Tạo bào tử probiotic biểu hiện streptavidin gắn kết kháng thể biotinyl hóa bước đầu ứng dụng trong chuẩn đoán

ĐẠI HỌC QUÓC GIA HÀ NỘI TR Ư ỜN G ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỤ• NHIÊN • • • TÊN ĐÈ TÀI TẠO BÀO T Ử PROBIOTIC BIÈƯ HIỆN STREPTAVIDIN GẮN KẾT KHÁNG THẺ BIOTINYL HÓA, BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐỐN M Ã SĨ: QG 10-05 C H Ủ T R Ì Đ È T À I : TS N G U Y Ề N TH Ị# V Â N A N H C Á C C Á N B ộ T H A M GIA: PGS TS Phan T u ấ n N g h ĩa ThS N guyễn T h ị H n g Loan ThS T r u o n g T h ị H u ệ CN Bùi Thu T h ủ y ThS H oàng V ăn T ổ n g HÀ N ộ ỉ -2012 BÁO CẢO TÓM T Ả T BẢNG TIÉNG VIỆT Tên đề tài : Tạo bào tử probiotic biểu streptavidin gắn kết kháng thể biotinvl hóa bước đầu ứng dụng chấn đốn Mã số: QG 10.05 Chủ trì đề tài: TS N guyễn Thị Vân Anh Các cán tham gia đề tài: TT Họ tên Co quan PGS TS Phan Tn Nghĩa Phịne Thí nghiệm Trọng điêm Cơng nghệ Enzym Protein, Đ H K H TN ThS N guyên Thị Hông Loan Khoa Sinh học, Đ H K H TN ThS Trương Thị Huệ Khoa Sinh học, Đại học Tông hợp Quy Nhơn ThS H ồng Văn Tơng Trung tâm nghiên cứu Sinh Y Dược học, Học viên Quân Y CN Bùi Thu Thủy Phịng Thí nghiệm Trọng điêm Cơng nghệ Enzym Protein, Đ H KHTN Mục tiêu nội dung nghiên cứu 5.1 Muc tiêu đề tài - Tạo bào tử tái tổ hợp vi khuẩn Bacillus subtilis có khả biểu streptavidin bề mặt sử dụng bào tử gắn kết với kháng thể antiVP28 IgG biotinyl hóa để phát kháng nguyên đặc hiệu VP28 virus gây bệnh đốm trắng tôm (W hite spot syndrom e virus) 5.2 Nội dung nghiên cứu - Sử dụng cơng nghệ gen để nhân dịng biểu streptavidin lên bề m ặt bào tử Bacillus subtilis sử dụng bào tử m ột chất m ang đa dụng nhờ vào lực cao streptavidin với biotin phân tử biotiny hóa Trong khn khổ đề tài này, chúng tơi gắn kháng thể anliV P28 IgG biotinyl hóa lên bề mặt bào tử bước đầu sử dụng để phát khán? nguyên đặc hiệu VP28 virus gây bệnh đốm trắng tôm (W hite spot syndrom e virus) Các ket đạt đu ọc 6.1 x.ết quà khoa học: • N hân dịng thành cơng gen cB - strep ta vid ỉn vào vector pD G 364 dung hợp thành công đoạn gen co tB -strep ta vid in vào A D N hệ gen B acillus subíilis • Nhân dịng thành công gen cotB -G S T -strep ta vd in vào v ecto r pD G 364 dung hợp thành cô n g đoạn gen cotB -G ST -streptavdin vào A D N hệ gen Bacillus subtilis • Biểu thành công cotB - streptavidin cotB -G S T -streptaviđin bề mặt bào tử B a cillus siibtilis • B iotin hóa thành cơng k h án g thể anti V P28 IgG • K háng thể đơn dòng đa đ òng kháng V P28 biotinyl hóa gắn kết đặc hiệu với bào tử-strep • B tử-strep ;ắn k h án g thề k háng V P 28-biotinyl bư ớc đầu có khả phát kháng nguyên đặc hiệu virus gây bệnh đốm trắng thông qua phản ứng ngưng kết • Đã xây dựng 03 quy trìn h theo th u y ết m inh đề tài, bao gồm : Q u y trìn h 1: N hân dịng biểu gen m ã hóa cho C otB -S treptavidin bề m ặt bào tử B a cillu s su b tỉlis Q u y trìn h 2: G ắn k ết kháng thể biotinyl hóa lên bề m ặt bào tử streptavidin Q u y trìn h 3: Phát kháng nguyên đặc hiệu W SSV bàng bào tử-strepbiotinyl anti V P 28IgG thông qua phản ứng ngư ng kểt 6.2 K ết qu ả cơng bố: 01 báo n u ó c - Bui Thu T huy, H oang V an T ong, Phan H uong T rang, Phan T uan N ghia, H uynh Anh H ong, Sim on C utting, N guyen Thi V an A nh (2011) C loning and expression o f streptavidin on outer coat on B acillus su b tilis P Y 79 spore Journal of Science, V olum e 27, N o.2S, 285-291 01 đ ă n g k ý sán g chế: nộp đơn sổ 1-2012-00839 ngày 28/3/2012 02 báo cáo (oral presentation) hội nghị quốc tế - N guyen Thi V an A nh D ev elopm ent o f streptavidin-expressing B acillus sub tilis spores as b io -m icro p articles for drug delivery and diagnostics purposes H U S-K A JST Sym posium , K orea, lh F ebruary 2011 - N guyen Thi V an A nh, H u y n h A nh H ong, H oang V an T ong, Bui Thu Thuy, N guyen H oa A nh, Phan T uan N ghia, Sim on C utting “K illed ” B acillus sub tilis spores ex p ressin g streptavidin: potential carrier for application in drug delivery and d iagnostics 5th E uropean Spores C onference,Egham , UK, 16th- 19th, 2012 6.3 K ết quà đào tạo' -0 cử nhân • Phan Hương T rang, hệ C N T N K hóa 10, Sinh học - 01 thạc sĩ khoa học • Bùi ĩh u Thủy, Sinh học T hự c nghiệm , khóa 2009-2011 Tình hình kinh phí đề tài Tống kinh phí đề tài: 140.000.000 đ n e, chi theo đúna dự toán phê duyệt Đ Ơ N VỊ Q U Ả N LÝ C H U TR I Đ Ẽ TAI (K ý ghi rõ họ tên) (K ý ghi rõ họ tên) PGS TS Phan T u ấn N g h ĩa TS N guyễn Thị Vân A nh T R Ư Ờ N G Đ Ạ I H Ọ C K H O A H Ọ C T Ụ N H IÊ N • Ý\ • • Hiệu T ru ỏ n g *HĨ HiÊu T iN a • • Phan H ương Trang I Ionor Program , K8 Biology -0 MSc • Bùi T hu T hủy, E xperim ental Biology, 2009-2011 Funding: 140.000.000 V N D w as spent accordingly to w hat described in the proposal o f project VI BẢNG VIÉT TẢT APS A m m onium Persulphate BSA A lbum in huyết bò (B ovine Serum A lbum in) CBB Coom assie Blue Brillant dNTP D coxyribonucleoside triphosphate EDTA Ethylene D iam ine Tetraacetic Acid kD a K ilodalton LB Luria B ertani PAGE Điện di gel polyacrylam ide (Polyarylam ide Gel Electrophoresis) PBS M uối chứa đệm phosphate (Phosphate B uffered Saline) PCR Phản ứng chuỗi polvm erase (Polym erase C hain Reaction) PM SF Phenyl M ethylsulphonyl Fluoride PV D F Polyvinylidere Fluoride RPLA Phản ứng ngưng kết thụ động ngược ( R everse Passive Latex A gglutination) SDS Sodium D odecyl Sulphate TEM E3 N, N, N \ N ’-T etram ethyl-E thylenediam ine w ssv Virus gây bệnh đốm trắng (W hite Spot Syndrom e Virus) VI1 MỤC LỤC Báo cáo tóm t ấ t i S um m ary iv Bảng chữ viết t ắ t vii MỞ Đ Ầ U Chương I TÒNG QUAN TÀI L IỆ U 1.1 BÀO TƯ Bacillus subtilis VÀ BIẾU HIỆN PROTEIN NGOẠI LAI TRÊN BỀ MẶT BÀO T Ử 1.1.1 Nội bào tử vi k h u ân 1.1.2 Bào tử Bacillus s u b tilis 1.2 STR EPTA V ID IN 13 1.2.1 Giới thiệu chung streptavidin 13 1.2.2 Cấu trúc streptavidin 14 1.2.3 Cấu tạo biotin 15 1.2.4 Tương tác streptavidin-biotin 15 1.2.5 Thiết kế trạng thái đơn hóa trị streptavidin với vị trí gắn biotin 16 1.3 VIRUS GÀY BỆN H ĐỐM TRẮNG T Ô M 18 1.3.1 Giới thiệu chung bệnh đốm trắng tôm virus gây bệnh đốm trắng 18 1.3.2 Protein vỏ VP28 virus W S S V 20 1.3.3 Các phương pháp phát virus gây bệnh đốm trắng tô m .20 1.3.4 Bào tử B subtỉlis biểu streptavidin bề mặt(bào tử-strep) ứng dụng 21 1.4 PHẢN ỨNG N G Ư N G KÉT MIỄN DỊCH VÀ ỨNG D Ụ N G 22 Chương II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG P H Á P 25 2.1 NGUYÊN L IỆ U 25 2.1.1 Chủng vi k h u ẩ n 25 2.1.2 Các k t 25 2.1.3 Các cặp n i 25 2.1.4 Mầu tôm sú nhiễm bệnh đốm trắng 27 2.1.5 Các ngu'ên liệu k h c 27 2.2 PHƯƠNG PH Á P 27 2.2.1 Tách chict A D N hệ gen từ vi khuẩn Gram d n g 27 2.2.2 Tách chitt plasm id từ vi k h u ẩ n 27 2.2.3 Tách chiết ADN hệ gen virus từ m ẫu tôm nhiễm W SSV 28 2.2.4 N hân đoạn gen đích đặc hiệu kỹ thuật P C R 29 2.2.5 Nhân dòng đoạn gen đích vào vector pD G 364 29 2.2.6 Biến nạp vector chứa đoạn gen chèn vào tế bào khả biến E coli chủng D H a .29 2.2.7 Xứ lý plasmid cặp enzym e giới hạn 30 2.2.8 Phản ứng găn đoạn gen đích (insert) vào vector bang T4 A D N ligase 30 2.2.9 Dung hợp đoạn gen đích vào A DN hệ gen Bacillus subtilis chủng P Y 79 31 2.2.10 Kiểm tra có mặt đoạn gen đích ADN hệ gen B su b tilis 31 2.2.11 Nuôi cấy tạo bào t 32 2.2 ỉ Kiểm tra biểu protein dung hợp phương pháp thẩm tách miễn dịch (Western blotting) 33 2.2.13 Biotinyl hóa kháng thể kháng V P 35 2.2.14 Gắn kháng thể kháng VP28 biotinyl hóa lên bào tử -strep 35 2.2.15 Nhuộm màu bào tử-strep gắn kháng thề kháng V P 28-biotinyl 35 2.2.15 Thu dịch nghiền có chứa virus gây bệnh đốm trắng từ mẫu tôm sú nhiễm bệnh 35 2.2.16 Phản ứng ngưng kết thụ động ngược (R everse passive latex agglutination) 36 2.2.17 Định lượng số copies W SSV bàng kỹ thuật R eal-tim e P C R .36 Chương III KẾT QUẢ VÀ TH Ả O L U Ậ N 37 3.1 NHÂN DÒNG ĐOẠN GEN STREPTA VIDIN VÀO V ECTO R PDG364 COTB VÀ DUNG HỢP VÀO HỆ GEN B s u b tilis 37 3.1.1 N hân đoạn gcn mã hóa cotB, cotB -G ST streptavidin phương pháp PCR 38 3.1.2 N hân dòng đoạn gen cotB cotB- G ST vào vector p D G 39 3.1.3 N hân dòng đoạn gen streptavidin vào vector pDG364 cotB vector pDG364 cotBG S T 42 3.1.4 Đưa đoạn gen dung hợp cotB-streptavidin vector vào hệ gen B su b tilis 46 3.2 ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ BIẾU HIỆN PRO TEIN DUNG HỢP COTB- STREPTAVIDIN TRÊN BỀ M Ậ T BÀ O T Ử B subtilis 47 3.2.1 Kiểm tra biểu cotB -streptavidin bào tử bằne phư ơne pháp thẩm tách miễn d ịc h 47 3.2.2 Kiểm tra biểu cotB -G ST-streptavidin bào tử phương pháp thẩm tách miễn d ịc h 48 3.3 ĐÁNH GIÁ NỨC ĐỘ LIÊN KẾT CỦA BÀO TỬ -STREP VỚI KHÁNG THẺ KHÁNG VP28-BICXINYL .50 3.3.1 Đánh giá m ứ độ liên kết bào tử-strep với kháng thể đa dòng kháng VP28b io tin y l 50 3.3.2 Đánh giá hàn! số phân ly cùa phức hệ bào tử-strep- kháng thể kháng V P28-biotinyl 53 3.4 PHẢN ỨNG N3ƯNG K ẾT MIỄN DỊCH THỤ ĐỘNG KIÊM TRA s ự CĨ M ẶT CỦA VIRUS GÂY ÌỆNH ĐỐM TRẮNG TRÊN TÔM W SSV 56 3.4.1 Xác định nồm độ virus dịch nghiền Realtim e P C R 57 3.4.2 Đánh giá khả hình thành ngưng kết bào tử-strep gắn kháng thể đa dòng kháng VP28-biotiny với dịch nghiền tôm nhiễm W SSV 60 3.4.3 Đánh giá khả lăng hình thành phản ứng ngưng kết bào tử-strep gắn kháng thể kháng VP28-biotiny với nồng độ virus pha loãng 62 KẾT LUẬN VÀ H IỚ N G NG H IÊN CÚƯ TIÉP T H E O 79 TÀI LIỆU THAM K ÍẢ O 80 I TÀI LIỆU TRONG N Ư Ớ C 80 II TÀI LIỆU NƯỚC N G O À I 80 M Ỏ ĐẦU Bào tử B acillus su b tilis m ột n h n s đối tư ợng nghiên cứu đư ợc nhiều nhà khoa học quan tâm n h tính chất bền nhiệt, khơng độc hại, đặc biệt cơng trình nghiên cứu hệ th ố n g biểu protein bề m ặt bào tử H ệ thống biểu sử d ụ n e m ột protein lớp áo bào tử làm yếu tố d u n a hợp gắn với m ột protein ngoại lai nhằm biểu protein bề mặt bào tử Protein ngoại lai m ột kháng nguyên hay protein làm đầu dò v.v N h ữ n g ứng dụng hệ thống trải rộng nhiều lĩnh vực, nôi bật tiềm tạo hệ vaccine m ới sử dụng qua đư n g uống hay đ n e m ũi, hay tạo chất hoạt hóa sinh học, chất bám dính sinh học v.v Streptavidin từ lâu đư ợ c người biết đến n h iều ứng dụng quan trọng chủ yếu thuộc lĩnh v ự c H ó a sinh học Sinh y học, liên quan đến khả n ăng liên kết đặc biệt với biotin với phân tử biotinyl hóa Bào tử B acillu s subtilis biểu streptavidin bề m ặt (gọi tắt bào tử -strep) a hẹn đem lại nhiều tiềm ứng dụng Bào tử -strep sử dụng m ột chất m ang “đa dụng" nhờ khả gắn với phân tử đư ợc biotinyl hóa với nhiều ưu điểm bền nhiệt, bền với tác nhân lý hóa học, kích thước đồng cỡ m icrom et, hy vọng có khả “chuyên ch ” kháng nguyên vi sinh vật, enzym e, kháng thể để phục vụ cho m ục đích phân tích hay ứng dụng k h ác V irus gây bệnh đốm trắn g tôm (W S S V ) loại virus gây bệnh nghiêm trọng phổ biến ỏ tôm nuôi, nguyên nhân chủ yếu gây nhữ ng tổn hại kinh tế lớn ngành côr.g nghiệp tôm tồn giới H iện nay, chư a có m ột biện pháp chữ a trị hữu h iệu rào bệnh bệnh virus W SSV gây Do vậy, phát sớm virus gây b ệrủ đóng vai trị quan trọng then chốt việc phịng ngừ a bệnh virus đốm tră ìg gây Có m ột số phư ơng pháp sử dụng để phát có m ặt WSSV tơm giống hay ao ni PCR, hóa m ô m iễn dịch, que th nhanh P hư ơng pháp PCR, hóa m m iễn dịch có độ nhạy cao quy trình tiến hành phức tạp, tốn thời ịian phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm đư ợc trang bị đại, nên k h ô ĩg thuận tiện cho việc xét nghiệm nhanh thự c địa (như đầm , ao 15 - Cách tiếp cận, phuong pháp nghiên cứu, kỹ thuật sử dụng (Luận cú rõ cách liếp cận vắn đề nghiên cừu, thiết ké nghiên cửu, phương pháp nghiên cíni kỹ thuật sử dụng gắn với nội dung để tài; so sánh với phương pháp giải tương tự khác phân tích đê làm rõ tính mới, tính độc đáo, tính sáng tạo đề tài) Cách tiếp cận vẩn đề nghiên cửu - Tra cứu cơng bố tạp chí quốc tể bào tử, streptavidin, virus gây bệnh đốm trắng tơm, kit chẩn đốn, vắcxin hệ mới, công cụ sinh học vận chuyển thuốc - Tra cứu thông tin cập nhật mạng, từ địa chi website cáccông tychuyên công nghệ sinh học, miễn dịch, vấcxin sinh phẩm Phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật sử dụng - Thiết kế mồi đặc hiệu cho cotB, GST, streptavidin, VP28 - Tối ưu hóa quy trình PCR nhân đặc hiệu đoạn gen - Sử dụng enzyme giới hạn thích hợp để cắt đoạn gen nhân plasmid có tên pDG364 thiết kế có promotor Bacillus subtilis có đoạn gen mã hóa cho amylase có khả dung nạp vào trình tự gen mã hóa amylase nhiễm sắc thể Bacillus subtilis (quà tặng GS Simon Cutting), chuẩn bị cho bước nhân dòng - Sử dụng T4 DNA ligase, kết nối đoạn gen cotB-streptavidin cotB-GST-streptavidin vào plasmid pDG364 - Duỗi thẳng plasmid pDG364 chứa gen cotB-strsptavidin cotB-GST-streptavidin enzyme giới hạn thích hợp - Dung nạp gen chimeric cotB-streptavidin coíB-GST-sireptavidin vào nhiễm sắc thể chủng Bacillus subtilis PY79 (quà tặng GS Simon Cutting) - Kiểm tra biểu CotB-streptavidin hay CotB-GST-Sừeptavidin gắn kết cùa kháng thể bàng phương pháp thẩm tách miễn dịch miễn dịch huỳnh quang, sử dụng kháng thể đặc hiệu CotB (Quà tặng GS Simon Cutting), kháng thể thương mại anti-Streptavidin từ thỏ, kháng thể thương mại kháng thỏ cộng họp Alkaline Phosphatase, kháng thể thương mại kháng thỏ gắn thuốc nhuộm huỳnh quang Alexa543 - Biotinyl hóa kháng thể thương mại anti VP28 IgG (kháng thể đa dòng từ thỏ đơn dòng từ chuột, chế bán sẵn thị trường) phản ứng cộng hợp kháng thể với biotin succinimidyl - Phát khả gắn đặc hiệu biotinyl anti VP28 IgG lên Bào tử-Strep, khả phát đặc hiệu kháng nguyên VP28 bàng Bào tử-Strep / biotinyl anti VP28 IgG dụng phương pháp thẩm tách miễn dịch, miễn dịch huỳnh quang, ELISA Tính mới, tỉnh độc đáo, tính sáng tạo: Đây hướng nghiên cứu dựa ý tưởng mới, không lặp lại cơng bố trước nên có nhiêu tiêm đê công bô quôc tê kết đạt 12 16 - Khà sử (lụng CO' sò' vật chát, trang thiết bị ( tê n c c p h àn ÍỊ thí nghiệm sứ dụn g trung để tài) - Sử dụng chù yếu trang thiết bị Phịng Thí nghiệm trọng điểm Cõng nghệ Enzym protein, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên - Ngồi có sử dụng thêm số thiết bị (kính hiển vi huỳnh quang) Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên 17 - PhưoTĩg án phối họp vói tổ chức nghiên cứu CO' sỏ' sản xuất nưóc (nếu có) (Trình bày rõ phưomg án phổi hợp: tên tổ chức phối hợp tham gia thực để tài nội dung công việc tham gia đề tài, kế cóc sở sản xuất ngicời sử dụng kết nghiên cứu; khả đóng góp nhân lực, tài chính, sở hạ tầng-nếu có) Đe tài giai đoạn khởi đầu nên chưa có dự định phối hợp với sở sản xuất 18 - Phưtm g án họp tác quốc tế (nếu có) (Trình bày rõ phương án phối hợp: tên đỗi tác nước ngoài; nội dung hợp tác- đối tác có hợp tác từ trước; nội dung cần hợp tác khn kho đề tài; hình thức thực Phân tích rõ lý cần hợp tác dự kiến kếí hợp tác, tác động hợp tác đỗi với kết cùa Đe tài) - Phương án phối hợp: Trao đổi học hỏi kinh nghiệm, học kỹ thuật từ phía đối tác, thảo luận kết đạt công bố khoa học - - Đối tác: GS Simon Cutting TS Huỳnh Ánh Hồng, Trường Đại học Hoàng Gia London người có nhiều năm kinh nghiệm nghiên cứu bào tử tạo bào tử biểu antigen số vi khuẩn, virut để ứng dụng làm vắcxin hệ bền nhiệt Nội dung hợp tác: Nghiên cứu tạo bào tử tái tổ hợp biểu kháng nguyên VP28 virus gây bệnh đốm trắng bề mặt Nội dung hợp tác khuôn khổ đề tài: Học hòi kinh nghiệm chế tạo bào tử, nhân dòng biểu protein bề mặt bào tử, kỹ thuật miễn dịch Đồng thời nhận quà tặng từ GS Simon Cutting chủng Bacillus subtỉlis PY79, plasmid pDG364 1à nguyên liệu sẵn có để khởi động đề tài - Dự kiến kết hợp tác tác động hợp tác mang lại: tác giả thăm phịng thí nghiệm GS Simon Cutting học tập kỹ thuật làm bào tử Việc họp tác với GS Simon Cutting TS Huỳnh Anh Hông giúp năm băt kỹ thuật, kinh nghiệm đê có thê đưa ý tưởng dẫn tới thực Với kinh nghiệm uy tín lĩnh vực này, GS Simon Cutting có tư vân cho việc tiên hành thí nghiệm đánh giá kêt quà thu 13 19 - Tóm tắt kế hoạch lộ trình thực ( LOGFRAME ) STT Mục tiíu Sản phâm Các nội (Jung, hoạt động chủ yếu Diều kiên thưc hiên « Dự kiến kinh phí Cá nhân, tổ chức thực hiên* Thịi ẹian (bắt đầu, kết thúc) N.T Vân Anh 01/2010 P.T Nghĩa 3/2010 ] Xây dựng đề ciroug chi tiết, thu thập tổng quan tài liêu Mầu thuyết Thu thập viết tổng quan tài liệu minh đề cương Nhân dòng biểu Bào tửStrep Bào từ Bacillus Nhân dòng CotBvào subtilis chứa Streptavidin gen mã hóa plasmid pDG364 dung nạp gen mã hóa streptavidin CotB-Streptavidin vào genome bào tử Bacillus subtilis 14 H v Tổng 6/ 12/2010 Nhân dòng CotBGST-Streptavidin vào plasmid pDG364 dung nạp gen mã hóa CotB-GSTStreptavidin vào genome bào tử Bacillus subtỉlis 14 Búi T Thủy 6/2 12/2010 CotBBào tử Bacillus Biểu subtilis biểu streptavidin bề mặt bào từ Bacillus streptavidin subtilis bề mặt Biểu CotB-GSTstreptavidin bề mặt bào từ Bacillus subtilis 14 • N.T Vân Anh /2 1 - P.H Trang* 4/2011 P.T.Nghĩa 14 /2 1 - P.H Trang* 4/2011 N.T Vân Anh 14 Biotin hóa anti VP28 IgG Anti VP28 IgG cộng họp biotin Cộng hợp Biotin vào an ti VP28 IgG 10 Anti VP28 [gG biotinyl hóa tinh khỏi biotin thừa Tinh biotinyl anti VP28 IgG Kiểm tra Biotinyl anti khả VP28 [gG có gắn đặc khả găn hiệu bền vững vào anti VP28 Bào tử-Strep IgG lên Bào tửStrep N.T Vân Anh - 1/2 011 10 N.T Vân Anh 1/ 1 /2 11 Kiểm tra việc gắn cùa anti VP28 IgG lên Bào từ-Strep bàng thẩm tách miễn dịch và/hoặc miễn dịch huỳnh quang 12 N.T H Loan 7/201110/2011 N.T Vân Anh T T Huệ Bước đầu kiểm tra khả phát kháng nguyên đăc biêu • • WSSV bào tửstrep/biot inyl anti VP28 IgG Bào tửstrep/biotinyl anti VP28 IgG có khả phát đặc hiệu kháng nguyên VP28 cua WSSV Kiểm tra khả phát kháng nguyên đặc hiệu VP28 của’ WSSV bào tửstrep/biotinyl anti VP28 Ig ó bằỊig phưcmg pháp thẩm tách miễn dịch, và/hoặc phưcmg pháp miễn dịch huỳnh quang 15 Hội thảo, viết báo cáo khoa học, nghiệm thu Seminar, hội thảo nhóm Tổ chức seminar, hội thảo nhóm Báo cáo khoa học, đề tài nghiệm thu Viết báo cáo khoa học, tổ chức nghiệm thu đề tài 11/2010 B.T.Thủy N.T Vân Anh 11/2011 -2 / 2 P.H Trang* 15 T.T Cường 6/2010 N.T Vân Anh 6/ 20 11 P.T Nghĩa 3/2012 N.T Vân Anh 6/ 2 15 Chi khác (văn phòng phâm, photocopy , quản lý p h í, điện nước sở vật chất Chú trì quan quản lý đê tài Chủ trì quan quản lý đề tài • Ghi nhũng cá nhân có tên Mục 10 nghiên cínt sinh, học viên cao học tham gia • D ụ kiến • D ự kiến h ọc viên 6/2010 /2011 7/2011 6/20 12 sinh viên tham gia: P h a n Hưcmg Trang (P.H Trang) cao học tham g ia : B ùi Thu Thủy (B T Thủy) III HÌNH THỨC SẢN PHẨM K H O A HỌC CỦA ĐÈ TÀI 20 Cấu trúc dự kiến báo cáo kết đề tài Báo cáo dự kiến ngồi phần tóm tắt báo cáo tốn tài đề tài, có nội dung khoa học gồm phần sau: M đầu Nêu lên tính cấp thiết, mục tiêu ý nghĩa đề tài nghiên cứu Tổng quan vấn đề liên quan đến đề tài nghiên cứu ■' Tổng quan Bào tử Bacillus, cải biến bào tử công nghệ gen ứng dụng Tổng quan Sưeptavidin ứng dụng sinh học phân tử, chẩn đoán Tổng quan virus gây bệnh đốm trắng tôm Đề xuất hướng nghiên cứu Nguyên liệu phương pháp Các nguyên liệu đạt tiêu chuẩn nghiên cứu mức sinh học phân tử Các phương pháp nghiên cứu gồm: nhân dòng gen vào plasmid, dung nạp gen vào nhiễm sắc thể Bacillus subtilis, biểu protein dung họp bề mặt bào tử, thẩm tách miễn dịch, huỳnh quang miễn dịch, ELISA Kết nghiên cứu thảo luận Dự kiến gồm phần sau: - Gen mã hóa CotB, streptavidin, GST nhân dịng đưa vào vector pDG364 - Gen mã hóa CotB-streptavidin CotB-GST-streptavidin dung nạp vào nhiễm sắc thể Bacillus 16 - CotB-streptavidin CotB-GST-streptaviđin dược biểu bè mặt cùa bào từ - Kháng thể kháng WSSV biotinyl hóa tinh - Klìáng thể kháng W SSV biotinyl hóa (biotinyl anti-WSSV IgG) gán đặc hiệu lên Bào íửStrep - Bào tử-Strep gắn biotinyl anti-W SSV [gG có khả phát kháng nguyên đặc hiệu V P28 cùa WSSV Các kết luận đề nghị h ướ ng ngliiên cửu Tài liệu tham khảo Công bố khoa học (đính kèm ) từ kinh p h í đề tài 21 Bài báo, báo cáo, sách chuyên khảo: 02 báo đăng Hội nghị khoa học tạp chí chuyên ngành khoa học nước 01 báo đăng Hội nghị quốc tế tạp chí quốc tế STT Tên sản phẩm ( dự k iến ) Nội dung, yêu cầu khoa hoc • cần đat • Dự kiến noi cơng bố (Tiạp chí, Nhà xuất bản) 01 Bài báo khoa học tiếng Việt CotB-streptavidin CotB-GSTStrzeptavidin nhân dịng biểu Tạp chí Cơng nghệ sinh học, Viện Khoa học Việt Nam 01 Bài báo khoa học tiếng Việt 01 Bài báo báo cáo hội nghị quốc tế Bào tử-Strep có khả gắn đặc hiệu với kháng thể biotinyl hóa phát đặc hiệu kháng nguyên VP28 WSSV Bào tử-Strep có khả ứng dụng chẩn đốn dẫn thuốc tới đích C h i ch ú Tạp chí Khoa học, Đại học Quốc Gia H Nội Hội nghị quốc tế tạp chí quốc tế 17 22 Phương pluij); Tiêu chuẩn; Quy phạm; Phần mềm máy tính; Ban vẽ thiết kế; Quy trình cơng nghệ; So‘ đo, ban đồ; s ố liệu, Cơ sỏ' liệu; Báo cáo phân tích; Tài liệu dự báo (phương pháp, quy trình, mỏ hình, ); Đề án, qui hoạch; Luận chúng kinh tế-kỹ thuật sản phẩm khác STT Tên sản phâm Yêu cầu khoa học ( dự kiến ) Ghi Quy trình nhân dịng biểu gen mã hóa cho CotBStreptavidin bề mặt bào tử Bacillus sub til is Quy trình chi tiết cho phép biểu CotB-Streptavidin bề mặt bào tử Bacillus sub til is Quy trình gán kết kháng thể biotinyl hóa lên bề mặt bào tử streptavidin Quy trình chi tiết cho phép gắn kết kháng thể biotinyl hỏa lên bề mặt bào tử streptavidin Quy trình phát kháng nguyên VP28 virus gây bệnh đốm trắng tôm bàng bào tử streptavidin gắn kết kháng thể anti WSSV IgG Quy trình cho phép xây dựng mơ hình phát kháng ngun VP28 virus gây bệnh đốm trắng tôm bào tử streptavidin gắn kết kháng thể anti VP28 IgG 23 Sản phẩm công nghệ Mầu {model, maket); Sản phẩm (là hàng hố, tiêu thụ thị trường); Vật liệu; Thiêt bị, máy móc; Dây chuyền cơng nghệ loại khác; STT Tên sản phẩm cụ thể tiêu chất lư ọ n g c h ủ yếu c ủ a sản phẩm Đon vi đo • Mức chất lưựng cần đạt M ẩu tưcmg tự (theo tiêu chuẩn mói nhất) Trong nước Dự kiến số Iượng/quy mô sản phẩm tạo T h ế g iớ i 24 Sản phẩm d kiến đăng ký bảo hô quyền sở hữu cơng nghiệp, giải pháp hữu ích, sáng chế: - 18 25 Sán phâm đ o tạo STT Cấp đào tạo Số íưọ ng [Nhiệm vụ giao liên quan đến đề tài Ghi (Dự kiến kinh p h í) Đ.vị: Tr đồng Thạc sỳ 01 Phối hợp thực đánh giá mức độ biểu cùa Streptavidin bê mặt Bào tử-Strep 16 Đo độ nhạy phát kháng nguyên Bào tử-Strep Cử nhân 01 Phối họp với ủy viên đề tài thực việc nhân dòng biểu CotBStreptavidin bề mặt bào tử 26 Các sản phẩm khác ( Ghi rõ : Hợp đồng, sá ch ) IV KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG VÀ TÁC ĐỘNG CỦA KÉT QUẢ NGHIÊN c ứ u 27 - Khả ứng dụng kết nghiên cứu 27.1 Khả ứng dụng lĩnh vực đào tạo, nghiên cứu khoa học & cơng nghệ, sách, quản lý Tạo mẫu hướng dẫn thực tập kỹ thuật ừong Công nghệ Sinh học cho học viên cao học chuyên ngành hóa sinh, vi sinh 27.2 Khá ứng dụng [rong thực tiễn (phát triển kinh tế -XH, sản xuất hàng hóa ) Góp phần tạo nên vật liệu cho kit chẩn đoán với giá thành rẻ 27.3 Khả liên doanh liên kết với doanh nghiệp trình nghiên cứu Hợp tác với vài công ty chuyên sản xuất vắcxin, sinh phẩm Va-Biotech, Nam K hoa thử nghiệm tác dụng phát kháng nguyên VP28 WSSV Bào tử-Strep găn với kháng thể anti VP28 IgG 28 - Phạm vi địa (dự kiến) ứng dụng kết đề tài Các công ty nghiên cứu sản xuất vắcxin, sinh phẩm dược phẩm 19 29 - Tác động lọi ích mang lại kết qua nghiên cứu 29 Đơi với lĩnh vục KH&CN có liên quan (Nèu ỉiỉiữtiíỊ dự kiến dóng ỵóp vào lĩnh vực khua học vả củng nghệ nước quốc tê, dóng