435-436 11 Asada, Y., H Saito, et al (1993) "Biotransformation of 18 beta-glycyrrhetinic acid by ginseng hairy root culture" Phytochemistry 34(4): 1049-1052 12 Bhat, R and A A Karim (2010) "Tongkat Ali (Eurycoma longifolia Jack): A review on its ethnobotany and pharmacological importance" Fitoterapia 13 Britton, M T., M A Escobar, et al (2008) “The oncogenes of Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes” Agrobacterium: From Biology to Biotechnology T Tzfira and V Citovsky New York Springer: 524-565 14 Cardarelli, M., L Spanò, et al (1987) "The role of auxin in hairy root induction" Mol Gen Genet 208(3): 457-463 15 Chan, K L., C Y Choo, et al (2004) "Antiplasmodial studies of Eurycoma longifolia Jack using the lactate dehydrogenase assay of Plasmodium falciparum" J Ethnopharmacol 92(2-3): 223-227 16 Chawla HS (2003) Introduction plant biotechnology Amazone Press 17 Chilton, M D., D A Tepfer, et al (1982) "Agrobacterium rhizogenes inserts T-DNA into the genomes of the host plant root cells" Nature 295: 432-434 18 Christey, M C (2001) "Use of Ri-mediated transformation for production of transgenic plants" In Vitro Cell Dev Biol-Plant 37: 687-700 19 Dodds JH, Roberts LW (1995) Experiments in Plant Tissue Culture, Cambridge University Press - England 20 Duc, N M., R Kasai, et al (1994) "Saponins from Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis Ha et Grushv collected in central Vietnam III" Chem Pharm Bull (Tokyo) 42(3): 634-640 21 Farouk, A E and A Benafri (2007) "Antibacterial activity of Eurycoma longifolia Jack A Malaysian medicinal plant" Saudi Med J 28(9): 1422-1424 22 H T Dung I V Grushvitsky, Tạp chí Thực vật, 4, 518 (1985) 23 Jeong, G T., D H Park, et al (2002) "Studies on mass production of transformed Panax ginseng hairy roots in bioreactor" Appl Biochem Biotechnol 98-100: 1115-1127 24 Jeong, G T., D H Park, et al (2005) "Production of antioxidant compounds by culture of Panax ginseng C.A Meyer hairy roots: I Enhanced production of secondary metabolite in hairy root cultures by elicitation" Appl Biochem Biotechnol 121-124: 1147-1157 47 Luận văn Thạc sỹ Hoàng Hà 25 Kardono, L B., C K Angerhofer, et al (1991) "Cytotoxic and antimalarial constituents of the roots of Eurycoma longifolia" J Nat Prod 54(5): 1360-1367 26 Kawaguchi, K., M Hirotani, et al (1990) "Biotransformation of digitoxigenin by ginseng hairy root cultures" Phytochemistry 29(3): 837-843 27 Kuo, P C., A G Damu, et al (2004) "Cytotoxic and antimalarial constituents from the roots of Eurycoma longifolia" Bioorg Med Chem 12(3): 537-544 28 Kurata, H., T Achioku, et al (1998) "Intermittent light irradiation with a second-scale interval enhances caffeine production by coffea arabica cells" Biotechnol Prog 14(5): 797-799 29 Liu J., J Y Ding, et al (2004) "Studies on influence of fungal elicitor on hairy root of Panax ginseng biosynthesis ginseng saponin and biomass" China journal of chinese materia medica 29(4): 302-305 30 Maziah, M and N Rosli (2009) "The Production of 9-methoxycanthin-6-one from Callus Cultures of (Eurycoma longifolia Jack) Tongkat Ali" Methods Mol Biol 547: 359-369 31 Muller, M J and M H Zenk (1992) "The Norcoclaurine Pathway is Operative in Berberine Biosynthesis in Coptis japonica" Planta Med 58(6): 524-527 32 N M Duc, N T Nham, R Kasai, A Ito, K Yamasaki and O Tanaka, Chem Pharm Bull., 41, 2010 (1993) 33 N M Duc, R Kasai, K Ohtani, A Ito, N T Nham, K Yamasaki and O Tanaka, Chem Pharm.Bull., 42, 115 (1994) 34 N M Duc, R Kasai, K Ohtani, A Ito, N T Nham, K Yamasaki and O Tanaka,Chem Pharm Bull., 42, 634 (1994) 35 N M Duc, R Kasai, K Ohtani, A Ito, N T Nham, K Yamasaki and O Tanaka (1996) "New saponins from Vietnamese ginseng: Highlights on biogenesis of dammarane triterpenoids" Advances in Experimental Medicine and Biology 404: 129-149, ed by G R Waller and K Yamasaki, Plenum Press, New York and London 36 N M Duc, R Kasai, N T Nham, K Yamasaki and O Tanaka (1997) "Saponin composition of Vietnamese ginseng and its significance from pharmacognostical points of view", Proceedings of "The First Indochina Conference on Pharmaceutical Sciences: Pharmacy in Harmony", May 20-23, 1997, Bangkok, Thailand 48 Luận văn Thạc sỹ Hoàng Hà 37 N T Nham, P V De, T C Luan, N M Duc, S Shibata, O Tanaka and R Kasai (1995) “Pharmacognostical and chemical studies on Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis Ha et Grushv (Araliaceae)” J Jpn Bot 70(1) 38 Nguyen, M D., T N Nguyen, et al (1993) "Saponins from Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis Ha et Grushv Collected in central Vietnam I" Chem Pharm Bull (Tokyo) 41(11): 2010-2014 39 Nurhanan, M Y., L P Azimahtol Hawariah, et al (2005) "Cytotoxic effects of the root extracts of Eurycoma longifolia Jack" Phytother Res 19(11): 994-996 40 Osman, A., B Jordan, et al (2003) "Genetic diversity of Eurycoma longifolia inferred from single nucleotide polymorphisms" Plant Physiol 131(3): 12941301 41 Palazon, J., A Mallol, et al (2003) "Growth and ginsenoside production in hairy root cultures of Panax ginseng using a novel bioreactor" Planta Med 69(4): 344-349 42 Palazón, J., R M Cusidó, et al (1997) "Effect of rol genes from Agrobacterium rhizogenes TL-DNA on nicotine production in tobacco root cultures" Plant Physiol Biochem 35: 155-162 43 Pham NB (2009) Production and secretion of recombinant sweet-tasting thaumatin from suspension cells and hairy roots of Nicotiana tabacum University of Heidelberg PhD Thesis 44 Kress W J., Erickson D L (2008) “DNA barcodes: Genes, genomics, and bioinformatics” Proc Natl Acad Sci USA 105(8): 2761-2762 45 Lee Suan Chua, Nor Amaiza Mohd Amin, Jason Chun Hong Neo, Ting Hun Lee, Chew Tin Lee, Mohamad Roji Sarmidi, Ramlan Abdul Aziz (2011) “LC–MS/MS-based metabolites of Eurycoma longifolia (Tongkat Ali) in Malaysia (Perak and Pahang)” Journal of Chromatography B 879: 3909-3919 46 Sevon, N and K M Oksman-Caldentey (2002) "Agrobacterium rhizogenesmediated transformation: root cultures as a source of alkaloids" Planta Med 68(10): 859-868 47 Van DeWiel C C M., Van Der Schoot J., Van Valkenburg J L., Duistermaat C H., Smulders (2009) “DNA barcoding discriminates the noxious invasive plant species, floating pennywort (Hydrocotyle ranunculoides L.f.), from non-invasive relatives” Molecular Ecology Resources 9:1086-1091 49 Luận văn Thạc sỹ Hoàng Hà 48 Woo, S S., J S Song, et al (2004) "Selection of high ginsenoside producing ginseng hairy root lines using targeted metabolic analysis" Phytochemistry 65(20): 2751-2761 49 Yoshikawa, T., Y Asada, et al (1993) "Continuous production of glycosides by a bioreactor using ginseng hairy root culture" Appl Microbiol Biotechnol 39(4): 460-464 50 Zhao, M Q., J Y Ding, et al (2001) "Studies on the arbutin biosynthesis by hairy root of Panax ginseng C.A Mayer" China journal of chinese materia medica 26(12): 819-822 50 Luận văn Thạc sỹ Hoàng Hà 51 Luận văn Thạc sỹ Hoàng Hà PHỤ LỤC Phụ lục Đồ thị phân tích khối phổ hợp chất thứ cấp bá bệnh Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn Thạc sỹ Hoàng Hà Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn Thạc sỹ Hoàng Hà Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn Thạc sỹ Hoàng Hà Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Ngun http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn Thạc sỹ Hồng Hà Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn Thạc sỹ Hoàng Hà Phụ lục Thành phần môi trƣờng Môi trƣờng YMP đặc YMP lỏng WPM đặc WPM lỏng Thành phần 0,4 g/l Yeast extract + 0,5 g/l K2HPO4.3H2O + 10 g/l mannitol + g/l MgSO4.7H2O + 0,1 g/l NaCl + 15 g/l bacto agar, pH = 0,4 g/l Yeast extract + 0,5 g/l K2HPO4.3H2O + 10 g/l mannitol + g/l MgSO4.7H2O + 0,1 g/l NaCl, pH = WPM I + WPM II + WPM III + WPM IV + WPM V + 30 g đƣờng + g thạch, pH = 5,8 WPM I + WPM II + WPM III + WPM IV + WPM V + 30 g đƣờng + g thạch, pH = 5,8 MS đặc MS I + MS II + MS III + MS IV + MS V + 30 g đƣờng + g thạch, pH = 5,8 MS lỏng MS I + MS II + MS III + MS IV + MS V + 30 g đƣờng, pH = 5,8 ½ MS MG MS I + MS II + MS III + MS IV + MS V, pH = 5,8 MS I + MS II + MS III + MS IV + MS V + 0,5mg/L GA3 + 30 g đƣờng + g thạch, pH = 5,8 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn Thạc sỹ Hồng Hà Mơi trƣờng WPM_ Woody Plant Medium Muối khoáng Nồng độ Đa lƣợng mg/l Vi lƣợng mg/l Amonium nitrate (NH4NO3) 400 Boric Acid (H3BO3) 6.2 Calcium nitrate 556 Zinc sulfate 8.6 (Ca(NO3)2.4H2O) Calcium chloride Nồng độ (ZnSO4.7H2O) 96 Na2EDTA.2H2O 37.2 370 Cupric Sulfate 0.25 (CaCl2 2H2O) Magnesium sulfate (MgSO4.7H2O) Potassium sulfate (CuSO4.5H2O) 990 sulfate 27.8 (FeSO4.7H2O) (K2SO4) Potassium phospate Ferrous 170 Manganesesulfate 22.3 (MnSO4.4H2O) (KH2PO4) Sodium molybdate 0.25 (Na2MoO4.2H2O) Các chất hữu Myo-inositol 100 mg/l Nicotinic acid 0.5 mg/l PyridoxineHCl 0.5 mg/l Thiamine HCl 1.0 mg/l Glycine 2.0 mg/l Agar 6.0 g/l Sucrose 20 g/l Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn Thạc sỹ Hoàng Hà Thành phần mơi trƣờng MS_Murashige & Skoog Muối khống Nồng độ Nồng độ Đa lượng (mg/l) Vi lượng Potasium nitrate (KNO3) 1,900 Manganese sulfate 22.3 (mg/l) (MnSO4 4H2O) Amonium nitrate (NH4NO3) 1,650 Boric Acid 6.2 (H3BO3) Calcium chloride 440 (CaCl2.H2O) Magnesium sulfate 0.025 (CoCl2.6H2O) 370 (MgSO4.7H2O) Potassium phosphate Colbalt chloride Cupric Sulfate 0.025 (CuSO4.5H2O) 170 (KH2PO4) Ferrous sulfate 27.8 (FeSO4.7H2O) Potassium Iodine (KI) 0.83 Sodium molybdate (Na2MoO4.2H2O) 0.25 Zinc Sulfate (ZnSO4.7H2O) 8.6 Na2EDTA.2H2O 37.2 Các chất hữu Myo-inositol 100 mg/l Nicotinic aAcid 0.5 mg/l Pyridoxine HCl 0.5 mg/l Thiamine HCl 0.1 mg/l IAA 1-30 mg/l Kinetin 0.04-10 Glycine (recrytallized) 2.0 g/l Edamine 1.0 g/l Sucrose 20 g/l Agar 10 g/l Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Luận văn Thạc sỹ Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Hoàng Hà http://www.lrc-tnu.edu.vn ... định nuôi cấy tế bào huyền phù mô sẹo Xuất phát từ ƣu điểm hợp chất dƣợc lý quý Bá bệnh chủ yếu thu đƣợc từ rễ, thực đề tài: ? ?Nghiên cứu xây dựng qui trình tạo sinh khối thông qua hệ thống nuôi cấy. .. chuyển ni cấy rễ tơ Sau tuần ni cấy bình trụ, rễ tơ bá bệnh phát triển mạnh Hình 18 Ni cấy rễ tơ bình trụ Kết ban đầu nhận thấy hệ thống rễ tơ phát triển mạnh sinh khối bình trụ Các dịng rễ nuôi. .. trƣờng Đã có nhiều nghiên cứu thành công tạo hoạt chất từ ni cấy sinh khối rễ tơ [3, 4] Hình ảnh số rễ tơ đƣợc nuôi cấy mơi trƣờng lỏng mơi trƣờng đặc: Hình Các hệ rễ tơ đƣợc nuôi Rễ tơ Beta vulgaris