Nghiên cứu chiết xuất tinh chế và xác định bản chất hóa học hoạt tính sinh học của một vài carotenoid từ một số cây cỏ việt nam dùng trong sản xuất thuốc và thực phẩm thuốc

ĐẠI HỌC Q llố c GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC T ự NHIÊN KH O A SINH HỌC Ten đề tàiะ NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT TINH CHẾ VÀ XÁC ĐỊNH BẢN CHẤT HỐ HỌC, HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA MỘT VAI CAROTENOID TỪ MỘT s ố CÂY CỎ VIỆT NAM DÙNG TRONG SẢN XUẤT THUỐC VÀ THỰC PHẨM t h u ố c Mã đề tài: QG 05.25 Chủ trì: Cán tham gia: PGS TS Nguyễn Văn Mùi TS Phan Quốc Kinh PGS.TS Nguyễn Văn Ri Trần Thị Huyẻn Nga Hà Thị Tâm Tiến Nguyễn Thị Hải Thanh Lưu Vân Quỳnh p r / H À NỘI - 2007 Í TĨM TẮ T NHỮNG KẾT QUẢ CHÍNH CỦA ĐỂ T À I Tên đề tài: Nghiên cứu chiết xuát tinh chế xác định chất hố học, hoạt tín h sinh học m ột vài carotenoid từ m ột số cỏ Việt Nam dùng sản xuất thuốc thực phẩm thuốc C h ti t r ì : PGS TS Nguyẻn Văn M ù i C n b ộ thom ị>ia: TS Phan Quốc Kinh PGS TS Nguyễn Văn Ri Trần T h ị Huyền Nga Hà T h ị Tâm Tiến Nguyễn Thị Hài Thanh Lưii Vân Quỳnh M ụ c liê u n ộ i d u /iịỊ lìg hié n cứu - Điều tra số thực vật phổ biến Việt Nam chứa carotenoid có khả - Chiết xuất tinh chế số carotenoid phục vụ đời sống y dược học -caroten lycopen, lu tein ) đồng thời nghiên cứu số đặc tính sinh học chúng lên thể vi sinh vật, chuột - Thăm dò khả ứng dụng hợp chất vào sản xuất thuốc - Thu thập thực vật chứa carotenoicl - Tách chiết carotenoid hệ dung môi thực phẩm thuốc phục vụ đời sống - Tinh carotenoid sắc kí mỏng điều chế, sắc kí cột gel Silicagel - Nghiên cứu số tính chất hố lý hoạt tính sinh học carotenoid khả chống oxi hoá, kháng khuẩn C c k ế t q u ả đ t - Đã khảo sát thành phần ß-caroten lycopen, lutein từ 31 mẫu thực vật Việt Nam V i kết có hầu hết mầu chứa ß-caroten , lutein, số có chứa thành phần lycopen Trong đó, khảo sát mẫu chứa nhiều ß-caroten biết đến rau ngót, rau sam rau m đặc biệt phát mẫu m ới, có nguồn ngun liệu phổ biến rau dêu Cịn đơi với lycopen, cà chua chín nhũn nguồn cung cấp phong phú Hầu hết mẫu có lutein \ớ i hàm lượng tương đôi cao luy nhién cánh hoa cúc vạn thọ mảu có nhiều - Tách chiết ß-caroten từ rau dệu dung môi ete-dầu, tinh - Tách chiết lycopen từ cà chua hệ dung môi n-hexan ะ axeton - Tách chiết lutein từ cánh hoa cúc vạn thọ hộ dung mơi ete dầu, sắc k í lọc gel Silicagel (6:4) tinh sắc lí lọc gel Silicagel tinh sắc k í lọc gel Silicagel - Thử hoạt tính ba chế phẩm ß-caroten, lycopen, lutein thu lẽn hai enzyme catalase, peroxidase - Thử tác dụng ba chế phẩm ß-caroten, lycopen, lutein thu - Thử tác dụng cùa ba chế phẩm ß-carotcn, lycopen, lutein thu lên lèn khả sinh trưởng 12 loài vi sinh vật chuột cho chúng uống CC14 Tình hình sử dụng kin h phí đề tài K inh phí cấp 60.000.000 Đã chi mục đích kê hoạch thực đề tài Khoa quản lí Chủ trì đề tài ^ Nguyễn Vân M ùi PHĨ CHỦ NHIỄM KHOA Trường Đ ại học Khoa học Tự Nhiên •HÓ Hiệt IA ưÓNO THE M AIN RESULTS OF THK RKSKARCH PROJECT T itle o f the P ro je c i ：S liid y o f extracting, re fin in g , de fin in g chem ical, biological active o f some carotenoids available in Vietnamese vegetation used in p ro tiucing medicines and m edical foods P ro je c t lead e r: Ass Prof Dr Nguyen Van M u i M em bers: Dr Phan Quoc Kinh Ass Prof Dr Nguyen Van Ri Tran Thi Huyen Nga Ha T h i Tam Tien Nguyen Thị Hai Thanh Luu Van Quynh Research o bje ctive s a n d contents: - Investigating vegetation in Vietnam containing carotenoids that could be used for livin g as well as in biology, medicine, pharmacy - Extracting, refining some carotenoids ( а， Д / -carotene, lycopene, lu te in ) and studying their biological activities on organisms such as microorganisms, mice - Surveying the application o f these carotenoids to product medicine, functional food Results: - W e investigated the ingredients o f ß-carotene, lycopene, lutein in 31 samples Most o f samples contain ß-carotene, lutein and some o f them contain lycopene Inside, the samples containing high level o f ß-carotene are S au ro pu s a nd ro gvn u s P o rtu la c a o le ce a , C e n te lla a sia tic a , and especial the new power so ß-carotene - A ỉte rn a n ìh e sessilis About lycopene, the highest level o f it is tomatoes Lutein was found much in fetal O Ï Tagetes erecta i Extracted ß-carotene from A h e n ia n t he r a sessilis by ete petroleum and refined by column chromatography Extracted lycopene from tomatoes by n-hexane: acetone (6:4), and refined by column chromatography Extracted lutein from Tagetes ere cta by ete petroleum and refined by column chromatography Biological study o f ß-carotene, 1y cope ne, lutein preparations on antioxidant enzyme catalase, peroxidase Study the effect o f ß-carotene, lycopene, lutein preparations on the growth o f 12 microboles Study o f ß-carolene, lycopene lutein’s action on mice drunk CClj PHẦN CHÍNH BÁO CÁO M ỤC LỤC Trang M ục Lời m dầu Nội dung Tổng quan tài liệu Đ ịa điểm thời gian nghiên cứu 15 Nguyên liệu, phương pháp 15 3.1 Nguyên liệu 3.2 Phương pháp 15 16 Kết 16 4.1 Khảo sát hàm lượng carotenoi! từ mẫu thực vật bang phương 16 pháp HPLC 4.2 Chiết xuất thu nhận carotenoit sác k ý lọc gel 18 4.3 Xác định hoạt tính chống oxi hố thơ điều kiện in vitro 20 4.3.1 Ánh hường cao thò lỏn hoạt độ enzym peroxidaza 20 máu người 4.3.2 Ảnh hưởng cao thô lẽn hoạt độ enzym catalaza ทา น 23 người 4.4 Xác định hoạt tính chống oxi hoá chế phẩm tinh điều kiện in vitro 4.4.1 Ảnh hường chê phẩm carotenoit lên hoạt độ enzym 27 peroxidaza máu người 4.4.2 Ả nh hưởng chế phẩm carotenoit hoạt độ enzym 31 cataiase máu người 4.5 Xác định khả nãng kháng khuẩn cùa cao thô chế phẩm 35 carotenoit 4.6 Xác định hoạt tính chống o xi hố cùa chẽ phẩm carotenoit 36 điều kiện invi vo 4.6.1 Sự thay đổi khối lượng trung bình chuột trước sau 36 ni thí nghiệm 4.6.2 Xél nghiệm chí số GOT GPT má II chuột 4.7 Xác định khả náng gây độc lẽn tê bào cùa carolenoit lčn 37 39 dòng tế bào ung thư Kêt luận 42 Tài liệu tham khảo 43 LỜI MỞ ĐAU Thiên nhiên ưu đãi cho đất nước ta nguồn tài nguyên động vật, thực vật phong phú, đặc biệt lương thực, chúng không chi cung cấp nguồn thực phẩm hàng ngày mà cung cấp chất phòng chữa bệnh Người ta tiến hành nghiên cứu đê bổ sung vào thực phẩm chất tự nhiên vốn khơng có sẵn thực phẩm Các chất khẳng định có lợ i cho sức khoẻ, có khả nãng phịng chữa số bệnh Chúng bao gồm nhiều chủng loại khác nhau, quan trọng nhóm carotenoid /ì-caroten, lycopen, lutein có nhiều gấc, cà chua, bí ngơ, mướp đắng, cúc vạn thọ Những chất có hoạt tính chống ung vào thực phẩm nhầm phịng chống ung thư lão hố Carotenoid có nhiều loại thực vật, hoa quảm rau xanh, có khoảng 50 loại carotenit hấp thu vào thể phổ biến ß caroten, lycopen, lutein, Zeaxanthin Tuy nhiên s khoa học chế tác động, tương tác chúng với chất oxi hố vẩn cịn nhiều điều cần làm sáng tỏ V i mục đích tìm hiểu rõ carotenoit với tác dụng chúng, định thực đề tài nghiên cứu: “ Nghiên cứu chiết xuất tin h chế xác đ ịn h chất hố học, hoạt tín h sinh học m ột vài carotenoid từ m ột sò cỏ Việt Nam dùn g sản xuất thuốc thực phẩm thuóc ， ， NOI DUN(Ỉ CHINH i TỔNG Q UAN T À I LIỆU * Đặc tính tương tác phím lừcarotenoit in vivo Các carotenoit thường định vị màng tế bào, chúng liên kết thành phần cấu trúc màng với V ị trí carotenoit màng tế bào phu th u ộ c vào cấu trú c phân tử, cụ thê có Khac biệt ca roten xanthophyl Các nhóm tận phân cực xanthophyl lương tác với phần phân cực nằm phía ngồi màng, cho phép carotcnoit chuyển qua lớ p màng kép (Gruszecki & Sielewiesiuk, 1990) Trong đó, caroten với nhóm tận khơng phân cực bị chặn lại lớp màng kép, chúng phải liên kết với protein vận chuyên qua màng M ố i tương tác carotenoit gây ảnh hưởng tới đặc tính chúng Các carotenoit k ị nước mạnh có xu hướng liên kết kết tinh mơi trường dịch thể Sự liên kết đặc hiệu ảnh hưởng tới khả hấp thụ ánh sáng tính chất hố học cùa carotcnoit hình dạng khả hoà tan Trong thực phẩm tự nhiên, carotenoit thường tồn dạng v i kết (inh, lycopen cà chua, khả hồ tan chúng khơng tốt Các đồng phân cis có xu hướng bị kết tinh so với phân trans, đo phân cis có khả hoà tan, hấp thụ vận chuyển tốt * Khả hấp thụ ánh sáng chuỗi poi yen liên hợp Các carotenoit có khả hấp thụ ánh sáng mạnh quang phổ nhìn thấy để nhằm chuyển điện tử từ trạng thái tới trạng thái kích thích Dải hấp thụ ánh sáng chủ yếu khoảng 400-500nm, carotenoit chủ yếu có màu vàng, da cam, đỏ Quá trình tạo thành carotenoit triplet trực tiếp từ trạng thái singlet kích thích không dễ dàng lấy nàng lượng từ phân tử trạng thái triplet khác truyền tới hình thành carotenoit triplet lại thuận lợ i hơn, nâng lượng cùa carotenoit có nhiều háy liên к ỐI đôi trạng thái triplet thấp BÁO CÁO KHOA HỌC HÓI THẢO КНСЧ QÜÀ.4 L ì NÒNG HỌC vi PHÁT TRIỂN NÒNG NGHIỆP BỂN vững ỏ VIỀT nam Hình 3: sác kỷ đồ chạy H P LC gấc với p-caroícn chuẩn (a) sắc ký đổ HPLC cùa gấc non (b) sắc ky đổ HPLC gấc bánh iè (c) sắc ký đổ HPLC cùa gấc già (d) Từkếi quảtrẽn, tacóbảngtổngkết sau: Hình 3b 3c, 3d có đình thời gian lưu 3.7 phút, thời gian lưu cùa ß-caroten Như vậy, thời kỳ sinh trường khác nhau, hàmlượng p-caroien hoàn toàn khác Nhiều bánh tẻ với 8 % tiếp đến già 67%, cuối lú non 62% Mặc dù lượng ß-caroten có biến dổi theo thời gian, có lâng giảm rõ rệt, lúc nàocũng tổn mội lượng lớn chất Từ dó, chúng lỏi dến kết luận vàđé xuất m ột phươngánsửdụng hợp lý nguổn nguyẽn liệu Đây kết đáng quan tâm Đậc biệt loại dược trổng nhiểu miền đất nước Trong tương lai nguổn nguyẻn liệu chắn cịn nhiổu tính hữu dụng thiết thực Điều tra hãmlượng ß-carot^n »I.ongqtiả gấctị vàgấcnếp Từ hình 4, ta ihấy p-carotencó thời gian lưuờ phú( thứ8 Nhưvậy, phần Ihịt v n g , hàm lượna p -carotcn gấc tè59%nhiểu hẳn sovới gấc nếp39% Tuy nhiên, m àngđỏ h » gấc nsược lai Lượngchấi nghiẽncứu ờgấcnếp 10%lại lớn hơngấc lè 6% Phổ hấpphụcủacácchát chạy HPLCờbướcsóns /.= 466nm BÁO CÁO KHOA HOC HÓI ĩ HÁO KHCN OUẢN LY NỊNG HỌC Vi í,ư PHÁT TRIẺN nóng NGHIÉP bến vững ò VIÉĨ nam H'wh 4: Sắc kỷ đồ chạy HP LC cùa gấc với ß carolen chuẩn (a) sảc ký dổ HPLCcùa Ihịi vàng gấc nếp (b) sắc ky đổ HPLCcùa ihịl vàng gấctè (c) sắc ký đổ HPLCcủa màng dò hại gấc nép (d) sâc kỷ đổ HPLCcùa màng dò hạt gấc tẻ (e) G ấc dối tượngđược nghiên cứu sâudocó chứa nhiéu ß-carᄋten Hiện nay, quà gấc nguổn nguyên liệu để sàn xuất thuổc bổ m ắt, thực phẩmchức Chung lơi chọncác quảgấc chín nhũn, đólượngß-carotendãchuyểnhố phần 10ฑthành iycopen, mội carotenoit có hoạt tính lương lự Bời vây mà kết thu dược hàm lượng ß -Carolen thấp Q gấc chín, hàmlượng ß-caroten thấp N gược lại, lượng lycopcn lăng lên Vì thế, thu m ẫu, tùy theo m ục đích khai thác m lụa chọn gấc cho phù hợp để tránh sai SĨI tách chiết diểu chế Chính thế, chúng (ịi (iến hành thí nghiệin để việcchọn lựađối tượngnghiêncứuphải gắn lién với m ụcdich Tùy thuộc vàodó m thu hái nguyênliệu thời kỳ chứanhiềuhợpchất quanlãmnhất P.auXfTïa'j 7,lcđ 75 10.0 Deí.A C h1/457nm ' ะ ' -0-9-4 v о 니 - о 5-5 -ไ r,*■ "4'6r9 l ร оо .ไ о -— - -І Iร í І-Т- - - -Л-4 ' Is,9l8l3:rl r2 i r-s- , 5:9 -I s 1:9 e 1i Ị j l : ! s ; 그feỊ?ĨJ v> H eiuht ： ' 55 i 27S92 14928 ÃỈ5Ĩ 630 !7S 1699 77：1 S3~-l 903 그 ： ： Лгеа Ч о 7.700 ^ 19.0IS 13.187 5ťs 2.562 1.547 28.762 S.275 13.43'i ' ' 100.000 ᅭ 6.09! 30.s：< f6.5I( 5.04( 2.911 1.97: 그 ： S5 : 6; 0 0 ! 12/20'2005 10 23 15 ỈM u i II I с A ะShimadzu LCsoluti이ไ Analysis Report : La can I.： ： у - іи іе ш (5 Л ： nod File Name Ж 7 •■ บ Í о ； íiromatogram> Caroien icr ■ ' • л File Name '3 Acquired •.Ĩ Processed •^ C： \LabSo!ut： ofìs\N gaT\R au\m aui9 lcđ 0-00 s о -7ร-ч1 ;• : s ч6.21 -7 12-Ir-2 O'о o- r' .\ I O โ - 9' ' ： / : ' T ~ 1ร : 15537 6206 S50 и р •■ 이 -一 フ ： 585 ะS693 14672 396：' ：]： ร่ Iᅳ - ： Ü5SÏ'301Š6! 70S 54789 1746 28570 28S62 3922S9' 95667 20S246 Ơ ã'' '.493 ' : : - : 4.57'/ ãẻ.767 ^ 5.0:4 5.695 '■ 6.60 6.8S1 ' i l o i i ᅳ ~sl5l9 Ị T I l i t r Ị > i7 í Ị ᅳ l3 i :9 о l i9 : o о -o i s l 9O i ᅳ ! r о < _• -8.г-Iо31-— v "l ị — ^ о -1 п — 0T ~ Deiecior A Chi 457nm /2 D 10 14 20 i Illi l ụ c : Shimadzu LCsolution Analysis Report ะ ru p ie:'ว ； ; -|!0กVolume •3 File Name '1！ •1od File N a n e ： ； h File Name •ะอเ1 F.ie Name 1/25/2005 04 42 AM ； hrornatogram> C:\LabSo'u!ions\NgaT\Raน\mau01 led 75 о 3" " ' '6.098 6.50? 4.7M 5： 4?0' r: :: : -9 - I; - Tota] п 3.67 ' f' ᄀ Ỉ ᅳ— ᅳ HF Ія:- 3.47 l :9;2 ! o J • ฯ б l 一Ư о i^ 16 一IỊ-0 iị г3 ;-6 r is û — с о - % ! j 2: ■ - 니 i 3.120 7-4-T^si Ioll 7-1 ： ba 51 -v -4 -І 65 -9 p Ir i 5о ; І 3-0ร ᅳ i1 2І 1І 4t ร 6: — З Т І: Ị i ị ᅳ e3 ᅳ !e |ị I二 一l 一 z : Ỉ 'r ?r 6 - -Ị p І7 ІГ І.一 « i o i ; :7l6~6jf~ l6 l!6 ! ; * s 6 6ᅳ -1 ท7 u 、2 15 ; 「 ᅵ 3!6lr3ị8 !8 — ᅭ Ị ị3|기 ᅳ i ᅳ 6~ ;iv ak Detector A Ch i 437nm Peak- ^ Rei Time" _ Hciclit % 3.S13 22.기 Ị 9.399 3.297 6.649 4.024 40.105 Ï 00.000 IM)Il lue : Shimadzu LCsᄋlution Analysis Report ะ Phan Ti cíl ia đ í ■* Lu： e- ГГ.Зน02 !cJ Caren leโฑ Default 1er 11/25/2005 ใ 20 53 AM ไ/25/2005 1.35 55 А!и jhrom atogram > C:VLabSolut； ons\N gaBRau\m au02.lcd 0.0 5.0 7.5 10 12.5 Det A C h ； 457nm С 'L a b S ไ.'1'.) ! !о ? Ч ЧІ ■ไr： T \ R ท-;' ■'! Č L' โ12 12/20'ะ ::ร 10 56 57 I r h ụ lục ะShimadzu LCsolution Analysis Report ===== Hoa Phan Tich La ngai cuu : Wau -cưirad by 1,ліріе Name jmple ID ■ > ,!ร "eclion Volume 3Ỵ3 File Name etr.od File Name atch File Namร eport File Name ata Acquired sia Processed : Default 1er 11/24/2005 5:28.45 AM 11/24/2005 5.43:48 AM Chromatogram> C:\LabSDiuiions\NgaT\Nao\mau49 led Det.A Ch1/457nm :； 10 0-9 - ร 4-ร ■ ol 9A о -Г-4-5 3lo;3-fo-6-s:6> j :s ! ; 4• 1о -I9 ᅳ -l 33 3l1 -< 7ᄀ ị ' isht_^ เ- ' ท L К -8 — -4 _sч • 니l/ lii c loм llЧ l9 7l219: M3 o IỊ ọ :: z; J- S - о о ร-6 -Л - 4-6-7 ' IІ І3 1: 'ᄋ-l o зк ᅳоі4시 o т -о ■% 'J-1 4? ю 65 J ᅳ i 13: , Ị! И • Toul - 피IS Иi 26 2j ~4 T967 > , '9 I r І І5一 J4 ■나 -4- -JT -V -J 5; -9 T 二 : 07 ;o.-s V -S ir -!I6l l ü:9 7- I6 ; :т ,9 l-r lK !s oi l 3~ -t j I Ị 11 ^ 754 ' 6.6S7 i_ pị p _ i 4.310 4.599 4.7S2 5.130 І9І2І5ᅳ6 -3 s6 -6 ! r1 1s ᅳ 51 ᅳ v-2 irjIf 43T 99 ~ Ịị ! I I 76 4I- - - - о о一 s一 Ìᅳ !сГ Igj54 2=i2 Detector A Chi 43/nm Peak? Rei Time -о /2 ;2 05 10 57 57 Phụ lục Shimadzu LCsolution Analysis Report ะ H oa Phan T icu La na cuu *Iute!n(5/1) d Fàcile Name : D efault.1er 11/2 4/2005 6:04:07 AM ' 11 '2 A Ì2 Q Q 55 :ไร 09 AM C.\LabSolu!ions\N gaT\N ao\m au51 led ... QUẢ CHÍNH CỦA ĐỂ T À I Tên đề tài: Nghiên cứu chiết xuát tinh chế xác định chất hoá học, hoạt tín h sinh học m ột vài carotenoid từ m ột số cỏ Việt Nam dùng sản xuất thuốc thực phẩm thuốc C h... NG H IÊN c ứ u KH-CN Ténđếtài： Nghiên cứu chiết xít tỉnh ché xác định chất hố học, hoạt tính sinh học vài carotenoid từ số cày cỏ Việt Nam dùng sản xuất thuốc thực phâm tluióc Chủ tri dềtài:... tin h chế xác đ ịn h chất hố học, hoạt tín h sinh học m ột vài carotenoid từ m ột sò cỏ Việt Nam dùn g sản xuất thuốc thực phẩm thuóc ， ， NOI DUN(Ỉ CHINH i TỔNG Q UAN T À I LIỆU * Đặc tính tương