TAP CHÍ KHOA H O C ĐHQGHN KHTN & CN T.xx sò 2PT 2004 N G H IÊ N C Ứ U Ả N H H Ư Ở N G C Ủ A M Ộ T s ố Y Ê U T ố Đ Ế N V IỆ C X ÁC Đ ỊN H A S E N T R O N G N Ư Ớ C BẰNG VI K H UẨN CHỈ THỊ P h m T h ị K im T n g , N g u y ề n V ă n M ùi K hoa S in h học, Trường Đ ại học Khoa học T ự nhiên, Đ HQ GHN P h m T h ị D ậ u , P h m H ù n g V iệt T rung tâm N ghiên Cứu Công nghệ Môi trường P hát triển Bển vững Trường Đại học Khoa học T ự nhiên, Đ HQ GHN M ic h a e l B e rg , J a n R V a n D e r M ee r Viện K hoa học Công nghệ Môi trường, Liên bang T huỵ sĩ Đ ặ t v â n đ ề o nhiễm asen (thạch tín) nưốc ngầm tượng có nguồn gốc tự nh xuất ỏ nhiều quốc gia trê n th ế giối có Việt nam Ở nhiều vùng nóng thơn Việt Nam, nước ngầm nguồn nưđc chủ yếu dùng cho ăn uốhg sinh hoạt Việc sử dụng nguồn nước thịi gian dài có th ể dẫn tói sơ' bệnh cho ngiíời bệnh ung Ihư da, ung thư phổi, rối loạn sắc tố da Do vậy, việc khảo s t xác định mức độ ô nhiễm asen nước giếng khoan vô cần th iết [1,4] Để phản ánh dũng trạn g ô nhiễm asen, ta cần phái phân tích tạ i giếng nên lượng m ẫu cần kiểm tra lốn, rấ t tôn sử dụng phương pháp phân tích truyền thơng phịng th i nghiệm khôi phổ cảm ứng plasm a (ICP-MS), quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) Do dó cần có phương pháp phân tích trường có chi phi tháp Hiện nay, m ột sò* vi khuân chi thị (Biosensor) dùng để xác định hàm lượng asen nước dà nhà khoa học th ế giới nghiên cứu chế tạo Ưu điểm dễ sử dụng, s u â t ph ân tích cao, giá thành rẻ, cỏ đáp ứng dặc hiệu vói asen, độ nhạy độ xác cao [3,5] Vi khuẩn tiếp xúc với asen tạo enzym luciferaza, oxy hoá n-decanal th àn h ax it n-decanoic Phản ứng phát ánh sáng ỏ bước sóng 490nm dược đo th iế t bị đo ánh sáng (Luminometer) Vi khuẩn có đáp ứng r ấ t tố t với asen dung dịch chuẩn, mẫu nước ngầm thường có th àn h phần phức tạp đặc biệt chứa s ắ t với hàm lượng cao có ảnh hưỏng xấu tới khả làm việc chúng Mục đích báo nghiên cửu ánh hường m ột số yếu tô' đến việc xác định asen th ị vi k h u ẩn (2,3,6] Đ ố i tư ợ n g v p h n g p h p n g h iê n c ứ u 2.1 N h ả n g iô n g bảo q u n vi k h u ẩ n Chung vi kh u ẩn E.coli DH5a (pJAMA-arsR) có khả nảng p h át asen nồng độ rấ t thấp O.OõụM (4jig/l) tạo n h khoa học thuộc nhóm sinh học phân từ Tiếnsĩ JanRoelofVanDerMeer, ViệnKHvàCNMôi trườngLiênbangThuỵsĩ Giốngvi khuẩn dược nuôi cấy môi trường Luria-Broth (LB) m áy lắc ôn nhiệt 37°c 178 Nghiên CỨII ánh Imởng mội số yếu lổ dến việc xác định ■ 179 Dịch vi kh u ẩn thu trộn lần vói glycerol 87%, chia vào ô’ng Eppendorf vô trùng (với th ể tích l,3m l) bào quản tủ lạnh sâu -80"C [6], 2.2 Phép đo ho a t tín h đ p ứ n g với asen củ a vỉ k h u ẩ n c h ỉ th ị Ông giống làm tan đá trộn với 10ml mơi trường lỏng LB Đo hoạt tính vi khuẩn: trộn 500^1 m ẫu nước chứa asen với 500^1 dịch vi k h u ẩn lắc â 30"C, bổ xung dung dịch n-decanal đo cường độ ánh sáng trê n m áy J u n io r LB 9509 Lum inom eter Các thí nghiệm đểu lặp lại lần, lấy tru n g bình Đơn vị tín h cường độ ánh sáng (RLƯ), m ẫu đối chứng m ẫu không chứa asen khơng bổ xung hố chất 2.3 T hí n g h iệm tối ưu thờ i g ia n tiếp xú c a sen h m lượ ng ch ấ t Khi vi khuẩn tiếp xúc với asen tạo enzym luciferaza xúc tác cho phản ỏng chuyển hoá chất (phản ứng p h t quang), P hản ứng phụ thuộc vào lượng enzym chất, cần phải tối ưu thời gian tạo enzym (thời gian vi khuẩn tiếp xúc vối asen từ 30 120 phút) lượng chất (n-decanal từ 0,125 - 2mM) nhằm tạo đáp ứng lớn cho hệ thông 2.4 T hi n ghiệm đ n h g iá ả n h hưởng s ắ t chọn lự a hoá c h ấ t bảo q u ả n m ẫu nước ngầm Nước ngầm chứa nhiều asen thường có hàm lượng s ắ t cao từ 100-600 nM, hàm lượng s ắ t cao nh gây ảnh hưởng không tố t cho phép đo Để đánh giá ảnh hưởng s ắ t tới hoạt tính vi kh uẩn chúng tơi tạo m ẫu chứa asen có F e l+ thay dôi từ 0lOOOnM (FeCla.8H30 , analytical -Sigma) môi trường tru n g tín h pH Các axit HC1, HNO;i, H.,SOj, H3PO., (Merck) đùng để tạo pH D ung dịch pyrophotphat 200mM bổ xung đế' tạo mơi trường có pH 6,8 điều kiện phù hợp cho enzym luciferaza có hoạt tính cao Các chất tạo phức với s ắ t dùng muôi T ri N atri N itrilotriaxetat m onohydrat (C6H6NN a30 6.H20-NTA-Fluka), D iN atri etylendiam in tetra a x e ta t dihydrat (C10Hu N2Na2O8.2H2O-EDTA-Fluka), N atri pyro p hotphat (Na4P9O7.10H2O-Sigma) vối nồng độ từ 0,1-1 raM, Kết bàn luận 3.1 Tối ưu h m lượ ng ch ấ t thời g ia n tiếp xú c với asen K ết th í nghiệm tối ưu thịi gian tiếp xúc với asen cho thấy cường độ ánh sáng tăng lên ủ vi khuẩn mõi trường có chứa 0,65jxM ase n từ 30 ph ú t đến 120 ph ú t đ ạt cực đại khoảng 90 p h ú t sau có chiều hướng giảm (hình 1) N hư vậy, thòi gian tiếp xúc vối asen ngắn, tế bào vi khuẩn chưa đủ thời gian để hồi phục sinh lý thực Phạm Thị Kim Trang Nguyôn Vãn MÙI bước nhặn dạng asen [2] Các tác giả báo sô [6] dùng thời gian tiếp xúc 60 phút gợi ý có th ể kéo dài khoảng thịi gian Nhưng k ết th i nghiệm cho thấy kéo dài thời gian 90 ph ú t cường độ ánh sáng giảm, có th ể giải thích tồn q lâu mơi trường chứa ch ấ t độc asen vi khuẩn làm x u ất ảnh hưởng bất lợi đến sinh lý tế bào N hư vậy, với k ết tìm chúng tơi thấy thời gian tiếp xúc với asen 90 ph ú t ưu Hình Ảnh hưỏng thời gian tiếp xúc giũa asen vi khuẩn chì thị E.cõli DH5a (pJAMA-arsR) Hình Tối ưu nồng độ chất ndecanal cho phản ửng xúc tác bâi enzym luciferaza Lượng chất n-decanal cần tối ưu thiếu th i độ nhậy phép đo khơng đ ạt gía trị tối ưu cịn cao q thừa lượng enzym luciferaza sinh có hạn Các tác già [6] sử dụng lượng n-decanal 2mM th nghiệm lượng n d ec an a l từ 0,125-‘2 mM thấy giá trị bão hoà b ắ t đầu đ t ỏ khống mM (hình 2) Các điều kiện th í nghiệm dã tối ưu sử dụng cho th í nghiệm 3.2 Đ n h g iá ả n h hư ởng s ắ t chọn lựa hoá c h ấ t bảo q u ả n m ẫ u nước ngầm Khi phân tích asen nước ngầm có nhiều s ắ t có th ể có hai ản h hường làm giảm phát asen vi khuẩn thị Thứ nhất, s ắ t k ết tủ a tạo th àn h hydroxỵt sắt (III) phản tử asen bị hấp phụ lên nên hàm lượng asen hoà ta n dung dịch tiếp cận vâi vi k h u ẩn giảm Ngoài ra, hàm lượng s ắ t cao gây b ấ t lợi cho hoạt động sinh lý bình thường vi khuẩn Kết hình cho thấy tác hại s ắ t với hoạt tính p h át ase n vi khuan Cường độ ánh sáng giảm rấ t nhanh lượng sắt tăng từ 0-500 ỊiM T ín hiệu giảm khoảng 50% s ắ t 25 (iM giám hoàn toàn hàm lượng s ấ t 500 nM H iện tượng xảy asen bị hấp thụ vào h t s ắ t k ết tủ a nên khơng cịn đủ để gãy cảm ứng với vi khuấn chi thị Hình 3: Ảnh hưởng cùa sắt tói hoạt tinh đáp ừng với asen cùa vi khuẩn thị Hình 4: ành hưởng cùa việc axit hố tạo phức tói đáp ửng với asen cùa vi khuẩn chi thị (mẫu đơì chửng mẫu không bổ xung axit chất tạo phức) Với mẫu nước có pH ngăn cản k ết tủa s ắ t tạo điều kiện cho asen tồn tự dung dịch tiếp xúc vối vi khuẩn, đường biểu diễn cho thấy cường dộ ánh sáng không giảm dột ngột m ổn định cho tối hàm lượng s ắ t đ ạt 250nM, có thê cho rằ n g hoạt tính vi khuẩn thị asen bị ảnh hưởng xấu nồng độ s ắ t lốn 250|jM N hư vậy, so với trường hợp khơng axit hố m ẫu ta có th ể sử dụng vi khuẩn thị để xác định hàm lượng asen khoảng nồng độ s ắ t rộng (0-250^iM) mà không gáy giảm nh iều hoạt tính vi khuẩn Tuy nhiên, xét riêng vùng có hàm lượng s ắ t nhỏ (0-25|iM) ta thấy khả dáp ứng vi khuẩn thị giảm nhiều m ẫu axit hoá so với m ẫu tru n g tính Như vậy, mơi trưịng axit q trìn h bổ xung pyrophotphat trung hồ lại có th ể gây h ạn chế cho hoạt động vi kh u ẩn thị, vấn đề cần tối ưu nhằm khai thác khả p h át asen vốn có cùa vi kh u ẩn thị Kết từ hình cho thấy số axit sử dụng để bảo quản m ẫu th ì HNO có đáp ứng cao mối đến ax it HC1 Axit H3P coi chất bảo quản tốt cho mầu chứa asen phân tích kiểu hố học vâi trường hợp có th ể gây nèn ức chẽ cho vi khuẩn cấu trúc tương tự p h otphat a se n at [2,6] Còn H2S thể ảnh hưởng sô’ axit sử dụng, điều có th ể giải thích tinh oxy hố q m ạnh Trong thí nghiệm khảo s t vai trò cùa chất tạo phức với s ắ t với nồng độ từ 0,1-1 mM thấy nồng độ 0,4 mM vi khuẩn thị có đáp ứ ng cao với ba loại muối nói ỏ mơi trường có bổ xung EDTA vi khuẩn có đáp ứng cao so vói NTA Phạm Thị Kim Trang Nguyền Vãn Mùi pyrophotphat không ax it nitric N hư từ k ết th u sứ dụng ax it nitric đê làm hoá chất bảo qu ản cho m ẫu nước thử nghiệm với vi khuẩn chi thị asen N hư vậy, s ắ t nước ngầm có ản h hường khơng tố t tới q trìn h xác dính asen băng vi k h u ẩn th ị E.coli D H 5a (pJAMA-arsR), nhược điểm có th e khắc phục nhị việc axit hố m ẫu bằn g ax it nitric tới pH sau trung hồ lại pyrophotphat Phép hàm lượng asen có th ể thực sau nuôi vi kh u ẩn chi thị mơi trường có chứa asen 90 ph ú t bô’ xung lượng c h ấ t n-decanal với nồng dộ mM Sàn phẩm cần dược thử nghiệm thự c tiễn với m ẫu nước ngầm thực có th àn h phần hố học khác nhằm đánh giá tín h k h ả th i phương pháp xác định hàm lượng asen nưóc ngầm vi kh u ẩn thị TÀ I L IỆ U THAM KHÀO Berg, M., T ran , H-, c , N guyen, T., C-, Pham , H V., Schertenleib, R., Giger, w , Arsenic contam ination o f groundw ater a n d dringking water in Vietnam: A hum an health threat E nvironm ent Science Technology 13, 2001, pp 2621-2626 D aunert, s , B arrett, G., Feliciano, J , s , S hetty, R., s., S hrestha, s , Sm ith-spencer, w, G enetically E ngineered Whole-Cell Sensing System s: C oupling Biological Recognition w ith R eporter Genes, Chem , Rev, 100, 2000, pp 2705-2738 Kinniburgh, D., G., Kosmus, w , Arsenic contamination in groundwater:some analytical Phạm Thị Kim T rang, Nguyễn văn Đản, Phạm H ùng Việt, nnk, Bước đầu nghiên cứu considerations T a la n ta 58, 2002, pp 165-180 s ự ô nhiễm asen nước ngầm ngoại thành Hà nội, Tuyến tập báo cáo khoa học Tiếu ban K H liên ngành K H C N m ôi trường, Trường Đại học K hoa học Tự nhiên, ĐHQG H Nội, 2002, tr 65-71, R ahm an, M., M,, M urkherjee, D., Sengupta, e t al, Effectiveness a n d reliability o f Arsenic field testing kits: are the m illion dollar screening projects effective or not?, Environm ent Science Technology, 36, 2002, pp 5385-5394 Ổ Stocker, J B alluch, D., G sell, M., H arm s, H., Feliciano, J , D aunert, s Malik, K., A., van d er M eer, J., R, Development o f a set o f sim ple Bacterial Biosensor for quantitative a n d rapid m easurem ents o f arsenite a n d arsenate in potable w ater, E nvironm ent Science Technology 37, 2003, pp 4743-4750 Nghicn cihi ánl) hướng cùa mõi sò veil lố đến việc xác định 183 VNU JOURNAL OF SCIENCE Na! S c i & Tech., T.xx N02AP 2004 S T U D Y IN G O F T H E E F F E C T S O F F A C T O R S O N T H E D E T E R M IN A T IO N O F A R S E N I C I N W A T E R B Y B I O S E N S O R T r a n g P h a m T h i K im , M u i N g u y e n V an Departm ent o f Biology, College o f Science, VN U D a u P h a m T h i, V iet P h a m H u n g The Centre fo r Environm ental Technology a n d S ustainable Development, Hanoi College o f Science, V N U ■Hanoi M ic h a e l B erg, J a n R V a n D e r M eer Sw iss Federal Institute for E nvironm ental Science a n d Technology, Sw itze rla n d Arsenic (As) contam inated groundw ater problem h as been found in m any countries in the world-included V ietnam It has requested developm ent of new, efficient and economic quick test facilities beside expensive and sophisticated in stru m en t a s atom ic absorption spectrom etry (AAS) Arsenic bacterial biosensors E.coli D H 5a (pJA M A arsR ) (nonpathogenic laboratory strain) can determ ine arsenic a t level o f 0.05 (4ppb) Hydroxide iron (III) in th e groundw ater will precipitate and absorb arsen ic in th e presence of oxygen Experim ents checking the abilities ag a in st th is phenom ena by adding several acids a s HC1, H N 3, H.,S04 H3P an d chelators a s (CliH 6N N a 30(i.H 20-NTA), (C|0H|,N-,Na.,08.2H^0- EDTA), (Na4P ,0 7.10H20 ) shows th a t HNOa h as b est effect Optimizing experim ents for th e testing procedure show th a t m axim um arsenic sensor ability will be reached after 90 m inutes of incubation tim e w ith arsenic an d Im M su b strate n-decanal is the best T he arsenic biosensor E.coli DH5 (pJAM A-arsR) should be tested for its reliability by using real groundw ater sam ples w ith different m atrix ... asen bị hấp thụ vào h t s ắ t k ết tủ a nên khơng cịn đủ để gãy cảm ứng với vi khuấn chi thị Hình 3: Ảnh hưởng cùa sắt tói hoạt tinh đáp ừng với asen cùa vi khuẩn thị Hình 4: ành hưởng cùa vi? ??c. .. độc asen vi khuẩn làm x u ất ảnh hưởng bất lợi đến sinh lý tế bào N hư vậy, với k ết tìm thấy thời gian tiếp xúc với asen 90 ph ú t tơi ưu Hình Ảnh hưỏng thời gian tiếp xúc giũa asen vi khuẩn. .. m ẫu nước ngầm Nước ngầm chứa nhiều asen thường có hàm lượng s ắ t cao từ 100-600 nM, hàm lượng s ắ t cao nh gây ảnh hưởng không tố t cho phép đo Để đánh giá ảnh hưởng s ắ t tới hoạt tính vi kh