Ảnh hưởng của môi trường nuôi thành thục và nồng độ tinh tới khả năng hình thành tiền nhân và sự phát triển của phôi lợn thụ tinh ống nghiệm

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT - NGUYỄN THỊ HIỆP ẢNH HƢỞNG CỦA MÔI TRƢỜNG NUÔI THÀNH THỤC VÀ NỒNG ĐỘ TINH TỚI KHẢ NĂNG HÌNH THÀNH TIỀN NHÂN VÀ SỰ PHÁT TRIỂN CỦA PHÔI LỢN THU TINH ỐNG NGHIỆM Chuyên ngành: Động vật học Hà Nội - 2014 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi thực hiện, số liệu luận văn trung thực xác Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn đƣợc cảm ơn đầy đủ, thơng tin trích dẫn luận văn đƣợc rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 11 tháng 11 năm 2014 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Hiệp Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN! Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành sâu sắc tới TS Nguyễn Việt Linh, chủ nhiệm đề tài, ngƣời thầy tận tình hƣớng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc tới TS Bùi Xuân Nguyên, TS Nguyễn Thị Ƣớc, ngƣời thầy tận tình dạy bảo, hƣớng dẫn tơi cơng việc chun môn nhƣ kinh nghiệm sống Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành tới tập thể cán nghiên cứu Phịng Cơng nghệ Phơi đặc biệt TS Nguyễn Văn Hạnh, Ths Nguyễn Thị Hồng, Ths Nguyễn Thị Nhung, CN Nguyễn Văn Lâm nhiệt tình giúp đỡ, ủng hộ góp ý để tơi hoàn thành luận văn Luận văn đƣợc hoàn thành với tài trợ Quỹ Phát triển khoa học công nghệ quốc gia khuôn khổ đề tài “Nghiên cứu ảnh hƣởng giọt noãn bào chất đơn tính lên hoạt hóa trứng phát triển phôi” mã số 106.12-2012.93 TS Nguyễn Việt Linh chủ nhiệm Tôi xin cảm ơn Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật tạo điều kiện thủ tục hành để tơi bảo vệ luận văn Cuối xin gửi lời cám ơn tới gia đình, bạn bè, ngƣời ln sát cánh, ủng hộ tơi suốt q trình học tập thực luận văn Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 11 tháng 11 năm 2014 Học viên Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn Nguyễn Thị Hiệp MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG .v DANH MỤC HÌNH …vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT viii PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích 1.3 Ý nghĩa PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sự hình thành phát triển tế bào trứng lợn 2.1.1 Sự hình thành phát triển nang trứng 2.1.2 Sự hình thành phát triển tế bào trứng 2.1.3 Sự thành thục tế bào trứng 2.2 Thụ tinh ống nghiệm lợn 10 2.2.1 Nguyên lý thụ tinh ống nghiệm giai đoạn trình thụ tinh 10 2.2.2 Sự thành thục tế bào trứng lợn ống nghiệm 13 2.2.3 Các yếu tố ảnh hƣởng tới kết thụ tinh ống nghiệm lợn 20 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 2.3 Tình hình nghiên cứu nuôi thành thục, thụ tinh ống nghiệm (IVM/IVF) Việt Nam 26 PHẦN III ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 3.1 Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu 29 3.2 Địa điểm thời gian tiến hành nghiên cứu 29 3.3 Nội dung nghiên cứu tiêu theo dõi 29 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 32 3.4.1 Chuẩn bị môi trƣờng thu rửa buồng trứng 32 3.4.2 Phƣơng pháp thu, bảo quản vận chuyển buồng trứng 33 3.4.4 Phƣơng pháp phân loại chất lƣợng trứng 35 3.4.5 Phƣơng pháp đánh giá thành thục sau nuôi 37 3.4.6 Phƣơng pháp thụ tinh ống nghiệm (In vitro fertilization - IVF) 38 3.4.7 Phƣơng pháp đánh giá chất lƣợng phôi nang 42 3.4.8 Phƣơng pháp xử lý số liệu 43 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 4.1 Ảnh hƣởng môi trƣờng nuôi tới thành thục tế bào trứng lợn 44 4.2 Ảnh hƣởng môi trƣờng nuôi tới tỷ lệ thụ tinh tế bào trứng lợn 48 4.3 Ảnh hƣởng môi trƣờng nuôi thành thục tới phát triển phôi lợn thụ tinh ống nghiệm 50 4.4 Ảnh hƣởng nồng độ tinh tới kết thụ tinh ống nghiệm lợn 54 4.5 Ảnh hƣởng nồng độ tinh phát triển chất lƣợng phôi lợn 63 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 70 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 5.1 Kết luận 70 5.2 Đề nghị 71 DANH MỤC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 4.1 Ảnh hƣởng môi trƣờng nuôi thành thục tới khả thành thục tế bào trứng lợn Bảng 4.2 Ảnh hƣởng môi trƣờng nuôi thành thục tới khả hình thành tiền nhân đực tế bào trứng lợn Bảng 4.3 Ảnh hƣởng môi trƣờng nuôi thành thục tới phát triển tế bào trứng lợn Bảng 4.4 Ảnh hƣởng nồng độ tinh tới khả thụ tinh tinh trùng với trứng loại A Bảng 4.5 Ảnh hƣởng nồng độ tinh tới khả thụ tinh tinh trùng với trứng loại B1 Bảng 4.6 Ảnh hƣởng nồng độ tinh tới khả thụ tinh tinh trùng với trứng loại B2 Bảng 4.7 Ảnh hƣởng nồng độ tinh tới phát triển phôi lợn thụ tinh ống nghiệm với trứng loại A Bảng 4.8 Ảnh hƣởng nồng độ tinh tới phát triển phôi lợn thụ tinh ống nghiệm với trứng loại B1 Bảng 4.9 Ảnh hƣởng nồng độ tinh tới phát triển phôi lợn thụ tinh ống nghiệm với trứng loại B2 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN 43 47 49 53 56 57 61 62 63 http://www.lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC HÌNH Tên hình Trang Hình 2.1 Sự hình thành phát triển nang trứng lợn Hình 2.2 Cấu tạo tế bào trứng Hình Buồng trứng lợn lai kinh tế 33 Hình 3.2 Trứng lợn loại A, B1, B2 35 Hình 4.1 Trứng lợn giai đoạn GV (a) giai đoạn MI 44 Hình 4.2 Trứng lợn giai đoạn thành thục 45 Hình 4.3-a Tế bào trứng lợn thụ tinh bình thƣờng, 4.3-b Tế bào trứng 55 lợn đa thụ tinh Hình 4.4 Phơi giai đoạn tế bào (a) giai đoạn phôi dâu (b) 65 Hình 4.4 Phơi nang (Blastocyst) 66 Hình 4.5 Số tế bào/phơi nang 67 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC BIỂU ĐỒ Tên biểu đồ Trang Biểu đồ 4.1 Ảnh hƣởng chất lƣợng trứng tới khả xâm nhập 58 tinh trùng Biểu đồ 4.2 Ảnh hƣởng chất lƣợng trứng tới khả hình thành 59 tiền nhân Biểu đồ Ảnh hƣởng chất lƣợng trứng tới khả thụ tinh 60 bình thƣờng tế bào trứng lợn Biểu đồ 4.4 Ảnh hƣởng chất lƣợng trứng tới khả phân chia 64 tế bào trứng lợn Biểu đồ 4.5 Ảnh hƣởng chất lƣợng trứng tới khả hình thành 65 phơi nang Biểu đồ 4.6 Ảnh hƣởng chất lƣợng trứng tới chất lƣợng phôi nang Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.lrc.tnu.edu.vn 66 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt DMSO Tiếng Anh Dimethyl Sulfoxide Equine Chorionic ECG Gonadotropin Nghĩa tiếng Việt Chất bảo quản lạnh Gonadotropin thai ngựa Yếu tố thúc đẩy tăng trƣởng EGF Epidermal growth factor FBS Fetal bovine serum Huyết bào thai bê FM Fertilization medium Môi trƣờng thụ tinh FSH Follicle stimulating hormone Hormone kích thích nang trứng GSH Glutathione GV Germinal vesicle Giai đoạn bóng mầm GVBD Germinal Vesicle Break Down Giai đoạn tan bóng mầm HCG Human Chorionic Gonadotropin biểu mô Gonadotropin thai ngƣời IVC In vitro Culture Nuôi phôi IVF In vitro fertilization Thụ tinh ống nghiệm IVM In vitro muaturation Thành thục ống nghiệm LH Luteinsing Stimulating hormone Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN Hormone thể vàng http://www.lrc.tnu.edu.vn MI Metaphase I Trung kỳ I MII Metaphase II Trung kỳ II MPN Male pronuclear Tiền nhân đực NCSU 23 NCSU 37 North Carolina State University 23 North california state university 37 NST Môi trƣờng nuôi trứng, phôi Môi trƣờng nuôi trứng, phôi Nhiễm sắc thể pFF Porcine follicle fluid PMSG TCM Pregnant mare’s serum gonadotropin Tissue Culture Medium Dịch nang trứng lợn Huyết ngựa chửa Mơi trƣờng ni cấy TN Thí nghiệm tt/ml Tinh trùng/ml TTON Thụ tinh ống nghiệm vcs Và cộng ZP Zona pellucide Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN Màng suốt http://www.lrc.tnu.edu.vn phôi lên 61,5 ± 2,8% 54,1 ± 3,2% Khơng có khác biệt tỷ lệ chia hai nhóm nồng độ (P>0,05) Tỷ lệ phôi nang mức nồng độ 0,05 triệu tt/ml đạt 7,46 ± 1,0% Khi tăng nồng độ tinh lên 0,1 triệu tt/ml, tỷ lệ hình thành phơi nang tăng lên 14,8 ± 1,5% (P0,05 nhóm triệu tt/ml với nhóm 0,05 triệu tt/ml (P>0,05) Với trứng loại B1, nồng độ tinh không ảnh hƣởng tới chất lƣợng phơi nang Số tế bào trung bình/phơi nang mức nồng độ tinh 0,05 triệu tt/ml, 0,1 triệu tt/ml, triệu tt/ml tƣơng ứng 25,0 ± 1; 23,4 ± 1,2; 21,8 ± 0,8 Sự khác biệt số lƣợng tế bào/phơi nang khơng có ý nghĩa thống kê (P>0,05) Bảng 4.9 Ảnh hƣởng nồng độ tinh tới phát triển phôi lợn thụ tinh ống nghiệm với trứng loại B2 Nồng độ tinh Số trứng (tt/ml) TN 0,05 triệu 117 0,1 triệu triệu Tỷ lệ phôi nang Số tế bào/phôi (%) nang 27 (23,0 ± 2,1)b 00,00 ± 0,00 - 113 49(43,2 ± 1,4)a (5,25 ± 0,7) 16,4 ±0,5 122 52 (42,5 ± 1,3)a (2,51 ± 1,0) 16,3 ± 0,7 Tỷ lệ chia (%) Thí nghiệm lặp lại lần., TN:thí nghiệm Trong cột, chữ khác thể khác biệt có ý nghĩa thống kê, P0,05 Với nồng độ tinh triệu tt/ml, trứng loại B2 có hình thành phơi nang nhƣng tỷ lệ thấp, có phơi nang hình thành tổng số 122 trứng thí nghiệm chiếm tỷ lệ 2,51 ± 1,0% Trong đó, trứng loại A, B1 cho tỷ lệ hình thành phơi nang cao (P0,05 Ở nồng độ tinh 0,1 triệu tt/ml, trứng loại A cho tỷ lệ hình thành phơi nang cao đến trứng B1, B2 lầ lƣợt (24,41 ± 1,1%, 14,8 ± 1,5%, 5,25 ± 0,7%), khác biệt có ý nghĩa thống kê với P