Đang tải... (xem toàn văn)
TÀI LIỆU TRẮC NGHIỆM, BÀI GIẢNG PPT CÁC MÔN CHUYÊN NGÀNH Y DƯỢC HAY NHẤT CÓ TẠI “TÀI LIỆU NGÀNH Y DƯỢC HAY NHẤT” ;https://123doc.net/users/home/user_home.php?use_id=7046916. TÀI LIỆU LUẬN VĂN – BÁO CÁO – TIỂU LUẬN (NGÀNH Y DƯỢC). DÀNH CHO SINH VIÊN CÁC TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC VÀ CÁC TRƯỜNG KHÁC, GIÚP SINH VIÊN HỆ THỐNG, ÔN TẬP VÀ HỌC TỐT KHI HỌC TÀI LIỆU LUẬN VĂN – BÁO CÁO – TIỂU LUẬN (NGÀNH Y DƯỢC)
TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP & TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN BÀI BÁO CÁO THỰC HÀNH MÔN VIRUS HỌC CHUN NGÀNH CƠNG NGHỆ SINH HỌC Khóa học: GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN An Giang Bài I KỸ THUẬT TIÊM TRỨNG VÀ KỸ THUẬT KẾT TỦA KHUẾCH TÁN TRÊN THẠCH I Kỹ thuật tiêm virus Newcastle(Tiêm xoang niệu mô) Mục đích Xác định diện virus Newcastle phôi trứng gà, ứng dụng sâu sản xuất Vắc xin Dụng cụ - hóa chất Muối sinh lý 10-20% Hình 1: Một số dụng cụ hóa cần thiết Nước muối sinh lý 10- 20% Cồn Iod Parafin lỏng Kim tiêm Chuẩn bị nguyên liệu Chuẩn bị trứng gà ấp từ – 11 ngày tuổi Hình 2: Trứng – 11 ngày tuổi Chuẩn bị vắc xin Newcastle nhược độc, sử dụng nồng độ 10-3, liều lượng 0.1-0.2ml/trứng Hình 3: Vắc xin Niu-cát xơ Pha vắc xin với nước muối sinh lý nồng độ 10-1, 10-2, 10-3 Hình 4: Khử trùng hủ vắc xin Niu-cát xơ trước đem pha Hình 5: Cho vắc xin vào nước muối sinh lý Hình 6: Lắc để trộn điều vắc xin Tiến hành pha loãng với nồng độ 10-1, 10-2, 10-3 Hình 7: Virus Niu-cát-xơ nồng độ 10-1, 10-2, 10-3 Sử dụng nồng độ 10-3 để tiêm vào trứng, virus Newcastle Ta tiến hành tiêm xoang niệu mô, liều lượng 0,1-0,2 ml/trứng Quy trình thực Hình 8: Trứng ấp từ – 11 ngày tuổi Hình 9: Soi trứng, xác định buồn thật, vị trí phơi làm dấu vị trí phơi Hình 10: Xác trùng vỏ trứng cồn Iod Hình 11: Tiến hành đục lỗ, sau xác trùng lại lần Hình 12: Tiến hành tiêm(liều tiêm 0,1-0,2 cc/trứng) Lưu ý : Tiêm phía đối diện phơi khơng tiêm trực tiếp lên phơi Hình 13: Dùng parafin nóng bịt kín lỗ khoan sau tiến hành ủ 370c Xem kết II kỹ thuật tiêm Virus Đậu mùa(kỹ thuật tạo buồng giã) Mục đích Xác định diện Virus đậu mùa phôi trứng gà, thơng qua bệnh tích biểu màng CAM(nốt pock màng CAM) Ứng dụng sản xuất Vắc xin để phịng bệnh đậu mùa Dụng cụ - hóa chất Nước muối sinh lý, cồn, Iod, nút bóp cao su… Chuẩn bị nguyên liệu Chuẩn bị trứng gà ấp – 11 ngày tuổi Chuẩn bị vắc xin đậu gà nhược độc, pha loãng thành nồng độ 10 -1,10-2,10-3 Sử dụng nồng độ 10-3, liều tiêm 0,1-0,2 ml/trứng Cách pha loãng thực tương tư Hình 14: Vắc xin Đậu gà Quy trình thực Hình 15: Chuẩn bị trứng ấp 9-11 ngày tuổi Hình 16: Soi trứng, đánh dấu vị trí buồng giã, khử trùng vỏ trứng, đục lỗ Hình 17: Dùng núp bóp cao su hút khơng khí buồn giã ra, cho màng cam tuột khỏi vỏ lụa Hình 18: Đục lỗ vỏ Hình 19 : Tiêm Virus Đậu mùa vào màng cam, hướng tiêm lệch góc 30 - 450 III KỸ THUẬT KẾT TỦA KHUẾCH TAN TRÊN THẠCH Mục đích Xem khuếch tán kháng nguyên(kháng thể gà) kháng thể(kháng thể thỏ) khuếch tán mặt thạch ? Chuẩn bị Kháng nguyên : kháng thể gà Kháng thể : kháng thể thỏ Chuẩn bị môi trường : 12,5gr Agar + 80gr NaCl + 5gr phenol lít nước cất Hình 20: Đun môi trường bếp cách thủy Dùng vải lượt, lọc mơi trường vừa nấu xong Hình 21: Mơi trường lọc xong cho vào chai Chú ý : Môi trường mao đông đặc lại, cần nên tiến hành lọc xong Dùng pipet hút - ml thạch nhỏ vào lame, đặt pipet vng góc với lame, cho thạch chảy xuống từ từ chảy lame khơng có vết nhăn lồi lỗm chỗ nào, độ dày khoảng mm Hình 22: Pipet hút, cho lên lame, môi trường thạch dày mm Lame Hình 23: Đem thạch vào tủ lạnh, làm dấu vị trí cần đục lỗ, tiến hành đục lỗ Cho kháng nguyên( kháng thể gà) kháng thể( kháng thể thỏ) vào vị trí đục lỗ theo quy định sau : lỗ trung tâm kháng thể thỏ, lỗ xung quanh kháng thể gà, từ 20µl - 50µl cho lỗ thạch Hình 24: Cho kháng thể thỏ vào lỗ trung tâm, kháng thể gà vào lỗ lại, đặt miếng bơng gịn để giữ độ ẩm Thực xong ta chuyển vào tủ ủ, ủ 370c, sau 48h để quan sát kết Bài THAM QUAN CƠNG TY NAVETCO I Mục đích Học hỏi tìm hiểu thêm quy trình sản xuất Vắc xin cơng ty, số vấn đề liên quan công ty Một số thiết bị ứng dụng Công nghệ sinh hocj vào sản xuất vắc xin anh Tú nhiệt tình hướng dẫn Hai điểm nỗi bật , đáng quan tâm : cách nuôi Virus dùng để sản xuất vắc xin, kỹ thuật DNA tái tổ hợp vào sản xuất vắc xin Điều thiệt thòi ngồi giảng đường, mà không chứng kiến tận công ty tan ca làm việc II Một số vắc xin sản xuất công ty Vắc xin heo tai xanh Vắc xin cúm Vắc xin viêm não nhật Vắc xin uốn ván… III Quy trình sản xuất vắc xin công nghệ DNA tái tổ hợp Công nghệ tái tổ hợp lấy đoạn DNA miễn dịch gắn vào vi khuẩn Plasmid chuyển vào nấm men, hay vi khuẩn, để nhân nhanh sinh khối, tách thu sinh khối, để sản xuất vắc xin Bài 3: Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI: Haemagglutination inhibition) Nguyên lý Khi Newcastle gặp kháng thể đặc hiệu tuơng ứng bị kháng thể kết hợp,khơng cịn khả gây ngưng kết hồng cầu, hay nói cách khác kháng thể ngăn trở ngưng kết hồng cầu virus Mục đích: xác định hàm lựơng kháng thể chống lại bệnh Newcastle Chuẩn bị Huyễn dịch hồng cầu gà 1% Huyễn dịch virus newcastle pha loãng nồng độ n – (4 đơn vị HA) Nuớc muối sinh lý 0.9% Huyết gà thí nghiệm Vĩ 96 lỗ có đáy hình chữ U Micropipette đầu đầu Tiến hành Cho nuớc muối sinh lý vào hàng thứ từ lỗ thứ đến 12, lỗ 50 µl Cho thêm 50 µl huyết gà vào lỗ 1, trộn Sau lấy 50 µl huyễn dịch từ lỗ cho vào lỗ 2, trộn lên tiếp tục lỗ thứ 10, hút 50 µl huyễn dịch lỗ thứ 10 bỏ Lỗ 11 dùng làm đối chứng âm, lỗ 12 dùng làm đối chứng duơng Cho vào lỗ từ lỗ đến lỗ thứ 11 lỗ 50 µl huyễn dịch virus pha loãng nồng độ đơn vị HA Để yên 10 – 15 phút 22 Cuối cho 50 µl huyễn dịch hồng cầu gà 1% vào tất lỗ từ đến 12, lắc đều, để yên 30 phút đọc kết Kết thảo luận Hình 7: Phản ứng HI Virus Newcastle Qua hình ảnh ta thấy: Sự ngưng kết đóng nút khơng rõ rệt Kết khơng xác Có thể thao tác pha lỗng trình tự thực phản ứng HI Do trình thực phản ứng HI cần phải: Sử dụng thành thạo thao tác trình thực phản ứng HI 23 Bài 4: Qui trình tách chiết DNA tổng số chạy PCR Dụng cụ thiết bị Máy chạy PCR Máy ly tâm có tốc độ cao ( khoảng 13000 vòng/10 phút) Vortex Máy homogenizer hay chày cối Pipette, đầu col Tube Nguyên liệu hóa chất Mơ gang động vật Bộ kit gồm dung dịch: dung dịch pED1, dung dịch pEX2, dung dịch pEX3, dung dịch EX4, dung dịch ED5 24 Hinh 8: Bộ kit Các bước tiến hành Bước 1: Xử lý mẫu (nghiền mẫu, ly tâm, thu dịch mô) Nghiền mẫu: 1gram mô + 2ml PPS Hút nước mô vào đầy tube vơ trùng Hình : Nghiền mẫu Ly tâm: 13000 vịng/5 phút Hình 10: Ly tâm 13000 vịng/5 phút Thu dịch mơ 25 Hình 11 : Thu dich mô sau ly tâm Bước 2: Đánh dấu tube 1,5ml vô trùng ký hiệu mẫu Bước 3: Cho 200µl mẫu vào tube vơ trùng có sẵn 900µl dung dịch pED1, voxtex 30s, để n 10 phút Thêm vào 200µl dung dịch pEX2, trộn cho toàn dung dịch tube phải chuyển thành màu trắng đục Ly tâm 13000 vòng /10 phút a b Hình 12: a) hút 900µl dung dịch pED1 vào tube vơ trùng Hình b) hút 200µl mẫu vào tube vơ trùng có sẵn 900µl dung dịch pED1 26 Hình 13 : vortex mẫu Hình 14: mẫu sau vortex Bước 4: Thu 600µl dịch có chứa DNA vào tube vơ trùng có sẵn 600µl dung dịch pEX3 Trộn để yên 10 phút Ly tâm 13000 vòng/ 10 phút Bước 5: Loại bỏ dịch nổi, thu cặn màu hồng ( xanh) Cho từ từ 900µl dung dịch EX4 vào Ly tâm 13000 vòng /5 phút Bước 6: Loại bỏ dịch nổi, thu cặn Để khô 60oC 10 – 15 phút Cho vào 50µl dung dịch ED5 Bước 7: Trước sử dụng, dung pipet trộn đến phần cặn tan hoàn toàn Bước 8: Bảo quản mẫu -20oC Bước 9: Lấy mẫu cho vào eppendorf cho vào máy PCR thiết lập chương trình chạy Hình 13: Chạy PCR 27 Hình 14: Chu trình chạy PCR Kết thảo luận Hình 15: Kết chạy điện di Bài 4: Phản ứng kết tủa khuếch tán thạch (Agar gel immunodiffustion test – AGID test) Nguyên tắc - Kháng nguyên kháng thể khuếch tán thạch - Khi gặp kết hợp tạo thành đường kết tủa trắng mờ đục 28 Chuẩn bị - Kháng nguyên: huyết gà - Kháng thể đưa kháng huyết gà - Đun cách thuỷ tan hết Tiến hành - Hút 3- 4ml thạch nung chảy cho vào lam thủy tinh, ý rải thạch theo hình ziczac để thạch chảy đểu lên mặt lam - Lam để mặt bàn phẳng thạch đông lại - Thạch phải dày khoảng mm - Dùng ống kim loại đục lỗ : lỗ thạch, lỗ lại đặt vng góc với - Cho kháng ngun vào lỗ thạch, cho kháng thể vào lỗ cịn lại hay cho ngược lại cho kháng thể vào lỗ giữa, cho kháng nguyên vào lỗ lại Chú ý: tùy vào độ lớn lỗ mà ta tiêm vào lượng thể tích tương ứng - Đặt lam vào đĩa petri, đặt bơng gịn có thấm nước xen kẽ lam nhằm tạo độ ẩm cho đĩa - Ủ 370C - Đọc kết lần: lần sau 24 giờ, lần sau 48 Hình 16: Các lam tiêm kháng nguyên – kháng thể Kết Lần I: sau 24 chưa có vầng trắng đục mẫu đối chứng 29 Kết quả: khơng đủ thời gian nên quan sát mẫu đối chứng dương giảng viên chuẩn bị từ trước Hình 17: Phản ứng kết tủa khuếch tán thạch Bài 5: Phản ứng ELISA phát kháng thể kháng virus gây bệnh Gumboro Giới thiệu 1.1 Bệnh Gumboro Bệnh Gumboro (Infections Brusal Disease) bệnh thường xảy gà giai đoạn - 12 tuần tuổi, rõ giai đoạn - tuần tuổi 30 Tất giống gà mắc bệnh Gà nhỏ tuần tuổi mắc bệnh không biểu triệu chứng làm gà suy giảm miễn dịch Tỷ lệ mắc bệnh 100%, tỷ lệ chết từ 10-50% cao kết hợp với bệnh khác a Nguyên nhân: Do virus thuộc họ Birnaviridae, serotype b Phương thức truyền lây - Bệnh lây gián tiếp qua trứng, qua khơng khí, thức ăn, nước uống, dụng cụ chăn nuôi nhiễm mầm bệnh - Bệnh lây lan trực tiếp gà mang mầm bệnh gà khỏe tiếp xúc c Triệu chứng - Thời gian ủ bệnh ngắn 2-3 ngày - Sau nhiễm bệnh gà biểu triệu chứng cắn mổ vào hậu môn nhau, biếng ăn, lông xù, lờ đờ, run rẩy, giảm cân, phân tiêu chảy màu trắng, lỗng cịn nhiều chất nhầy sau chuyển sang màu nâu, phân dính đầy xung quanh hậu mơn d Bệnh tích - Xác chết khô, lông xơ xác, chân khô - Cơ đùi, ngực, cánh xuất huyết đỏ thành vệt thâm đen - Mổ khám túi Fabricicus sưng to, đỏ, có xuất huyết lấm đám, thận sưng nhạt màu Xuất huyết niêm mạc dày tuyến (chổ tiếp giáp mề tiền mề), ruột sưng to có nhiều dịch nhầy bên - Nếu gà nhiễm bệnh đến ngày thứ 5, 6, túi Fabricius nhỏ lại, đến ngày thứ 1/3 trọng lượng ban đầu 1.2 ELISA ELISA (Enzyme linked Immunosorbent Assay) có nghĩa hấp thụ miễm dịch liên kết với enzyme, phân tích sử dụng kháng thể để nhận diện protein Ở kháng thể đặc hiệu cho kháng nguyên (thường protein ta quan tâm) gắn vào đáy giếng Chất mà ta quan tâm nằm mẫu thử trộn lẫn với chất chuẩn có liên kết enzyme Khi ta cho hỗn hợp vào giếng giếng có chất ta mẫu thử cạnh tranh với chất chuẩn làm cho giếng sau bắt màu nhạt So kết 31 với giếng chuẩn có chất chuẩn ta biết lượng chất ta quan tâm mẫu thử ta ELISA sử dụng nhiều y học, chẩn đoán (ví dụ có thai, ung thư v.v), chẩn đốn bệnh cho gia súc vật Ưu điểm phương pháp ELISA là: độ nhạy cao, phát phức hợp nhỏ kháng nguyên- kháng thể, cho phép phát sớm tác nhân gây bệnh giai đoạn sớm mầm bệnh xâm nhiễm Dùng để phát hịên nhiều loại Protein, nhận diện virut, vikhuẩn, số hợp chất phân tử lượng nhỏ nhiều mẫu sinh học khác Dụng cụ - hóa chất - Vĩ phản ứng có phủ kháng nguyên virus gây bệnh Gumboro - Đối chứng dương : có kháng thể - Đối chứng âm : khơng có kháng thể - Kháng kháng thể chế từ dê có gắn enzyme (Horseradish Peroxidase Conjugate) - Dung dịch phát màu (TMB Substrate): conzurat + chất màu - Dung dịch dừng phản ứng (Stop Solution): dừng phản ứng tạo màu - Dung dịch pha loãng mẫu (Sample Diluent) dùng để pha loãng mẫu huyết - Nước cất nước tiệt trùng: rửa mẫu Chuẩn bị - Bộ kit phải để nhiệt độ phòng trước thực phản ứng Mẫu - Dùng µl pipet hút huyết từ ống chích sang tube có nắp - Chuẩn bị 10 tube có nắp chứa 1500µl dung dịch pha lỗng - Hút 3µl huyết từ tube chứa huyết sang tube chứa dung dịch pha loãng - Thực pha loãng mẫu với dung dịch pha loãng mẫu với tỉ lệ 1:500 (3µl huyết + 1500µl dung dịch pha loãng mẫu) Chú ý : - Thay đầu type mẫu - Khơng pha lỗng đối chứng 32 Hình 18: Mẫu huyết Hình 19: Mẫu huyết pha loãng 1: 500 Tiến hành - Ghi kí hiệu mẫu - Nhỏ 100µl đối chứng âm vào giếng A1 A3 - Nhỏ 100µl đối chứng dương vào giếng A2 A4 - Lần lượt nhỏ 100µl mẫu vào 10 giếng tương ứng : B3, B4, C3, C4, D3, D4, E3, E4, F3, F4 33 Hình 20: Vĩ phản ứng có phủ kháng Hình 21: Nhỏ mẫu pha loãng vào giếng nguyên virus - Ủ 30 phút nhiệt độ phòng - Vẩy bỏ dung dịch bên giếng - Rửa nước cất nước tiệt trùng, 350µl/lần, q trình rửa thực từ 3-5 lần - Vẩy khơ - Nhỏ 100µl Horseradish peroxidase conjugate vào giếng - Ủ 30 phút nhiệt độ phòng - Rửa nước cất nước tiệt trùng, 350µl/lần, q trình rửa thực từ 3-5 lần - Vẩy khơ - Nhỏ 100µl TMB solution vào giếng - Ủ 15 phút chỗ tối, nhiệt độ phịng - Nhỏ 100µl Stop Solution vào giếng để ngừng phản ứng giếng - Đọc kết bước sóng 650nm Kết Bảng 1: Kết phản ứng ELISA bước sóng 650nm 34 Tính Điều phản ứng: PCx – 0.0225 < 0.075 (Không NCx 0.015 (Không thỏa) = 10 11 12 A 0.066 0.087 0.076 0.123(+) 0.07(-) B 0.05 0.065 0.062 0.062(+) 0.07(-) C 0.059 0.056 0.082 0.057 0.053 D 0.083 0.052 0.083 E toán: kiện NCx = thỏa) 0.07 > F Do kết thu không thỏa hai điều kiện nên ta suy q trình thực có sai sót nên khơng thể tính trị số S/P xác công thức: Chỉ số S/P = (sample mean - NCx)/ (PCx - NCx) S/P > 0.2 : dương tính (titer > 396) S/P