Nghiên cứu một số đặc điểm bệnh lý của lợn mắc viêm phổi do actinobaccilus pleuropneumoniae, pasteurella multocida và streptococcus suis và sử dụng vacxin phòng bệnh TT

H C VI N NỌNG NGHI P VI T NAM ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ ĐỖ T T Đ T NGHIÊN CỨU M T SỐ ĐẶC ĐIỂM B NH LÝ CỦA LỢN M C VIÊM PHỔI DO ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE, PASTEURELLA MULTOCIDA, STREPTOCOCCUS SUIS VÀ SỬ DỤNG VACXIN PHọNG B NH Chuyên ng̀nh: B nh lý h c v̀ chữa b nh v t nuôi M̃ ś: 64 01 02 TÓM T T LU N ÁN TIẾN SĨ NHÀ XUẤT BẢN H C VIỆN NƠNG NGHIỆP - 2021 Cơng trình hòn th̀nh t i: H C VI N NỌNG NGHI P VI T NAM Người hướng d n: PGS.TS Nguy n Bá Hiên PGS.TS Cù Hữu Phú Ph n bi n 1: GS.TS Nguy n Quang Tuyên Trường Đ i h c Nông Lâm, Đ i h c Thái Nguyên Ph n bi n 2: PGS.TS Ph m Ng c Th ch H c viên Nông nghi p Vi t Nam Ph n bi n 3: PGS.TS Ph m Công Ho t B Khoa h c Công ngh Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện họp tại: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2021 Có thể tìm hiểu luận án thư viện: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm Thông tin, Thư viện Lương Định Của, Học viện Nông nghiệp Việt Nam PH Nă1.ăM ăĐ U 1.1 TệNHăC PăTHI TăC AăĐ ăTẨI Trong ngành công nghiệp chăn nuôi Việt Nam chăn ni lợn đóng vai trị quan trọng Tính đến đầu năm 2020, ngành chăn ni lợn nước ta phải trải qua đợt dịch tả lợn Châu Phi gây thiệt hại nặng nề, tổng số lợn nước khoảng 20 triệu lợn (Tổng cục Thống kê, 2020) Tuy nhiên, ngành chăn nuôi lợn phải gánh chịu nhiều thiệt hại bệnh truyền nhiễm khác gây ra, việc phòng chống bệnh nhằm giảm thiệt hại, nâng cao suất chăn ni ln cần coi trọng, phịng bệnh vacxin giải pháp quan trọng Trong bệnh thường gặp lợn, bệnh đường hơ hấp xếp vào nhóm bệnh gây thiệt hại lớn kinh tế Bệnh đường hô hấp lợn nguyên nhân nhiều mầm bệnh gây ra, có kết hợp virus vi khuẩn gây bệnh, khiến việc điều trị bệnh gặp khơng khó khăn Trong số vi khuẩn gây bệnh đường hô hấp lợn, vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae (A pleuropneumoniae), Pasteurella multocida (P multocida) Streptococcus suis (S suis) thường gây viêm phổi kế phát, giết chết nhiều lợn lứa tuổi, đặc biệt quan trọng lợn sau cai sữa, gây tổn thất nặng nề cho ngành chăn nuôi lợn nước ta (Cù Hữu Phú & cs., 2005) Hiện giới có nhiều cơng ty khác nghiên cứu chế tạo vacxin phòng bệnh viêm phổi cho lợn vi khuẩn gây ra, vacxin Porcilis phòng bệnh phổi cho lợn vi khuẩn Mycoplasma hyopneumoniae (M hyopneumoniae), P multocida serotype A, D Bordetella bronchiseptica (B bronchiseptica) gây Intervet sản xuất, vacxin M+ PAC vacxin Myco Shield phòng bệnh vi khuẩn M hyopneumoniae gây Intervet sản xuất, vacxin Bayovac SuiShot hãng Bayer chế tạo vacxin vơ hoạt phịng bệnh viêm phổi cho lợn tuần tuổi sử dụng chủng A.pleuropneumoniae serotype 2, chủng P multocida serotype D; vv Như vậy, vacxin nhập ngoại sử dụng trang trại chăn ni lợn nước ta vacxin phịng bệnh viêm phổi lợn chế tạo từ chủng vi khuẩn Actinobacillus M hyopneumoniae, P multocida chủng vi khuẩn sử dụng chế vacxin chưa hoàn toàn phù hợp với nguyên nhân gây bệnh viêm phổi lợn thực địa, đồng thời vacxin nhập ngoại lại có giá thành cao Tại Việt Nam vacxin đa giá vơ hoạt có bổ trợ keo phèn phịng bệnh viêm phổi cho lợn vi khuẩn A pleuropneumoniae, S suis P.multocida gây kế thừa phát triển từ đề tài cấp Nhà nước kết nghiên cứu Dự án SXTN nghiệm thu năm 2014 đưa vào sản xuất Viện Thú y Hiện nước ta có cơng ty Marphavet sản xuất phép lưu hành vacxin đa giá vơ hoạt với bổ trợ keo phèn để phịng viêm phổi cho lợn từ tuần tuổi Vacxin chế tạo vacxin đa giá vô hoạt bao gồm loại vi khuẩn A pleuropneumoniae, S suis P multocida nguyên nhân chủ yếu chủ yếu gây bệnh viêm phổi lợn Tuy nhiên việc sử dụng bổ trợ keo phèn chế tạo vacxin có hạn chế định hiệu lực, khả gây đáp ứng độ dài miễn dịch chưa cao Hiện Việt Nam chưa có vacxin viêm phổi đa giá vơ hoạt có bổ trợ nhũ dầu phịng bệnh cho lợn chế tạo gồm loại vi khuẩn A pleuropneumoniae, P.multocida S suis Vacxin đa giá có bổ trợ nhũ dầu làm tăng hiệu lực phòng bệnh vacxin, liều vacxin tiêm giảm, đặc biệt thời gian miễn dịch vacxin kéo dài nhiều nhờ phức hợp nhũ kháng nguyên Xuất phát từ tình hình thực tiễn sản xuất, đáp ứng sở khoa học cho việc phòng chống bệnh viêm phổi lợn, việc nghiên cứu số đặc điểm bệnh lý lợn mắc viêm phổi A pleuropneumoniae, P multocida S suis sử dụng vacxin phòng chống bệnh yêu cầu cần thiết, nhằm đưa giải pháp phòng trị bệnh viêm phổi lợn hiệu cao, giảm thiệt hại cho nghành chăn nuôi lợn 1.2 M CăTIểUăC AăĐ ăTẨI 1.2.1 M cătiêuăchung Nghiên cứu số đặc điểm bệnh lý xây dựng giải pháp phòng chống bệnh viêm phổi lợn vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida S suis vacxin đa giá vơ hoạt có bổ trợ nhũ dầu 1.2.2 M cătiêuăc ăth - Xác định đặc điểm biến đổi bệnh lý chủ yếu lợn mắc bệnh viêm phổi vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida S suis gây - Xây dựng quy trình sản xuất quy trình sử dụng, bảo quản vacxin viêm phổi đa giá vơ hoạt có bổ trợ nhũ dầu phịng bệnh viêm phổi có hiệu cao đàn lợn cho người chăn nuôi 1.3 PH MăVIăNGHIểNăC U 1.3.1 Đ iăt ngănghiênăc u - Bộ giống vi khuẩn A pleuropneumoniae serotype 2, 5a 5b ; vi khuẩn P multocida serotype A D; vi khuẩn S suis serotype sử dụng làm giống gốc (Master seed) lưu giữ Trung tâm nghiên cứu phát triển vacxin Công ty Marphavet - Lợn mắc bệnh viêm phổi vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida S suis gây 1.3.2 Ph măviănghiênăc u Phạm vi nghiên cứu: nghiên cứu đặc tính vi sinh vật hóa học, cấu trúc kháng nguyên, độc lực khả sử dụng làm chủng giống sản xuất vacxin vi khuẩn A pleuropneumoniae serotype 2, 5a 5b; vi khuẩn P multocida serotype A D; vi khuẩn S suis serotype lưu giữ Trung tâm nghiên cứu phát triển vacxin Công ty Marphavet Địa điểm nghiên cứu gồm: Bộ môn Vi trùng - Viện Thú y; Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam ; Phịng thí nghiệm trọng điểm khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam; Trung tâm nghiên cứu phát triển vacxin; nhà máy sản xuất vacxin theo tiêu chuẩn GMP WHO thuộc Công ty CP thuốc thú y Marphavet số sở chăn nuôi lợn Thời gian nghiên cứu: từ tháng năm 2016 đến tháng năm 2020 1.4 NH NGăĐịNGăGịPăM IăC AăĐ ăTẨI - Chế tạo thành công vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi lợn vi khuẩn A pleuropneumoniae serotype 2, 5a, 5b; P multocida serotype A, D S suis serotype gây Việt Nam quy mơ phịng thí nghiệm - Xây dựng quy trình sản xuất, sử dụng bảo quản vacxin đa giá vơ hoạt nhũ dầu phịng bệnh viêm phổi lợn lần Việt Nam quy mơ phịng thí nghiệm Vacxin đa giá phịng bệnh viêm phổi vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida S suis gây lợn, có chất bổ trợ nhũ dầu sản xuất Việt Nam, giúp tăng hiệu phòng bệnh, kéo dài thời gian miễn dịch khả bảo hộ so với vacxin loại có bổ trợ keo phèn 1.5 Ý NGHƾAăKHOAăH CăVẨăTH CăTI NăC AăĐ ăTẨI 1.5.1 ụănghƿaăkhoaăh c Kết nghiên cứu đề tài góp phần bổ sung thêm thơng tin quy trình sản xuất vacxin đa giá nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi lợn vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida S suis gây Việt Nam quy mơ phịng thí nghiệm Đồng thời sở cho việc nghiên cứu sản xuất vacxin đa giá có chất bổ trợ nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi lợn dây chuyền sản xuất vacxin quy mô công nghiệp 1.5.2 ụănghƿaăth căti n - Kết gây bệnh thực nghiệm với vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida S suis với bệnh tích lâm sàng lợn mắc bệnh sử dụng phương pháp chẩn đoán lâm sàng bệnh viêm phổi vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida S suis gây cho lợn nhanh chóng, có hiệu kinh tế cao - Vacxin vô hoạt đa giá nhũ dầu sản xuất thành công sử dụng rộng rãi thực tế sản xuất, góp phần khống chế hiệu bệnh viêm phổi vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida S suis gây lợn nuôi Việt Nam PH N 2.ăT NGăQUANăTẨIăLI U 2.1 TỊNHăHỊNHăNGHIểNăC U TRểNăTH ăGI I V ăB NHăVIểMăPH Iă ăL Nă VẨăVACXINăPHọNGăB NHă Bệnh viêm phổi - màng phổi Pattison phát lần vào năm 1957 (Pattison & cs., 1957) Shope (1964) mô tả ca bệnh cấp tính với triệu chứng tương tự đàn lợn nuôi trang trại thuộc Argentina gọi tên mầm bệnh Haemophilus pleuroneumonia Với kết nghiên cứu ADN, Haemophilus pleuroneumonia xếp vào giống Actinobacillus đặt tên Acitinobacillus pleuropneumoniae Đây cầu trực khuẩn gram âm, có giáp mơ Hiện có 15 serotype phân bố theo vùng Mỗi serotype tạo ngoại độc tố Apx I, II III Các ngoại độc tố tác nhân gây thương tổn phổi làm giảm suất lợn (Herczeg & cs., 2014) Vào năm đầu kỷ 21, hệ vacxin mới, vacxin tiểu đơn vị bao gồm ba ngoại độc tố RTX (ApxI, ApxII, ApxIII) protein 42 kDa bên màng A pleuropneumoniae nghiên cứu cho thấy có khả bảo vệ cao chống lại tất 12 kiểu huyết (kiểu huyết 1-12) điều kiện thí nghiệm thử nghiệm thực tế (Van Den Bosch & Frey, 2003) Bệnh viêm phổi Pasteurella gây kết lây nhiễm vi khuẩn P multocida cho phổi Bệnh thường thấy giai đoạn cuối bệnh viêm phổi cục hay bệnh ghép đường hô hấp lợn (PRDC) Hội chứng bệnh gây thiệt hại cho lợn đặc biệt chúng sản sinh tăng lên Những tài liệu công bố thừa nhận tổn thương bệnh viêm phổi giết mổ điển hình, chí đàn lợn quản lý tốt Những báo cáo qua nghiên cứu nhiều năm tập chung lợn với bệnh tích viêm phổi lúc mổ khám dao động từ thấp 30% đến cao 80% Những số liệu gần Mỹ cho thấy 6634 mẫu lấy từ lợn để kiểm tra phổ biến 74% lợn bị viêm phổi 13 % với chứng viêm màng phổi Những ghi nhận bệnh S suis gây lợn Jansen Van Dorssen mô tả Hà Lan vào năm 1951 Anh vào năm 1954 (Field & cs., 1954) (De Moor, 1963) lần phân lập vi khuẩn Streptococcus gây dung huyết dạng alpha, dựa vào kết giám định đặc tính sinh hóa định serotype xếp vào nhóm Lancefield R, S, RS T (Elliott & cs., 1966) thấy vi khuẩn nhóm S Moor phân lập giống với PM Streptococcus mà ông phân lập thuộc nhóm Lancefield D đề nghị gọi Streptococcus suis serotype Windsor & Elliott (1975) phân lập chủng Streptococcus suis tương ứng với nhóm R Moor phân lập đề nghị gọi Streptococcus suis serotype Clifton-Hadley (1984) thông báo phân lập vi khuẩn Streptococcus suis thuộc nhóm T từ hạch amidan, dịch âm đạo bao quy đầu lợn Gottschalk & cs (1989) gọi Streptococcus suis serotype 15 2.2 TỊNHăHỊNHăNGHIểNăC UăT IăVI TăNAMăV ăB NHăVIểMăPH Iă ăL Nă VẨăVACXINăPHọNGăB NHă Các nghiên cứu nước cho thấy, lợn mắc hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản thường gặp loại vi khuẩn gây bệnh kế phát đường hô hấp Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida, Streptococcus suis serotype 2, Bordetella bronchiseptica Nguyễn Hữu Nam & Nguyễn Thị Lan (2007), Bùi Quang Anh & cs (2008), Nguyễn Thị Kim Lan & cs (2017), Cù Hữu Phú (2005) làm cho dịch trầm trọng với bệnh lý nặng, kéo dài tỷ lệ chết cao Theo Lê Văn Dương (2013) ổ dịch lợn mắc hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản tỉnh Bắc Giang phân lập chủng vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida, S suis, cao S suis (55,10%), tiếp sau A pleuropneumoniae (19,59%) thấp P multocida (17,44%) Các tác giả nghiên cứu chế tạo Autovaccine từ chủng vi khuẩn phân lập dùng để phòng bệnh viêm phổi cho lợn, kết cho thấy Autovaccine thử nghiệm có khả phịng bệnh viêm phổi cho lợn, cho đáp ứng miễn dịch bốn tháng hiệu lực bảo hộ 93,33% PH Nă3.ăV T LI U,ăN IăDUNG VÀ PH NGăPHỄPăNGHIểNăC U 3.1 Đ AăĐI MăNGHIểNăC U - Bộ môn Vi trùng - Viện Thú y; Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Việt Nam; Phịng thí nghiệm trọng điểm khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam; Trung tâm nghiên cứu phát triển vacxin; nhà máy sản xuất vacxin theo tiêu chuẩn WHO thuộc Công ty CP thuốc thú y Marphavet số sở chăn nuôi lợn 3.2.ăTH IăGIANăNGHIểNăC U Đề tài thực từ tháng năm 2016 đến tháng năm 2020 3.3.ăV TăLI UăNGHIểNăC U - Bộ vi khuẩn sử dụng làm giống gốc (Master seed) sản xuất vacxin viêm phổi lợn lưu giữ Trung tâm nghiên cứu phát triển vacxin gồm có: + Vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae serotype 2, 5a 5b + Vi khuẩn Pasteurella multocida serotype A D + Vi khuẩn Streptococcus suis serotype - Môi trường, hóa chất dùng nghiên cứu, sản xuất vacxin đa giá phòng viêm phổi lợn + Các loại môi trường dùng để nuôi cấy, lưu giữ vi khuẩn hãng Oxoid (Anh) Merck (Pháp) sản xuất: Môi trường nước thịt, thạch thường, thạch máu, thạch MacConkey, thạch Chocolate, BHI broth, BHI agar, TSB, PLLO agar … + Các loại mơi trường, hóa chất dùng để giám định, xác định đặc tính sinh hóa vi khuẩn: Môi trường đường loại, dung dịch Kovac’s, dung dịch H2O2 3%, giấy thử Oxidase, nước muối 6,5%, + NAD hãng Oxoid (Anh) sản xuất + Chất bổ trợ nhũ dầu IMS 1313 công ty Seppic- Pháp cung cấp - Động vật thí nghiệm: + Lợn sau cai sữa khỏe mạnh khơng tiêm vacxin có kháng ngun A pleuropneumoniae, P multocida S suis + Chuột nhắt trắng: 18- 20 g khỏe mạnh - Máy móc, dụng cụ thí nghiệm + Các máy móc, dụng cụ dùng phịng thí nghiệm, hố chất sát trùng, tiêu độc, rửa dụng cụ để thực kỹ thuật PCR, RT-PCR; ELISA, + Dây chuyền công nghệ chế tạo vacxin quy mô công nghiệp máy lên men sục khí 15 lít 120 lít SATORIUS Đức; hệ thống chai tự động Ý 3.4.ăN IăDUNGăNGHIểNăC U 3.4.1.ăNghiênăc uătri uăch ngălơmăsƠng,ăb nhătíchăđ iăth ăc aăl năm căb nhădoăviă khu năA pleuropneumoniae, P multocida S suis gây - Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể lợn mắc bệnh vi khuẩn A pleuropneumoniae gây - Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể lợn mắc bệnh vi khuẩn P multocida gây - Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể lợn mắc bệnh vi khuẩn S suis gây 3.4.2 Nghiênăc uăđánhăgiáăkh ănĕngă năđ nhăđ cătínhăsinhăh căc a b gi ngăs năxu tă vacxinăphòngăb nhădoăviăkhu năA pleuropneumoniae, P multocida S suis gây - Nghiên cứu đánh giá khả ổn định đặc tính sinh học giống sản xuất vacxin phòng bệnh vi khuẩn A pleuropneumoniae gây - Nghiên cứu đánh giá khả ổn định đặc tính sinh học giống sản xuất vacxin phòng bệnh vi khuẩn P multocida gây - Nghiên cứu đánh giá khả ổn định đặc tính sinh học giống sản xuất vacxin phịng bệnh vi khuẩn S suis gây 3.4.3 Nghiênăc uăquyătrìnhăs năxu tăvacxinăđaăgiáăvơăho tănhǜăd uăphịngăb nhăviêmă ph i ăl nădoăviăkhu năA pleuropneumoniae, P multocida S suis gây - Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất vacxin đa giá vơ hoạt nhũ dầu phịng bệnh viêm phổi lợn vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida S suis gây - Nghiên cứu đánh giá chất lượng vacxin bán thành phẩm - So sánh khả sinh miễn dịch vacxin đa giá bổ trợ keo phèn vacxin đa giá bổ trợ nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi lợn vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida S suis - Xây dựng quy trình sử dụng vacxin đa giá vơ hoạt nhũ dầu phịng bệnh viêm phổi lợn vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida S suis gây - Xây dựng quy trình bảo quản vacxin đa giá vơ hoạt nhũ dầu phịng bệnh viêm phổi lợn vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida S suis gây 3.5.ăPH NGăPHỄPăNGHIểNăC U 3.5.1 Ph ngăphápăgơyăb nhăth cănghi măbằngăcácăch ngăviăkhu năA pleuropneumoniae, P multocida S suis master seed Chọn 24 lợn sau cai sữa (4 tuần tuổi) khỏe mạnh không tiêm vacxin viêm phổi có kháng nguyên A pleuropneumoniae, P multocida S suis Trước gây bệnh cho lợn, tiến hành lấy máu kiểm tra kháng thể (âm tính) có máu lợn với A pleuropneumoniae, P multocida S suis Lợn chia làm lơ, lơ có Liều gây bệnh 100 liều LD 50, với đường gây bệnh da lợn Lợn đối chứng tiêm BHI broth vô trùng Theo TCVN 8685 3.5.2 Ph ngăphápăniăc yăviăkhu năvƠăgiámăđ nhăđ cătínhăsinh hóa Phương pháp giám định đặc tính ni cấy loại mơi trường, đặc tính sinh vật hóa học chủng vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida S suis nghiên cứu theo (Moller & cs., 1996; Quinn & cs., 2012) theo TCVN- 8685 Bệnh phẩm phổi, dịch ngoáy vùng hầu họng cấy sơ cấp lên môi trường thạch máu môi trường thạch chọn lọc Colombia Sau ni cấy tủ ấm có 5% CO2, chọn 1-2 khuẩn lạc nghi ngờ đặc trưng để giám định vi khuẩn mặt hình thái đặc tính sinh hóa tùy theo loại vi khuẩn Việc kiểm tra đặc tính sinh hóa theo TCVN 8685 3.5.3 Ph ngăphápăPCR - Xác định A pleuropneumoniae kỹ thuật PCR theo (Gram & cs., 1998) - Xác định type giáp mô A, B, D vi khuẩn P multocida dựa phản ứng PCR mô tả (Đỗ Ngọc Thúy & cs., 2007) - Bốn serotype S suis gây bệnh thường gặp lợn serotype 1, 2, xác định phản ứng PCR 3.5.4 Ph ngăphápăđánhăgiáăđ căl căviăkhu nătrênăchu tăvƠăl n Độc lực chủng A pleuropneumoniae, P multocida S suis nghiên cứu này, xác định chuột nhắt trắng lợn Xác định độc lực chủng A pleuropneumoniae, P multocida S suis nghiên cứu chuột nhắt trắng theo phương pháp (Carter, 1995), tính liều LD50 theo (Reed & Muench, 1938).Với chủng vi khuẩn, sử dụng canh trùng nuôi cấy 37◦C/24 giờ, riêng với A pleuropneumoniae nuôi cấy điều kiện có 5% CO2 chủng vi khuẩn tiêm cho chuột thí nghiệm vào da với liều 0,2 ml/con Với lợn, lợn gây bệnh thực nghiệm liều ml/con (Theo TCVN 8685) 3.5.5 Ph ngăphápăch ăt oăvacxinăđaăgiáăvôăho tănhǜăd u Giống gốc master seed: lưu giữ Trung tâm nghiên cứu phát triển vacxin gồm: Vi khuẩn A pleuropneumoniae serotype 2, 5a 5b; Vi khuẩn P multocida serotype A D; vi khuẩn S suis serotype Bộ giống gốc sử dụng để sản xuất vacxin đa giá vơ hoạt có bổ trợ keo phèn phịng bệnh viêm phổi cho lợn, phép lưu hành toàn quốc Các vi khuẩn giống gốc có cấu trúc kháng ngun ổn định, kháng ngun tính cao, sản sinh loại độc tố độc lực cao (Hồ sơ đăng ký lưu hành thuốc thú y: Sản phẩm: MAR-APPSVAC - vacxin viêm phổi lợn đa giá, 2015) 3.5.6.ăPh ngăphápăki m nghi m vacxin * Phương pháp kiểm tra tiêu vô trùng Kiểm tra cảm quan, đậm độ vô trùng: Vacxin kiểm tra vô trùng (không tạp nhiễm vi khuẩn nấm mốc) theo tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8684:2011 theo quy trình Bộ môn Vi trùng, Viện Thú y quốc gia * Phương pháp kiểm tra tiêu an toàn Kiểm tra an toàn: Vacxin kiểm tra an toàn chuột nhắt trắng cách tiêm bắp đùi liều 0,5 ml/con Bên cạnh vacxin kiểm tra an tồn lợn cách tiêm vacxin liều gấp đơi (4 ml/con) cho lợn tuần tuổi với đường tiêm bắp Theo dõi phản ứng chuột nhắt lợn để xem mức độ an toàn vacxin thử nghiệm * Phương pháp kiểm tra tiêu hiệu lực Kiểm tra hiệu lực: Vacxin kiểm tra phải có khả tạo đáp ứng miễn dịch đạt hiệu lực ≥ 70% cơng cường độc Lợn thí nghiệm lợn khỏe mạnh, tuần tuổi 3.5.7 Ph ngăphápăx ălỦăs ăli u Số liệu thu nghiên cứu tổng hợp xử lý phần mềm Microsoft Excel 2019 phần mềm R phiên 4.0.2 PH Nă4.ăK T QU VÀ TH O LU N 4.1 K TăQU ăNGHIểNăC UăTRI UăCH NGăLỂMăSẨNG,ăB NHăTệCHăĐ IăTH ă C AăL NăM CăB NHăDOăVIăKHU NăA PLEUROPNEUMONIAE, P MULTOCIDA VÀ S SUIS GÂY RA 4.1.1 K tăqu ănghiênăc uătri uăch ngălơmăsƠng,ăb nhătíchăđ iăth ăc aăl năm căb nhă doăviăkhu năA pleuropneumoniae gây 4.1.1.1 Kết kiểm tra yếu tố độc lực lợn Dựa kết xác định độc lực liều LD 50 vi khuẩn A pleuropneumoniae, xác định liều vi khuẩn gây bệnh thực nghiệm sau: A pleuropneumoniae serotype 2: 4,5 x 109 CFU/ml; Chủng vi khuẩn A pleuropneumoniae serotype 5a 5b có cấu trúc kháng nguyên độc lực tương đồng nhau, nên chọn chủng 5a đại diện cho chủng 5a 5b để gây bệnh thực nghiệm cho lợn với liều A pleuropneumoniae serotype 5a: x 10 CFU/ml Kết đánh giá khả gây bệnh lợn giống vi khuẩn A pleuropneumoniae thể bảng 4.1 B ng 4.1 K t qu đánhăgiáăkh nĕngăgơyăb nh A pleuropneumoniae l n c a vi khu n K tăqu ătheoădõi S ăl nă Phân Lơ thí Ch ngăviăkhu năăgơyă Li uăgơyă thí Tỷăl ă nghi m b nh b nhă nghi m S ăconă Th iăgiană ch t l păl iă ch t ch t vi (ml/con) (con) (%) khu n A pleuropneumoniae 3/3 – 12 h 100 3/3 serotype Lô A pleuropneumoniae 2/3 – 20 h 66,7 3/3 serotype 5a Lô Đối chứng 0 B ng 4.2 Tri u ch ng lâm sàng b nhătíchăđ i th c a l năđ A pleuropneumoniae Bi u hi n Sốt Ho, thở khó Chảy máu mũi Khí quản chứa dịch nhày lẫn máu Viêm dính phổi thành ngực S l n gây b nh (con) 6 6 c gây nhi m S l n bi u hi n (con) 6 5 Tỷ l 6/6 6/6 5/6 5/6 6/6 Ghi chú: A: Lợn chảy máu mũi; B: Phổi viêm dính thành ngực Hình 4.1 M t s b nhătíchăđ i th c a l năđ c gây nhi m A pleuropneumoniae B ng 4.5 K t qu đánhăgiáăkh nĕngăgơyăb nh l n c a vi khu n S suis Lơ thí Ch ngăviăkhu nă nghi m gơyăb nh K tăqu ătheoădõi Li uăgơyă S ăl năthí b nhă nghi m S ăconă Th iă (ml/con) (con) ch t gianăch t Lô S suis serotype 3/3 Lô Đối chứng 36 h Sốt Ho, thở khó Triệu chứng thần kinh Viêm phổi Viêm khớp Viêm màng não S l n gây b nh (con) 3 3 3 Phơnăl pă ch t l iăviă (%) khu n 100 3/3 B ng 4.6 Tri u ch ng lâm sàng b nhătíchăđ i th c a l năđ Bi u hi n Tỷăl ă c gây nhi m S suis S l n bi u hi n (con) 3 3 Tỷ l (%) 3/3 3/3 3/3 3/3 1/3 3/3 Viêm khớp lợn Hình 4.5 M t s tri u ch ng lâm sàng, b nhătíchăđ i th c a l n gây nhi m S suis 4.1.3.2 Kết giám định lại vi khuẩn sau gây bệnh thực nghiệm kỹ thuật PCR Sau gây bệnh, lấy mẫu, phân lập lại vi khuẩn gây bệnh thực nghiệm xác định vi khuẩn với mồi phản ứng PCR Kết hình 4.6 cho thấy: chủng S suis nghiên cứu, sau trình chạy PCR điện di cho sản phẩm đặc hiệu giống 688 bp 11 M Ghi chú: Giếng M: 1000 bp marker Giếng 1, 2, 3: sản phẩm PCR xác định gen gdh (688 bp) S suis 1000 bp 688 bp Hình 4.6 S n ph m c a kỹ thu t PCRăxácăđ nh S suis 4.2 K Tă QU ă ĐỄNHă GIỄă KH ă NĔNGă Nă Đ NHă Đ Că TệNHă SINHă H Că C Aă GI NGăS NăXU TăVACXINăPHọNGăB NHăDOăVIăKHU NăA PLEUROPNEUMONIAE, P MULTOCIDA VÀ S SUIS GÂY RA 4.2.1 K tăqu ăđánhăgiáăkh ănĕngă năđ nhăđ cătínhăsinhăh căc aăgi ngăs năxu tăvacxină phòngăb nhădoăviăkhu năA pleuropneumoniae gây 4.2.1.1 Kết kiểm tra đặc điểm ni cấy đặc điểm hình thái Kết kiểm tra đặc điểm nuôi cấy đặc điểm hình thái vi khuẩn A pleuropneumoniae thể hình 4.7 Hình A: Khuẩn lạc APP thạch PPLO Hình B: Vi khuẩn APP kính hiển vi Hình 4.7 Khu n l c A pleuropneumoniae hình thái vi khu n soi kính hi n vi 4.2.1.2 Kết kiểm tra đặc điểm sinh hóa Sau nuôi cấy môi trường, tiến hành kiểm tra đặc tính sinh hóa giống sản xuất Kết kiểm tra đặc tính sinh hóa cho thấy: 100% số chủng dương tính với phản ứng Oxidase, Catalase, Urease, CAMP, O.N.P.G cần yếu tố V cho trình phát triển, 100% số chủng âm tính với phản ứng Indol Các chủng A pleuropneumoniae kiểm tra có khả lên men loại đường Glucose, Maltose, Mannitol, Xylose khơng có chủng lên men loại đường: 12 Arabinose, Lactose, Raffinose, Sorbitol Như chủng A pleuropneumoniae lựa chọn dùng cho nghiên cứu mang đặc tính sinh vật hóa học điển hình vi khuẩn A pleuropneumoniae mô tả (Moller & cs., 1996), phù hợp với nghiên cứu (Trịnh Quang Hiệp & cs., 2004; Cù Hữu Phú & cs., 2005; Nguyễn Thị Thu Hằng, 2010) 4.2.1.3 Kết kiểm tra yếu tố độc lực kỹ thuật PCR Trong nghiên cứu này, ứng dụng kỹ thuật Multiplex PCR để xác định có mặt gen mã hóa độc tố Apx chủng A pleuropneumoniae nghiên cứu Kết thể bảng 4.7 B ng 4.7 K t qu xácăđ nh gen s năsinhăđ c t c a gi ng s n xu t A pleuropneumoniae Ký hi u Serotype ch ng A1 A2 A3 5a 5b Ch ngămangăgenăđ c t Apx S ch ng apxICA apxIICA apxIIICA apxIBD apxIIIBD 1 1 1 1 1 1 Kết cho thấy, chủng A pleuropneumoniae nghiên cứu có mang từ đến gen quy định sản sinh độc tố Apx Tất chủng thuộc serotype mang ba loại gen mã hóa độc tố, chủng có serotype 5a mang tổ hợp gen apxICA/apxIICA/apxIBD, cịn chủng có serotype 5b mang tổ hợp gen apxIIICA/apxIBD/apxIIIBD 4.2.2 K tăqu ăđánhăgiáăkh ănĕngă năđ nhăđ cătínhăsinhăh căc aăgi ngăs năxu tăvacxină phịngăb nhădoăviăkhu năPasteurella multocida gây 4.2.2.1 Kết kiểm tra đặc điểm ni cấy đặc điểm hình thái Kết kiểm tra đặc điểm ni cấy đặc điểm hình thái vi khuẩn P multocida thể hình 4.8 Hình A: Khuẩn lạc P multocida Hình B: Vi khuẩn P multocida KHV Hình 4.8 Khu n l c P multocida hình thái vi khu n soi kính hi n vi 13 4.2.2.2 Kết kiểm tra đặc điểm sinh hóa Tất chủng dương tính với phản ứng Indol, Oxidase, Catalase 100% chủng có khả lên men loại đường Glucose, Galactose, Mannitol, Saccharose, Fructose không lên men đường Lactose, Arabinose, Maltose 4.2.2.3 Kết kiểm tra yếu tố độc lực kỹ thuật PCR Trong nghiên cứu này, sử dụng phản ứng Multiplex PCR để xác định type giáp mô A, B, D chủng P multocida lựa chọn dùng cho nghiên cứu theo quy trình chuẩn hóa Bộ mơn Vi trùng - Viện Thú y (Đỗ Ngọc Thúy & cs., 2007) Các cặp mồi sử dụng CAPA-F CAPA-R dùng để xác định type A, CAPB-F CAPB-R để xác định type B, CAPD-F CAPD-R để xác định type D B ng 4.8 K t qu xácăđ nh y u t đ c l c c a gi ng s n xu t P multocida TT KH ch ng Serotype A A4 + A5 Serotype B Serotype D + 4.2.3 K t qu đánhăgiáăkh nĕngă năđ nhăđ c tính sinh h c c a gi ng s n xu t vacxin phòng b nh vi khu n S suis gây 4.2.3.1 Kết kiểm tra đặc điểm nuôi cấy đặc điểm hình thái Kết kiểm tra đặc điểm ni cấy đặc điểm hình thái vi khuẩn S suis thể hình 4.9 Hình A: Khuẩn lạc S suis Hình B: Vi khuẩn S suis kính hiển vi Hình 4.9 Khu n l c S suis hình thái vi khu n soi kính hi n vi 4.2.3.2 Kết kiểm tra đặc điểm sinh hóa Chủng kiểm tra khơng phát triển mơi trường NaCl 6,5% âm tính với phản ứng KOH 3% Chủng âm tính với phản ứng Oxydase, Catalase, Indol Chủng kiểm tra lên men loại đường: Glucose, Galactose, Maltose, Lactose khơng có chủng lên men đường Mannitol, Sorbitol 14 4.3 NGHIểNă C Uă QUYă TRỊNHă S Nă XU Tă VACXINă ĐAă GIỄă VỌă HO Tă NHǛă D Uă PHọNGă B NHă VIểMă PH I ă L Nă DOă VIă KHU Nă A PLEUROPNEUMONIAE, P MULTOCIDA VÀ S SUIS GÂY RA 4.3.1 Nghiênăc uăxơyăd ngăquyătrìnhăs năxu tăvacxinăđaăgiáăvơăho tănhǜăd uăphịngăb nhă viêmăph i ăl nădoăviăkhu năA pleuropneumoniae, P multocida S suis gây 4.3.1.1 Kết theo dõi lơ lên men sục khí Chúng tơi chế tạo vacxin dạng vơ hoạt có bổ trợ keo phèn nhũ dầu theo quy trình thường quy Bộ môn Vi trùng - Viện Thú y quy trình sản xuất vacxin theo dây chuyền sản xuất công nghiệp nhà máy vacxin GMP-WHO Các chủng vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida S suis nuôi cấy riêng loại vi khuẩn, loại vi khuẩn nuôi cấy lô khác phương pháp lên men sục khí B ng 4.10 K t qu ni c y vi khu n bằngăph ngăphápălênămenăs c khí Lo i vi khu n S l n nuôi c y S l ng vi khu n trung bình (x 109 CFU/ml) A pleuropneumoniae 10,67 ± 0,52 CFU/ml P multocida 13,33 ± 1,37 CFU/ml S suis 11,00 ± 0,89 CFU/ml 4.3.1.2 Chuẩn bị loại kháng nguyên bán thành phẩm Sau vô hoạt vi khuẩn canh trùng thu cách sử dụng formol với tỷ lệ 0,3%, tiến hành kiểm tra vô trùng loại môi trường nước thịt, thạch máu nước thịt yếm khí Các loại kháng nguyên sau kiểm tra đảm bảo vô hoạt 100% tiến hành pha trộn với bổ trợ nhũ dầu IMS-1313 theo hướng dẫn Seppic với tỷ lệ 25% (3 phần canh trùng kháng nguyên + phần nhũ dầu) Dựa kết lên men sục khí loại kháng nguyên (A pleuropneumoniae serotype 2, 5a 5b; S suis serotype P multocida serotype A D), cần tiến hành pha trộn loại kháng nguyên với nhũ dầu (25%) để có liều tiêm vacxin cho lợn (2ml vacxin/lợn) đảm bảo sau: + Kháng nguyên A pleuropneumoniae serotype 2, 5a 5b có - 4,5x109 CFU/liều tiêm + Kháng nguyên S suis serotype 2: 4- 4,5 x109 CFU/liều tiêm + Kháng nguyên P multocida A D: 4- 4,5 x109 CFU/liều tiêm Sau vacxin bán thành phẩm sản xuất, tiến hành kiểm tra độ khiết vi khuẩn phương pháp làm tiêu quan sát vi sinh vật chết kiểm tra kính hiển vi 15 4.3.2 K t qu đánhăgiáăch tăl ng vacxin bán thành ph m Chúng tiến hành kiểm tra vô trùng phương pháp nuôi cấy loại môi trường sau: B ng 4.11 K t qu ki mătraăđ măđ , thu n t vô trùng c a lô gi ngăđ năgiá Lo iăviăkhu n S ălơăthíă Ch ătiêuăki mătra nghi m Đ măđ ă (x 109 CFU/ml) Thu năkhi t n (%) Vô trùng n (%) A pleuropneumoniae 10,67 ± 0,52 3/3 (100) 3/3 (100) P multocida 13,33 ± 1,37 3/3 (100) 3/3 (100) S suis 11,00 ± 0,89 3/3 (100) 3/3 (100) B ng 4.12 K t qu ki m tra thu n t vô trùng c aăvacxinăđaăgiáăbánă thành ph m Ch ătiêuăki mătra Lơăthíănghi m Thu năkhi t Vô trùng Đạt Đạt Đạt Đạt Tổng hợp Đạt 3/3 (100%) Đạt 3/3 (100%) Sau kiểm tra lô canh trùng chế tạo đạt tiêu chuẩn chế vacxin, tiến hành trộn lẫn lô canh trùng với theo tỷ lệ phù hợp để đạt hỗn hợp canh trùng đồng nhất, bổ sung nhũ dầu với tỷ lệ 1/4 để đảm bảo ml vacxin có chứa 4- x 109 CFU Kiểm tra an toàn vacxin chế tạo chuột nhắt trắng: chọn lô 10 chuột, chuột tiêm vacxin với liều 0,5 ml/con vào bắp đùi Theo dõi chuột vòng 10 ngày B ng 4.13 K t qu ki m tra an toàn c a vacxin bán thành ph m chu t nh t tr ng Th i gian S chu t thí S chu t Đ t thí Li u tiêm theo dõi nghi m s ng nghi m đ ng tiêm (ngày) (con) (con) 0,5 ml/con; tiêm bắp đùi 0,5 ml/con; tiêm bắp đùi 0,5 ml/con; tiêm bắp đùi Tỷ l s ng (%) 10 10 10 100 10 10 10 100 10 10 10 100 16 Bi u hi n Chuột phát triển, ăn uống bình thường Chuột phát triển, ăn uống bình thường Chuột phát triển, ăn uống bình thường Lợn kiểm tra an tồn với liều tiêm gấp đơi liều sử dụng theo tiêu chẩn kiểm nghiệm vacxin vi khuẩn vô hoạt: tất lợn tuần tuổi tiêm vacxin theo lô sống khỏe mạnh, khơng có biểu phản ứng sau tiêm qua 10 ngày theo dõi Điều khẳng định vacxin chế tạo đạt yêu cầu tiêu an toàn 100% lợn B ng 4.14 K t qu ki m tra an toàn c a vacxin bán thành ph m l n Th i gian S l n thí Tỷ l Đ t thí Li u tiêm S l n theo dõi nghi m s ng nghi m đ ng tiêm s ng (con) (ngày) (con) (%) ml/con; tiêm bắp ml/con; tiêm bắp ml/con; tiêm bắp Bi u hi n Lợn khỏe mạnh, khơng có phản 10 10 10 5 5 5 100 ứng nơi tiêm phản ứng toàn thân Lợn 100 ứng thân Lợn 100 ứng thân khỏe mạnh, khơng có phản nơi tiêm phản ứng tồn khỏe mạnh, khơng có phản nơi tiêm phản ứng toàn B ng 4.15 K t qu th hi u l c c a vacxin chu t nh t tr ng bằngăph ngăphápăthay th Lô chu t Lo i canh trùng tiêm S l ng chu t côngăc ngăđ c S l ng chu t ch t (con) Th i gian ch t chu t (gi ) APP serotype 0/5 APP serotype 5a 1/5 APP serotype 5b 0/5 Thí nghiệm P multocida serotype A 0/5 P multocida serotype D 0/5 S suis serotype 0/5 Không tiêm 0/5 APP serotype 5/5 24 APP serotype 5a 5/5 48 APP serotype 5b 5/5 48-72 P multocida serotype A 5/5 48 P multocida serotype D 5/5 24 S suis serotype 5/5 72 Đối chứng 17 48 B ng 4.16 K t qu ki m tra hi u l c vacxin l n ph ngăpháp tr ng tài Lô l n Đ ng tiêm Thí Dưới da nghi m Đ i ch ng Dưới da Li u tiêm (ml) ml ml Lo i canh trùng tiêm S l n công S c ngăđ c (con) l n ch t (con) Th i gian ch t (gi ) A pleuropneumoniae serotype 0/3 A pleuropneumoniae serotype 5a 0/3 A pleuropneumoniae serotype 5b 0/3 P multocida serotype A 1/3 P multocida serotype D 0/3 S suis serotype 0/3 A pleuropneumoniae + S suis + P multocida A pleuropneumoniae serotype 2 2/2 24 A pleuropneumoniae serotype 5a 2/2 24 A pleuropneumoniae serotype 5b 2/2 72 P multocida serotype A 2/2 24 P multocida serotype D 2/2 24 S suis serotype 2 2/2 72 A pleuropneumoniae + S suis + P multocida 2/2 24 72 0/3 Ghi chú: LD50 A pleuropneumoniae serotype 4,3 x 107 CFU/0,2 ml serotype 4,8 x 107 CFU/0,2 ml LD50 chủng P multocida serotype A x 107 CFU/0,2 ml serotype D 4,2 x 107 CFU/0,2 ml LD50 S suis serotype 4,4 x 107 CFU/0,2 ml 4.3.3 K t qu so sánh kh nĕngăsinhămi n d ch c aăvacxinăđaăgiáăb tr keo phèn vacxinăđaăgiáăb tr nhǜăd u ch ng l i vi khu n A pleuropneumoniae, P multocida S suis 4.3.3.1 Kết kiểm tra kháng thể vacxin vô hoạt nhũ dầu Vacxin bán thành phẩm đa giá đạt tiêu cảm quan, vô trùng, an toàn hiệu lực Tuy nhiên, để biết khả bảo hộ thời gian bảo hộ vacxin với động vật, hiệu giá kháng thể theo thời gian cần xác định Kết xác định hiệu giá kháng thể vacxin đa giá cho thấy: trước thời điểm tiêm vacxin, lợn thí nghiệm kiểm tra thấy âm tính kháng thể máu Tuy nhiên, vacxin đa giá giúp cho thể lợn sản sinh kháng thể mức cao Vào thời điểm 21 ngày sau tiêm vacxin, hàm lượng kháng thể chống A pleuropneumoniae dao động từ 6,5 ± 0,71 log2 đến 7,4 ± 0,52 log2 Hàm lượng kháng thể chống P multocida type A D 6,5 ± 0,53 6,4 ± 0,52 hàm lượng kháng thể chống S suis type 6,0 ± 0,00 log2 Với hiệu giá kháng thể thời điểm sau (2 tháng, tháng, tháng, tháng) cho thấy, hàm lượng kháng thể chống lại mầm bệnh xét nghiệm giảm dần 18 B ng 4.17 K t qu ki m tra kháng th l n tiêm vacxin vơ ho tănhǜăd u phịng viêm ph i l n kháng l i vi khu n A Pleuropneumoniae (serotype 2, 5a, 5b), P multocida (serotype A, D), S suis serotype Ch ătiêuătheoădõi A pleuropneumoniae serotype A pleuropneumoniae serotype 5a A pleuropneumoniae serotype 5b P multocida serotype A P multocida serotype D S suis serotype K tăqu ăxácăđ nhăhi uăgiáăkhángăth (log2) Sau tiêm vacxin Tr că tiêm 21 ngày vacxin tháng tháng tháng tháng - 6,7d ± 0,48 4,9c ± 0,57 4,6bc ± 0,52 4,0ab ± 0,00 3,4a ± 1,26 - 6,5c ± 0,71 5,0b ± 0,82 4,3ab ± 0,48 3,9a ± 0,32 3,6a ± 0,52 - 7,4d ± 0,52 5,8c ± 0,92 4,7b ± 0,67 4,1ab ± 0,32 3,8a ± 0,42 - 6,5b ± 0,53 6,4b ± 0,52 6,4c ± 0,52 5,9bc ± 0,32 6,0c ± 0,00 5,9c ± 0,32 6,2b ± 0,42 5,8b ± 0,42 5,8c ± 0,42 5,9b ± 0,32 5,2a ± 0,79 5,7b ± 0,48 4,9a ± 0,32 4,9b ± 0,32 4,0a ± 0,00 Ghi chú: a, b, c: Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P < 0,05 4.3.3.2 Kết so sánh hình thành kháng thể kháng vi khuẩn A pleuropneumoniae vacxin đa giá bổ trợ keo phèn vacxin đa giá bổ trợ nhũ dầu Lợn thí nghiệm chia lơ: lơ có lợn tiêm vacxin có bổ trợ keo phèn; Lơ có lợn, tiêm vacxin có bổ trợ nhũ dầu; Lơ có lợn đối chứng, tiêm nước sinh lý Huyết lợn sau tiêm vacxin 21 ngày, sử dụng để xác định hàm lượng kháng thể hình thành máu sau tiêm vacxin 21 ngày B ng 4.18 K t qu so sánh hình thành kháng th kháng vi khu n A pleuropneumoniae c aăvacxinăđaăgiáăb tr keoăphènăvƠăvacxinăđaăgiáăb tr nhǜă d u bằngăph ng pháp ELISA S S tai TT TN1 TN2 TN3 TN4 TN5 TN6 TN7 TN8 TN9 10 TN10 11 TN11 12 TN12 13 TN13 14 15 Lo i vacxin Đ ng tiêm Li u tiêm Serotype OD450 0,712 0,47 Keo phèn Dưới da ml 1,215 0,633 0,441 Trung bình 1,795 1,361 Nhũ dầu Bắp ml 1,53 1,265 2,365 Trung bình 0,043 Nước thịt Dưới da ml 0,047 0,048 Đối chứng dương 1,030 Đối chứng âm 0,054 19 S/P Serotype Đánhă giá OD450 S/P 67,418 + 42,623 + 118,955 + 59,324 + 39,652 + 65,59a ± 31,98 178,381 + 133,914 + 151,230 + 124,078 + 236,783 + 164,88b ± 45,17 -1,127 -0,717 -0,615 0,591 1,421 0,54 0,59 0,112 2,365 1,53 1,265 1,361 1,795 0,045 0,049 0,052 1,002 0,058 Đánhă giá 56,462 + 144,386 + 51,059 + 56,356 + 5,720 62,80a ± 55,33 244,385 + 155,932 + 127,860 + 138,029 + 184,004 + 170,04b ± 46,70 -1,377 -0,953 -0,636 Kết bảng 4.18 cho thấy: 10 lợn tiêm vacxin viêm phổi đa giá có 9/10 lợn dương tính với kháng thể kháng vi khuẩn A pleuropneumoniae serotype Trong lợn đối chứng âm tính với kháng thể Kết cho thấy: số OD S/P đánh giá vacxin nhũ dầu kích thích thể lợn hình thành kháng thể kháng vi khuẩn A pleuropneumoniae serotype tốt lợn tiêm vacxin viêm phổi đa giá có bổ keo phèn 4.3.3.3 Kết so sánh hiệu giá kháng thể kháng vi khuẩn P multocida vacxin đa giá bổ trợ keo phèn vacxin đa giá bổ trợ nhũ dầu Để so sánh hiệu giá kháng thể kháng vi khuẩn P multocida serotype A D hình thành máu lợn sau tiêm hai loại vacxin vơ hoạt có bổ trợ keo phèn bổ trợ nhũ dầu khác lợn sau 21 ngày tiêm vacxin, lấy máu lợn lô khác trước sau tiêm 21 ngày, tiến hành làm phản ứng ngưng kết B ng 4.19 K t qu so sánh hi u giá kháng th kháng vi khu n P multocida c a vacxin đaăgiáăb tr keoăphènăvƠăvacxinăđaăgiáăb tr nhǜăd u S S tai Lo i vacxin Đ TT TN1 TN2 TN3 TN4 TN5 TN6 TN7 TN8 Keo phèn ng tiêm Serotype A ml 3Log2 + 3Log2 + 3Log2 + 3Log2 + Dưới da Trung bình ml Nhũ dầu Bắp TN9 10 TN10 11 TN11 12 TN12 13 TN13 Nước thịt Đánhă Serotype Đánhăgiá giá D Li u tiêm Trung bình ml Dưới da 4Log2 + 4Log2 + 4Log2 + 3,60 Log2 ± 0,55 4Log2 + 4Log2 + 5Log2 + 4Log2 + 4Log2 + 4Log2 + 3,60 Log2 ± 0,55 4Log2 + 4Log2 + 5Log2 + 4Log2 + 5Log2 + 4,40 Log2 ± 0,55 - 4Log2 + 5Log2 + 4,40 Log2 ± 0,55 - Kết cho thấy: hàm lượng kháng thể kháng vi khuẩn P multocida serotype A D lợn tiêm vacxin viêm phổi đa giá có bổ trợ nhũ dầu có cao so với lợn tiêm vacxin viêm phổi đa giá có bổ keo phèn 20 4.3.3.4 Kết so sánh hiệu giá kháng thể kháng vi khuẩn S suis vacxin đa giá bổ trợ keo phèn vacxin đa giá bổ trợ nhũ dầu Kết bước đầu cho thấy khơng có khác biệt khả hình thành kháng thể kháng vi khuẩn S suis serotype lợn tiêm vacxin viêm phổi đa giá có bổ trợ nhũ dầu Do cần tiếp tục nghiên cứu với số lượng mẫu nhiều thời gian miễn dịch kéo dài để đánh giá khả bảo hộ loại vacxin bổ trợ keo phèn bổ trợ nhũ dầu lợn B ng 4.20 K t qu so sánh hi u giá kháng th kháng vi khu n S suis c aăvacxinăđaă giá b tr keoăphènăvƠăvacxinăđaăgiáăb tr nhǜăd u Số TT Số tai Loại vacxin Đường tiêm Liều tiêm Serotype Đánh giá TN1 Keo phèn Dưới da 2ml 3Log2 + TN2 Keo phèn Dưới da 2ml 3Log2 + TN3 Keo phèn Dưới da 2ml 4Log2 + TN4 Keo phèn Dưới da 2ml 4Log2 + TN5 Keo phèn Dưới da 2ml 4Log2 + Trung bình 3,60 Log2 ± 0,55 TN6 Nhũ dầu Bắp 2ml 4Log2 + TN7 Nhũ dầu Bắp 2ml 4Log2 + TN8 Nhũ dầu Bắp 2ml 4Log2 + TN9 Nhũ dầu Bắp 2ml 4Log2 + 10 TN10 Nhũ dầu Bắp 2ml 5Log2 + Trung bình 4,20 Log2 ± 0,55 11 TN11 Nước thịt Dưới da 2ml - - 12 TN12 Nước thịt Dưới da 2ml - - 13 TN13 Nước thịt Dưới da 2ml - - 4.3.4 K tăqu ăxácăđ nhăli uătiêmăvacxinăviêmăph iăl n Nhằm xác định liều tiêm vacxin viêm phổi lợn phù hợp để có hiệu lực bảo hộ đàn lợn sau tiêm vacxin cao có độ dài miễn dịch dài sau: Lơ lợn thí nghiệm gồm 15 con, chia làm nhóm khác nhau, nhóm lợn thí nghiệm có lợn 21 B ng 4.21 K t qu xácăđ nh kháng th l n tiêm vacxin v i li u tiêm khác K t qu xácăđ nh hi u giá kháng th M u HT Tr c tiêm vacxin Sau tiêm vacxin A pleuropneumoniae P multocida S suis KT1 KT2 - 5Log2 5Log2 5Log2 5Log2 5Log2 5Log2 KT3 - 5Log2 5Log2 5Log2 KT4 - 5Log2 5Log2 5Log2 KT5 - 5Log2 5Log2 5Log2 KT6 - 5Log2 5Log2 6Log2 KT7 KT8 KT9 - 5Log2 5Log2 6Log2 5Log2 6Log2 6Log2 5Log2 5Log2 5Log2 10 11 12 13 14 KT10 KT11 KT12 KT13 KT14 - 6Log2 6Log2 7Log2 6Log2 6Log2 6Log2 6Log2 6Log2 6Log2 7Log2 6Log2 6Log2 6Log2 7Log2 6Log2 15 KT15 - 6Log2 6Log2 6Log2 Kết cho thấy: nhóm (KT1-KT5) tiêm mũi với liều tiêm 2ml/con, Lợn nhóm (KT6-KT10): tiêm mũi với liều tiêm 1ml/con, cách ngày Lợn nhóm (KT11-KT15): tiêm mũi với liều tiêm 2ml/con, cách ngày, sau tiêm vacxin tháng, hiệu giá kháng thể kháng vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida S suis cao so với nhóm đạt hiệu giá từ 6Log2 đến 7Log2 Như đánh giá liều tiêm vacxin cho lợn đạt hiệu lực bảo hộ cao tiêm vacxin viêm phổi lợn mũi, với liều tiêm 2ml/con /mũi cách ngày, tiêm da sau hốc tai 4.3.4 K tăqu ăxơyăd ngăquyătrìnhăs năxu tăvacxinăđaăgiáăvơăho tăb ătr ănhǜăd uă phòngăb nhăviêmăph iă ăl n Trên kết nghiên cứu chế tạo đánh giá chất lượng vacxin đa giá vơ hoạt bổ trợ nhũ dầu phịng bệnh viêm phổi cho lợn vi khuẩn A pleuropneumoniae; P multocida S suis gây lợn lứa tuổi khác nhau, xây dựng quy trình sản xuất vacxin đa giá vơ hoạt có bổ trợ nhũ dầu tóm tắt trang sau 22 Tóm tắt quy trình sản xuất vacxin viêm phổi đa giá bổ trợ nhũ dầu Ghi chú: - TW: Tryptone Water - TYE: Tryptone Yeast Extract Broth - PLLO: Pleuropneumonia-like organism - TSB: Tryptic Soy Broth - BHI: Brain Heart Infusion - THB: Todd Hewitt Broth 4.3.5 K tă qu ă xơyă d ngă quyă trìnhă s ă d ngăvacxină đaăgiáăvơă ho tăb ătr ănhǜă d uă phịngăb nhăviêmăph iăchoăl n Trên kết nghiên cứu sử dụng vacxin phòng bệnh viêm phổi lợn thực địa, xây dựng quy trình sử dụng vacxin phịng bệnh viêm phổi lợn vi khuẩn A pleuropneumoniae; P multocida Streptococcus suis gây Vacxin viêm phổi tiêm bắp thịt với liều lượng sau: + Lợn từ 21 ngày tuổi, sau cai sữa: tiêm lần với mũi tiêm nhất: 2ml/con + Lợn nái chửa: năm tiêm lần, lần tiêm cần tiêm mũi khác nhau: Mũi 1: 2ml/con, tiêm cho lợn nái chửa trước đẻ tháng; Mũi 2: 2ml/con, sau mũi 1: 7- 10 ngày + Lợn đực giống: năm tiêm lần, mũi tiêm ml/con 23 PH Nă5.ăK TăLU NăVẨăĐ ăNGH 5.1 K TăLU N Dựa kết thu luận án, chúng tơi có kết luận sau: 1) Lợn thí nghiệm gây bệnh chủng vi khuẩn có giống sử dụng sản xuất vacxin gồm: vi khuẩn A pleuropneumoniae serotype 2, 5; vi khuẩn P multocida serotype A, D S suis serotype xuất triệu chứng lâm sàng, bệnh tích đại thể điển hình lợn mắc bệnh viêm phổi vi khuẩn gây cho lợn thực tiễn 2) Bộ giống vi khuẩn sử dụng sản xuất vacxin (Master seed) bao gồm chủng A pleuropneumoniae, chủng P multocida chủng S suis lưu giữu dạng đông khô nhiều nam hồn tồn ổn định đặc tính sinh học, cấu trúc kháng nguyên, cấu trúc gen, kháng nguyên tính yếu tố độc lực chúng Các chủng vi khuẩn lựa chọn làm master seed đảm bảo để sản xuất vacxin vơ hoạt nhũ dầu phịng bệnh viêm phổi cho lợn 3) Sử dụng giống gốc vi khuẩn (Master seed) kiểm tra để sản xuất thành cơng vacxin đa giá vơ hoạt có bổ bổ trợ nhũ dầu (IMS 1313) phòng bệnh viêm phổi lợn - Vacxin kiểm nghiệm đạt chất lượng tốt Hiệu lực phòng bệnh vacxin chế tạo thử nghiệm lợn với phương pháp công cường độc đạt tỷ lệ bảo hộ 80,0% đạt tỷ lệ an toàn 100,0% lợn tuần tuổi thử nghiệm thực địa Vacxin gây đáp ứng miễn dịch tốt Lợn sau tiêm vacxin tháng, hiệu giá kháng thể huyết đạt ≥ 1/16 (4log2), đảm bảo kháng lại vi khuẩn A pleuropneumoniae serotype 2, 5a, 5b; P multocida serotype A, D S suis serotype gây viêm phổi lợn Vacxin đa giá vơ hoạt bổ trợ nhũ dầu kích thích lợn sản sinh kháng thể kháng loại vi khuẩn tốt so với vacxin đa giá vô hoạt bổ keo phèn - Đã xây dựng hoàn thiện quy trình sản xuất, quy trình sử dụng bảo quản vacxin đa giá vơ hoạt nhũ dầu phịng bệnh viêm phổi lợn loại vi khuẩn gây 5.2 Đ ăNGH 1) Tiếp tục thử nghiệm vacxin đa giá vô hoạt với bổ trợ nhũ dầu (IMS 1313) phòng viêm phổi lợn diện rộng nhằm đánh giá hiệu lực độ dài miễn dịch vacxin vô hoạt nhũ dầu lần chế tạo Việt Nam 2) Khi đạt kết tốt, đề nghị cho phép sử dụng vacxin vô hoạt nhũ dầu (IMS 1313) phòng bệnh viêm phổi lợn đực lợn nái sở lợn giống phạm vi tồn quốc 24 DANH MỤC CỌNG TRÌNH CỌNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LU N ÁN Cù Hữu Phú, Đỗ Tất Đạt & Lương Thị Hương Giang (2019) So sánh chất lượng vacxin đa giá vô hoạt bổ trợ keo phèn bổ trợ nhũ dầu chế tạo phịng bệnh viêm phổi cho lợn Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y Tập XXVI, số 2, 2019 tr 40 Đỗ Tất Đạt, Cù Hữu Phú & Nguyễn Bá Hiên (2019) Chế tạo vacxin đa giá vô hoạt nhũ dầu phòng bệnh viêm phổi lợn vi khuẩn Actinobacillus pleuropneumoniae, Pasteurella multocida Streptococcus suis gây Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam Tập 15, số 5, 2019 tr 351 ... số đặc điểm bệnh lý lợn mắc viêm phổi A pleuropneumoniae, P multocida S suis sử dụng vacxin phòng chống bệnh yêu cầu cần thiết, nhằm đưa giải pháp phòng trị bệnh viêm phổi lợn hiệu cao, giảm thiệt... chăn nuôi lợn 1.2 M CăTIểUăC AăĐ ăTẨI 1.2.1 M cătiêuăchung Nghiên cứu số đặc điểm bệnh lý xây dựng giải pháp phòng chống bệnh viêm phổi lợn vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida S suis vacxin. .. Xác định đặc điểm biến đổi bệnh lý chủ yếu lợn mắc bệnh viêm phổi vi khuẩn A pleuropneumoniae, P multocida S suis gây - Xây dựng quy trình sản xuất quy trình sử dụng, bảo quản vacxin viêm phổi đa