xây dựng quy trình xác định hla b bằng phƣơng pháp giải trình tự kết hợp với tạo dòng

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT (TÓM TẮT) ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH HLA-B BẰNG PHƢƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ KẾT HỢP VỚI TẠO DÒNG Mã số: Chủ nhiệm đề tài: TS.BS ĐỖ ĐỨC MINH Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2018 BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT (TĨM TẮT) ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH HLA-B BẰNG PHƢƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ KẾT HỢP VỚI TẠO DÒNG Mã số: Chủ nhiệm đề tài: TS.BS ĐỖ ĐỨC MINH Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2018 DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU VÀ NƠI THỰC HIỆN ĐỀ TÀI Danh sách thành viên tham gia nghiên cứu: STT Họ tên Chuyên ngành Cơ quan công tác Lê Gia Hoàng Linh Y sinh học phân tử ĐH Y Dược TP.HCM Mai Phương Thảo Sinh lý học ĐH Y Dược TP.HCM Đỗ Đức Minh Y sinh học phân tử ĐH Y Dược TP.HCM Nơi thực đề tài: Đại học Y Dược TPHCM MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG A MỞ ĐẦU I TỔNG QUAN ĐỀ TÀI II ĐỐI TƢỢNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu Phƣơng pháp nghiên cứu B KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 13 I KẾT QUẢ 13 II BÀN LUẬN 19 C KẾT LUẬN 20 D TÀI LIỆU THAM KHẢO 21 DANH MỤC BẢNG BIỂU, HÌNH DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng Cặp mồi đƣợc sử dụng để khuếch đại trình tự exon 2, vùng lân cận gen HLA-B 10 Bảng Cặp mồi đƣợc sử dụng để giải trình tự trình tự exon 2, vùng lân cận gen HLA-B 12 Bảng Kết định típ HLA-B 20 đối tƣợng tham gia nghiên cứu 16 DANH MỤC HÌNH Hình Vị trí locus HLA nhiễm sắc thể số Hình Cấu trúc phân tử HLA lớp I lớp II Hình Kết PCR khuếch đại exon 2,3 vùng lân cận gen HLA-B 13 Hình Kết HLA-B đồng hợp tử 14 Hình Kết HLA-B dị hợp tử 14 Hình Các khúm vi khuẩn xanh trắng mọc thạch LB 15 Hình Sản phẩm PCR lần 15 Hình Các kết trình tự trƣớc sau tạo dòng 16 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ Giải nghĩa HLA Human leukocyte antigen Phức hợp kháng nguyên bạch cầu người TCR T-cell receptor PCR Polymerase chain reaction DNA Deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid SSO-PCR Sequence-specific oligonucleotide PCR SSP-PCR Sequence-specific primer PCR EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid NCBI The National Center for Biotechnology Information IMGT The I nternational Immunogenetic system EBI European Bioinformatics Institute Thụ thể tế bào T THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG Thông tin chung: - Tên đề tài: Xây dựng quy trình xác định HLA-B phương pháp giải trình tự kết hợp với tạo dịng - Mã số: - Chủ nhiệm đề tài: TS.BS Đỗ Đức Minh Điện thoại: 0932 999989 - Email: ducminh@ump.edu.vn - Đơn vị quản lý chuyên môn: Trung tâm Y sinh học phân tử - Thời gian thực hiện: Từ 07/2016 đến 03/2018 Mục tiêu: Xây dựng quy trình kỹ thuật xác định HLA-B phương pháp giải trình tự kết hợp với tạo dịng Nội dung chính: - Thu thập mẫu máu ngoại vi 20 người tình nguyện để định típ HLA-B - Định típ HLA-B: o Tiến hành PCR exon 2,3 đoạn intron lân cận gen HLA-B o Giải trình tự phương pháp Sanger đoạn gen PCR o Tạo dòng mẫu HLA-B dị hợp tử o So sánh trình tự thu với liệu HLA-B IMGT, EBI Kết đạt đƣợc: - Xây dựng phương pháp định típ HLA-B độ phân giải chữ số A MỞ ĐẦU I TỔNG QUAN ĐỀ TÀI Hệ thống phức hợp kháng nguyên bạch cầu người (HLA: Human leukocyte antigen) hệ thống protein bề mặt hầu hết tế bào thể, mã hóa từ locus gen nằm nhánh ngắn nhiễm sắc thể số (hình 1), chúng đóng vai trị quan trọng đáp ứng miễn dịch, giúp hệ thống miễn dịch thể phân biệt tế bào thể tế bào ngoại lai để từ cơng tế bào lạ xâm nhập Hình 1: Vị trí locus HLA nhiễm sắc thể số Các gen mã hóa cho hệ thống HLA chia thành lớp chính, chủ yếu lớp I (HLA-A, HLA-B HLA-C) lớp II (HLA-DRB1 HLA-DQB1) tham gia vào trình tương tác mảnh ghép kí chủ HLA lớp I diện bề mặt hầu hết tế bào có nhân thể với mức độ biểu khác nhau, cấu trúc chúng bao gồm chuỗi nặng với tiểu đơn vị α (α1, α2 α3) chuỗi nhẹ β2-microglobulin (hình 2) Nhiệm vụ chúng trình diện peptide nội bào tế bào thể bị nhiễm virus tế bào khiếm khuyết, bất thường cho tế bào lympho T CD8 thông qua thụ thể tế bào T (TCR: T cell receptor) dẫn đến hiệu cuối phá hủy tế bào (thường thông qua chế gây độc tế bào) Trong đó, HLA lớp II thường biểu giới hạn tế bào hoạt hóa miễn dịch, bao gồm tế bào B tế bào trình diện kháng nguyên khác (APC: antigen-presenting cells), cấu tạo chúng bao gồm chuỗi α (có tiểu đơn vị α1, α2) β (có tiểu đơn vị β1 β2) (hình 2) với nhiệm vụ trình diện peptide ngoại lai từ tác nhân gây bệnh cho tế bào lympho T CD4 sau tế bào T hoạt hóa tế bào B sản sinh hàng loạt kháng thể trung hòa tác nhân gây bệnh Trên phân tử HLA có vùng nhận diện, cấu trúc protein vùng nhận diện thường khác biệt cá thể sở để định típ HLA Vùng nhận diện mã hóa từ exon 2, gen HLA lớp I exon gen HLA lớp Hình 2: Cấu trúc phân tử HLA lớp I lớp II Với vai trò quan trọng việc nhận diện miễn dịch, gen HLA có tính đa hình cao thơng qua q trình tiến hóa lồi người để đảm bảo vi sinh vật, tế bào lạ tế bào bất thường xâm nhập thể bị tiêu diệt (do bất tương hợp HLA)[4], tính đa hình chủ yếu quy định biến thể nằm exon gen HLA lớp I exon gen HLA lớp II (do exon mã hóa cho vùng nhận diện phân tử HLA) Khi tiến hành cấy ghép, không dung hợp HLA dẫn đến nhiều biến chứng thải ghép (tối cấp, cấp tính, mạn tính), mảnh ghép chống kí chủ…biến chứng nặng nề dẫn đến nguy tử vong, ra, dung hợp HLA cao liều thuốc ức chế miễn dịch hạn chế mức thấp nhất[1] Ngày nay, có khoảng 14.000 biến thể HLA phát số lượng dự kiến tăng dần tương lai, số này, số gen HLA có hàng trăm alen, chẳng hạn HLA-B27[6] Trước việc ngày có nhiều alen tìm ra, Tổ chức y tế giới có phiên đồng thuận để đưa danh pháp cụ thể cho đời khái niệm độ phân giải HLA Độ phân giải quy định sau:  Độ phân giải thấp chữ số (ví dụ: HLA-B 38) dùng để nhóm alen có cấu trúc protein tương tự  Độ phân giải chữ số (ví dụ: HLA-B 38:01) để nhóm alen mã hóa trình tự protein vùng nhận diện HLA (có trình tự exon 2,3 HLA lớp I exon HLA lớp II)  Độ phân giải chữ số (ví dụ: HLA-B 38:01:01) để nhóm alen HLA có trình tự tất exon  Độ phân giải chữ số độ phân giải lớn (ví dụ: HLA- B 38:01:01:01) dùng để phân biệt alen với (đồng trình tự tất exon intron) Hiện Việt Nam, việc ghép tủy ghép tạng khơng cịn điều q xa lạ Trong khoảng hai thập kỉ gần đây, việc ghép tế bào gốc tạo máu xem lựa chọn hàng đầu để điều trị khỏi hoàn tồn bệnh lý huyết học ác tính Bên cạnh đó, trình độ ghép tạng Việt Nam gần tiệm cận giới, ca ghép tim phổi xuyên Việt thành công vừa qua minh chứng rõ cho điều Để phát triển tồn diện kỹ thuật ghép tạng, cần phát triển đồng kỹ thuật chẩn đốn chăm sóc bệnh nhân chu phẫu mà định típ HLA bước quan trọng để chuẩn bị bệnh nhân trước ghép nhằm tiên lượng nguy sau ghép xảy Tuy có vai trị quan trọng, kỹ thuật định típ HLA Việt Nam dùng phương pháp khuếch đại DNA chuỗi mồi đặc hiệu (SSP-PCR: sequence-specific primer polymerase chain reaction SSO-PCR: sequence-specific oligonucleotide polymerase chain reaction) Hai kỹ thuật có nguyên lý tương tự phát minh vào khoảng 20 năm trước Trong phản ứng SSP-PCR, mồi (primer) thiết kế sẵn để nhận diện vùng đa hình locus HLA, típ HLA sau xác định cách điện di sản phẩm PCR thạch agarose, phương pháp cho độ phân giải HLA mức chữ số Phương pháp SSO-PCR đại hơn, có độ phân giải cao đạt mức chữ số, dựa tảng thực phản ứng PCR mồi thiết kế sẵn, sau sản phẩm PCR khơng phân tích thạch agarose mà chuyển lên màng lai, phân tử đầu dị oligonucleotide có gắn chất thị lai với sản phẩm PCR sau típ HLA xác định dựa vào chất thị gắn đầu dị Các kỹ thuật định típ HLA cịn nhiều nhược điểm:  Độ phân giải thấp (2-4 chữ số)  Tốn thời gian (một lần phản ứng SSO-PCR xác định locus HLA)  Không phát dễ nhầm lẫn trường hợp bệnh nhân mang alen HLA hiếm,  Ngày có nhiều alen HLA phát hiện, kit cần cập nhật liên tục Trong đó, giới, việc định típ HLA dựa chủ yếu vào phương pháp xác định trình tự nucleotid phương pháp Sanger giải trình tự hệ (SBT: sequence-based typing) với độ phân giải chấp nhận lâm sàng chữ số, xem phương pháp xác đáng tin cậy tiêu chuẩn vàng việc xác định HLA trung tâm cấy ghép lớn[5] Có phương pháp giải trình tự để định típ HLA giải trình tự Sanger truyền thống giải trình tự hệ Trong phương pháp giải trình tự Sanger, exon gen HLA lớp I II khuếch đại giải trình tự với cặp mồi tham khảo từ nghiên cứu trước đó[3] Kết giải trình tự Sanger gen dễ phân tích định típ HLA locus trạng thái đồng hợp tử Tuy nhiên, tính đa hình phức tạp locus HLA, phương pháp giải trình tự Sanger đơn khơng xác định típ HLA trường hợp cá thể mang alen HLA dị hợp tử, đó, sản phẩm PCR dùng để giải trình tự Sanger tạo dịng, chuyển alen vào véc tơ vi khuẩn sau giải trình tự đoạn gen tạo dịng (giải trình tự lần 2) Qua lần giải trình tự Sanger giúp xác định xác hai alen HLA dị hợp tử locus Tỉ lệ locus cần phải tạo dịng giải trình tự lần thay đổi tùy thuộc vào dân số tần suất alen HLA lưu hành dân số đó[3] Hiện Việt Nam, cơng trình nghiên cứu HLA hầu hết dừng mức độ phân giải thấp sử dụng phương pháp SSO-PCR Do đó, thơng qua nghiên cứu này, muốn tiến hành nghiên cứu áp dụng quy trình xác định phức hợp HLA phương pháp giải trình tự với độ phân giải chữ số nhằm khắc phục nhược điểm phương pháp PCR truyền thống, từ đó, hồn tồn tự chủ cơng nghệ để phục vụ cho nhu cầu ghép tủy ghép tạng nước bước việc xây dựng ngân hàng liệu tủy xương, tạng thư viện HLA quần thể người Việt Nam nhằm phục vụ cho nhu cầu cấy ghép tương lai II ĐỐI TƢỢNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu: Chúng tơi tiến hành định típ HLA locus B cho 20 người tình nguyện tham gia nghiên cứu 2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.1 Tách chiết DNA gene: Tiến hành lấy ml máu tĩnh mạch, cho vào ống chống đơng có EDTA, lắc nhẹ nhàng Genomic DNA tế bào bạch cầu máu tồn phần tách chiết vịng 24 kit GeneJetTM whole blood genomic DNA purification (Thermo Scientific, Mỹ) theo hướng dẫn sử dụng nhà sản xuất cụ thể sau: Quá trình ly giải: Đệm ly giải chứa muối chaotropic có tác dụng ly giải màng tế bào, biến tính protein, DNA đại phân tử khác, bất hoạt nuclease, thúc đẩy q trình gắn acid nucleic vào silic Ngồi ra, có mặt enzyme (proteinkinase lysozyme) làm tăng hiệu hịa tan protein q trình ly giải Gắn DNA vào cột: sử dụng ethanol giúp gắn DNA vào cột Rửa DNA: loại bỏ thành phần protein, polysaccharide muối Làm khô loại ethanol: ethanol ảnh hưởng đến hiệu suất tách chiết nên bị loại bỏ ly tâm làm khô cột Giải DNA khỏi cột: ủ dung dịch rửa giải chứa Tris-HCl 10mM (pH = - 9) màng vài phút trước ly tâm thu DNA 2.2 Xác định nồng độ DNA phương pháp đo quang phổ Nguyên tắc phương pháp đo quang phổ: Các acid nucleic dung dịch hấp thụ ánh sáng tia cực tím dải từ 210 nm đến 300 nm với độ hấp thụ cực đại 260 nm Dựa vào hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại bước sóng 260 nm 280 nm base purin pyrimidin Các mẫu DNA lưu trữ nhiệt độ -200C phân tích 2.3 Phản ứng PCR khuếch đại giải trình tự gen mục tiêu: Kỹ thuật PCR dựa đặc điểm trình chép gen tế bào: có diện nucleotide, enzyme DNA polymerase tổng hợp mạch DNA bổ sung với mạch đầu 3'-OH trống Về nguyên tắc, chu kỳ nhiệt bao gồm giai đoạn: - Biến tính: nhiệt độ đưa lên 94 °C, nhiệt độ liên kết hydro mạch đôi DNA bị đi, DNA bị biến tính thành mạch đơn - Bắt cặp: Nhiệt độ hạ đến 55 - 65 °C nhiệt độ thích hợp để đoạn mồi tìm đến bắt cặp bổ sung vào hai đầu đoạn DNA đích - Kéo dài: Nhiệt độ đưa lên 72 °C nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính enzyme Taq polymerase để kéo dNTP lại đầu 3' đoạn mồi bắt cặp đầu 5' sợi DNA đích để bắt nguồn cho tổng hợp nên mạch bổ sung Tiến trình lặp lại nhiều lần Sau chu kì, số lượng DNA tăng gấp đôi, tạo thành hiệu ứng khuếch đại Nếu số lượng chu kỳ 30 - 40 lần từ DNA đích nhân thành 230 đến 240 Cặp mồi thiết kế tổng hợp (IDT, Mỹ) dựa trình tự DNA gen HLA-B mang mã số NG_023187 kho liệu NCBI tham khảo từ tác giả Lazaro[3] Tên mồi Trình tự chuỗi (5’-3’) Đoạn gen Tm khuếch (0C) đại 5UT-F Bin3M13-R GACTCAGAATCTCCTCAGACGC Exon 2, CGA vùng GGCCATCCCCGGCGACCTAT lân cận 61.5 64.5 (1073 bp) Bảng 1: Cặp mồi đƣợc sử dụng để khuếch đại trình tự exon 2, vùng lân cận gen HLA-B Thiết lập điều kiện cho PCR khuếch đại tương ứng với mồi: Mỗi tube PCR tích 15µl chứa thành phần: 1,5μl PCR buffer 10X; 1,5μl dNTP 2,5mM; 0,75μl cho mồi xuôi ngược (10nM/μl), 0,1μl TaKaRa TaqTM HotStart Polymerase (Takara, Nhật Bản), 2μl genomic DNA (20-50ng/μl) 8,4μl nước cất lần khử ion Các phản ứng kèm theo chứng âm không chứa DNA để kiểm sốt ngoại nhiễm Chu trình ln nhiệt cho PCR thực máy Mastercycler@Pro S (Eppendorf, Đức) Chu kỳ nhiệt: khởi đầu 980 C phút, với 40 chu kỳ lặp lại bước 980C: 20 giây, 620C: 20 giây, 720C: phút; với bước 720C: phút Trữ sản phẩm PCR 40C Kiểm tra sản phẩm PCR điện di gel agarose 2% nhuộm Diamond™ Nucleic Acid Dye (PromegaMỹ) 2.4 Kỹ thuật điện di Kỹ thuật điện di sử dụng để phân tích đại phân tử tích điện Dựa vào đặc tính phân tử (DNA, RNA) mang điện tích âm, tác động dịng điện phân tử di chuyển từ cực âm (cathode) sang cực dương (anode) DNA phân tách phương pháp điện di dựa điện tích phân tử lượng 2.5 Kỹ thuật giải trình tự Sản phẩm PCR sau tinh Exosap-IT glycerol solution (AffymetrixMỹ) theo hướng dẫn sử dụng nhà sản xuất thực phản ứng cycle sequencing với BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems, Mỹ) cặp mồi bên Sản phẩm sau kết tủa ethanol, hịa tan Hi-Di formanide, biến tính 95C trước làm lạnh đột ngột Trình tự DNA đọc máy ABI 3130 Genetic Analyzer, với POP-7 polymer capillary 50 cm (Applied Biosystems, Mỹ) Kết giải trình tự DNA phân tích phần mềm CLC Main Workbench Tên mồi Trình tự chuỗi (5’-3’) Vị trí đọc Seq-BIn2-R GGA TCT CGG ACC CGG AG Chiều ngược, Exon Bin3M13-R GGCCATCCCCGGCGACCTAT Chiều ngược, Exon Bảng 2: Cặp mồi đƣợc sử dụng để giải trình tự trình tự exon 2, vùng lân cận gen HLA-B 2.6 Thực chuyển gen: Các mẫu sau giải trình tự so với trình tự chuẩn từ kho liệu NCBI Blast server, hla.org IMGT Blast EBI để xác định allel HLA-B đối tượng tham gia nghiên cứu Với mẫu có allel HLA-B dị hợp tử khó xác định, chúng tơi sử dụng phương pháp tạo dịng chuyển alen vào vector plasmid Sản phẩm PCR nhân dòng trực tiếp vào vector pGEM-T dạng mạch thẳng có đầu dính T (theo kit pGEM®-T Easy Vector Systems-Promega, Mỹ) Sản phẩm nhân dòng nhiệt biến nạp vào tế bào khả biến E coli DH5, plasmid mang gen lacZ giúp chọn lọc khuẩn lạc có gen chèn dựa chọn lọc màu sắc trắng/xanh khuẩn lạc môi trường nuôi cấy chứa X-gal, IPTG Ampicillin Plasmid tái tổ hợp tách từ khuẩn lạc trắng kit PureYieldTM Plasmid Miniprep System (Promega, Mỹ) kiểm tra có mặt gen HLA-B PCR với cặp mồi 5UT-F Bin3M13-R với thể tích chu trình ln nhiệt bước Sản phẩm PCR từ plasmid giải trình tự cặp mồi từ bảng đọc kết phần mềm CLC Main Workbench Kết giải trình tự lần có kết đồng hợp tử, dựa vào kết lần giải trình tự giúp xác định alen dị hợp tử gen HLA-B 2.7 Thực so sánh kết sử dụng phần mềm BLAST EBI: Phần mềm HLA BLAST EBI phần mềm online miễn phí truy cập vào địa https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/blast.html Sau truy cập lựa chọn chế độ so sánh cần thiết, tồn trình tự DNA exon mẫu nhập vào hệ thống Ngưỡng xác định (%identities) mức độ dương tính (%positive) mẫu phải đạt 100% chấp nhận phân típ HLA-B B KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN I KẾT QUẢ Phản ứng PCR khuếch đại exon 2,3 vùng lân cận gen HLA-B cho sản phẩn có hình ảnh kích thước với thiết kế ban đầu điện di gel agarose 1% (hình 3) Hình 3: Kết PCR khuếch đại exon 2,3 vùng lân cận gen HLA-B Kết giải trình tự 20 mẫu cho thấy có 14 mẫu đồng hợp tử phân tích tiếp tục hệ thống BLAST EBI (hình 4), cịn lại mẫu dị hợp tử tiến hành tạo dịng (hình 5) Hình 4: Kết HLA-B đồng hợp tử Hình 5: Kết HLA-B dị hợp tử Sau chuyển alen HLA-B vào vector DNA tiến hành nhiệt biến nạp vào tế bào khả biến E coli DH5, tế bào khả biến ủ nuối cấy môi trường thạch LB qua đêm nhiệt độ 370C Các tế bào tạo khúm thạch LB hình Chỉ có khúm tế bào màu trắng chọn để tiếp tục tiến hành ly trích DNA sau Hình 6: Các khúm vi khuẩn xanh trắng mọc thạch LB DNA ly trích từ khúm vi khuẩn màu trắng dùng làm khuôn để thực phản ứng PCR lần khuếch đại đoạn gen HLA-B chèn vào vector plasmid với cặp mồi bảng cho kết phù hợp với dự đốn, băng DNA khuếch đại có kích thước khoảng 1000bp (hình 7) Hình 7: Sản phẩm PCR lần Kết qủa giải trình tự lần mẫu tạo dịng cho sóng đơn dạng đồng hợp tử (hình 8) Hình 8: Các kết trình tự trƣớc sau tạo dòng Phối hợp hai lần giải trình tự giúp xác định alen HLA-B di hợp tử Kết alen HLA-B 20 mẫu tham gia nghiên cứu tóm tắt bảng TT Trạng thái Alen Alen %ID %Positive Đồng hợp tử 40:130 X 100 100 Đồng hợp tử 15:02, 15:214, X 100 100 X 100 100 X 100 100 X 100 100 15:302, 15:358 Đồng hợp tử 37:01, 37:23, 37:43, 37:45, 37:46, 37:47, 37:68 Đồng hợp tử 15:01, 15:102, 15:104, 15:140, 15:146, 15:201, 15:227, 15:228, 15:247, 15:320, 15:321 Đồng hợp tử 40:01, 40:141, 40:150, 40:151, 40:179, 40:221, 40:236, 40:241, 40:247, 40:264, 40:272 Đồng hợp tử 46:01, 46:15, X 100 100 X 100 100 46:24, 46:34, 46:38, 46:39, 46:56, 46:57 Đồng hợp tử 13:01, 13:52, 13:61 Đồng hợp tử 38:02, 38:18 X 100 100 Đồng hợp tử 35:01, 35:40, X 100 100 X 100 100 35:42, 35:57, 35:94, 35:134, 35:161, 35:227, 35:241, 35:245, 35:250, 35:332, 35:336, 35:347, 35:348, 35:359 10 Đồng hợp tử 38:01, 38:57, 38:68 11 Đồng hợp tử 38:02, 38:18 X 100 100 12 Đồng hợp tử 38:02, 38:18 X 100 100 13 Đồng hợp tử 40:130 X 100 100 14 Đồng hợp tử 40:130 X 100 100 15 Dị hợp tử 13:02, 13:82, 38:02, 38:18 100 100 13:38, 13:55, 13:69, 13:81, 13:84, 13:93, 13:96, 13:99 16 Dị hợp tử 38:02, 38:18 08:116 100 100 17 Dị hợp tử 56:01, 56:24, 38:02, 38:18 100 100 15:01, 100 100 38:02, 38:18 100 100 38:02, 38:18 100 100 56:40, 56:55 18 Dị hợp tử 38:02, 38:18 15:102, 15:104, 15:140, 15:146, 15:201, 15:227, 15:228, 15:247, 15:320, 15:321 19 Dị hợp tử 40:01, 40:141, 40:150, 40:151, 40:179, 40:221, 40:236, 40:241, 40:247, 40:264, 40:272 20 Dị hợp tử 35:01, 35:40, 35:42, 35:57, 35:94, 35:134, 35:161, 35:227, 35:241, 35:245, 35:250, 35:332, 35:336, 35:347, 35:348, 35:359 Bảng 3: Kết định típ HLA-B 20 đối tƣợng tham gia nghiên cứu II BÀN LUẬN: Trong nghiên cứu này, xây dựng hồn chỉnh phương pháp định típ HLA-B phương pháp giải trình tự kết hợp với tạo dịng Như chúng tơi dự đốn ban đầu, việc định típ HLA kỹ thuật giải trình tự giúp xác định nhiều alen chưa mô tả người Việt Nam trước so với phương pháp PCR truyền thống Trong nghiên cứu trước mô tả alen HLA-B người Việt Nam, alen HLA-B 08:116, 13:82, 13:38, 13:55, 13:52, 13:61, 13:69, 13:81, 13:84, 13:93, 13:96, 13:99, 15:102, 15:104, 15:140, 15:146, 15:201, 15:227, 15:228, 15:247, 15:320, 15:321, 15:214, 15:302, 15:358, 35:40, 35:42, 35:57, 35:94, 35:134, 35:161, 35:227, 35:241, 35:245, 35:250, 35:332, 35:336, 35:347, 35:348, 35:359, 37:23, 37:43, 37:45, 37:46, 37:47, 37:68, 38:57, 38:68, 40:130, 40:141, 40:150, 40:151, 40:179, 40:221, 40:236, 40:241, 40:247, 40:264, 40:272, 46:15, 46:24, 46:34, 46:38, 46:39, 46:56, 46:57, 40:130, , 56:24, 56:40, 56:55 chưa đề cập[2] Định típ HLA kỹ thuật giải trình tự Sanger có ưu điểm có khả xác định alen hiếm, có điểm giới hạn khó xác định cụ thể típ HLA dựa vào trình tự exon mà cịn cần phải có trình tự exon intron cịn lại để định típ HLA xác trước xu hướng ngày có nhiều alen mô tả đưa vào liệu IMGT Việc tiếp tục xác định trình tự exon intron cịn lại phương pháp giải trình tự Sanger cần nhiều thời gian cơng sức, cần phải có phương pháp có khả gỉai trình tự hàng loạt, đồng thời exon intron phương pháp giải trình tự hệ xem ứng cử viên phù hợp cho việc định típ HLA tương lai C KẾT LUẬN: Chúng xây dựng thành công quy trình kỹ thuật định típ HLA locus B kỹ thuật giải trình tự DNA kết hợp với tạo dịng D TÀI LIỆU THAM KHẢO: Aydingoz SE, Takemoto SK, Pinsky BW, Salvalaggio PR, Lentine KL, Willoughby L, Hoover B, Burroughs TA, Schnitzler MA, Graff R (2007) The impact of human leukocyte antigen matching on transplant complications and immunosuppression dosage Hum Immunol 68(6):491–499 Hoa BK, Hang NTL, Kashiwase K, et al (2008) HLA-A, -B, -C, -DRB1 and -DQB1 alleles and haplotypes in the Kinh population in Vietnam Tissue Antigens 71(2):127– 134 Lazaro A, Tu B, Yang R, Xiao Y, Kariyawasam K, Ng J, Hurley CK (2013) Human leukocyte antigen (HLA) typing by DNA sequencing Methods Mol Biol Clifton NJ 1034:161–195 Mosaad YM (2015) Clinical Role of Human Leukocyte Antigen in Health and Disease Scand J Immunol 82(4):283–306 Sanchez-Mazas A, Vidan-Jeras B, Nunes JM, et al (2012) Strategies to work with HLA data in human populations for histocompatibility, clinical transplantation, epidemiology and population genetics: HLA-NET methodological recommendations Int J Immunogenet 39(6):459–476 IMGT/HLA Introduction < IMGT/HLA < IPD < http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/intro.html Accessed 24 Oct 2016 EMBL-EBI  ... gen HLA- B o Giải trình tự phương pháp Sanger đoạn gen PCR o Tạo dòng mẫu HLA- B dị hợp tử o So sánh trình tự thu với liệu HLA- B IMGT, EBI Kết đạt đƣợc: - Xây dựng phương pháp định típ HLA- B độ.. .B? ?? Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP HỒ CHÍ MINH B? ?O CÁO TỔNG KẾT (TÓM TẮT) ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH HLA- B BẰNG PHƢƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ KẾT HỢP VỚI TẠO DÒNG... tiêu: Xây dựng quy trình kỹ thuật xác định HLA- B phương pháp giải trình tự kết hợp với tạo dịng Nội dung chính: - Thu thập mẫu máu ngoại vi 20 người tình nguyện để định típ HLA- B - Định típ HLA- B: