Sử dụng hạt nano từ tính mang thuốc để tăng cường khả năng ức chế vi khuẩn của thuốc kháng sinh chloramphenicol

Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ 24 (2008) 192-204 Sử dụng hạt nano từ tính mang thuốc để tăng cường khả ức chế vi khuẩn thuốc kháng sinh Chloramphenicol Nguyễn Hoàng Hải1,*, Cấn Văn Thạch1, Nguyễn Hoàng Lương1, Nguyễn Châu1, Khuất Thị Thu Nga2, Nguyễn Thị Vân Anh2, Phan Tuấn Nghĩa2 Trung tâm Khoa học Vật liệu, Khoa Vật lý, Trường ðại học Khoa học Tự nhiên, ðại học Quốc gia Hà Nội, 334 Nguyễn Trãi, Hà Nội, Việt Nam Trung tâm Khoa học Sự sống, Khoa Sinh học, Trường ðại học Khoa học Tự nhiên, ðại học Quốc gia Hà Nội, 334 Nguyễn Trãi, Hà Nội, Việt Nam Nhận ngày tháng năm 2008 Tóm tắt Hạt nano từ tính Fe3O4 chế tạo phương pháp đồng kết tủa có kích thước từ 10 đến 30 nm, có tính siêu thuận từ với từ độ bão hịa cực ñại ñạt ñến 74 emu/g Biến thiên entropy từ cực đại đạt 0,825 J/kg.K vùng nhiệt độ phịng Hạt nano từ tính bọc hai lớp chất hoạt hóa bề mặt axít oleic natri dodecyl sulfate Thuốc kháng sinh Chloramphenicol (3 % khối lượng) ñược nhồi vào khoảng trống hai lớp chất hoạt hóa bề mặt nói để tạo phức hệ hạt-thuốc Thí nghiệm kiểm tra q trình nhả thuốc phức hệ hạt-thuốc lên vi khuẩn Escherichia coli cho thấy thuốc kháng sinh mang phức hệ có thời gian tác dụng lên vi khuẩn lâu thuốc kháng sinh đối chứng Từ khóa: Hạt nano từ tính, Fe3O4, Magnetite, Lý sinh học, Giải thuốc có điều khiển Mở ñầu* nhân, dung giải thuốc [3,4] ðối với dung giải thuốc, cách hạt nano từ tính gắn kết với thuốc, lưu thông thể, tác dụng từ trường mà phức hệ hạtthuốc ñược dẫn ñến vị trí mong muốn thể Do đó, hiệu thuốc tăng lên đáng kể Các thơng số quan trọng ảnh hưởng đến q trình dung giải tỷ phần thuốc phức hệ hạt-thuốc, khả phân tán phức hệ dung mơi, tính tương hợp sinh học độ ổn định mơi trường làm việc Có nhiều cách để gắn thuốc với hạt nano sử dụng gắn kết hóa học liên kết ion [5] Tuy nhiên phương pháp ñó phức tạp bao gồm nhiều Chất lỏng có từ tính chất lỏng bao gồm hạt nano từ tính chức hóa bề mặt ñể cho ứng dụng vật lý, hóa học, môi trường [1] sinh học [2] ðặc biệt ứng dụng chất lỏng từ sinh học ñược nghiên cứu nhiều vài năm trở lại ñây Những ứng dụng phổ biến chất lỏng từ tính sinh học tách chiết DNA, tách chiết tế bào, trị nhiệt từ, tác nhân tăng ñộ tương phản cộng hưởng từ hạt _ * Tác giả liên hệ ðT: 84-4-5582216 E-mail: nhhai@vnu.edu.vn 192 N.H Hải nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên Công nghệ 24 (2008) 192-204 bước khả mang thuốc hạn chế Các phương pháp khác bao bọc hạt nano từ tính polymer tự hủy poly(DL-lactideco-glycolide) hay dendrimer gây suy giảm ñáng kể từ ñộ Gần ñây, phương pháp mang khoảng % khối lượng thuốc doxorubicin hydrocloride với hạt nano từ tính ñã ñược nghiên cứu [6] Theo nguyên lý hạt nano ñược bao bọc hai lớp chất hoạt hóa bề mặt axít oleic pluronic acid phân tán nước ñược ñiền kẽ thuốc vào khoảng hai lớp chất hoạt hóa bề mặt để tạo nên phức hệ hạt-thuốc Phức hệ nói có từ tính mạnh phân tán nước có triển vọng đề điều trị bệnh ung thư Bài báo trình bày nghiên cứu chúng tơi sử dụng hạt nano từ tính bao bọc hai lớp chất hoạt hóa bề mặt axít oleic (OA) natri dodecyl sulfate (SDS) sử dụng nguyên lý tương tự ñể nhồi thuốc kháng sinh Chloramphenicol (Cm) vào khoảng hai lớp chất hoạt hóa bề mặt Khả mang thuốc, nhả thuốc thử nghiệm tác dụng thuốc gây ức chế phát triển vi khuẩn Escherichia coli (E coli) trình bày Thực nghiệm Hạt nano từ tính có kích thước 10 nm – 30 nm ñược chế tạo phương pháp ñồng kết tủa ion Fe3+ (FeCl3.6H2O) Fe2+ (FeCl2.4H2O) OH- nhiệt độ phịng mơi trường khơng khí Trong phản ứng, nồng độ ion Fe2+ ñược thay ñổi 0,001; 0,002; 0,005; 0,01; 0,02; 0,05; 0,1; 0,15; 0,2; 0,25 M/l nồng ñộ ion Fe3+ ñược thay ñổi tương ứng ñể cho tỷ phần mol Fe3+/Fe2+ ln giữ khơng đổi ðể tránh tượng Fe2+ chuyển thành Fe3+, dung dịch chứa muối 193 nhỏ HCl cho pH dung dịch thí nghiệm ñược thực cho tác ñộng ánh sáng bên ngồi mức tối thiểu Trong thí nghiệm điển hình, lấy 3,98 g FeCl2.4H2O 10,82 g FeCl3.6H2 O hòa tan vào 200 ml nước cất lần Hòa tan 18 ml dung dịch NH4OH 25 % vào 100 ml nước cất ñể thu ñược dung dịch kiềm Nhỏ dung dịch chứa muối sắt vào dung dịch kiềm ñể tạo kết tủa màu ñen hạt nano magnetite Fe3 O4 Sau phản ứng, hạt nano ñược rửa nước cất từ trường nam châm lần để loại bỏ hóa chất cịn dư ta hạt nano từ tính magnetite Fe3O4 ðể thực phép đo từ nhiệt, chúng tơi lấy mẫu với nồng ñộ tiền chất 0,02 M/l dạng bột trộn với epoxy để khơ từ trường T ñể tạo thành mẫu bột ñịnh hướng ðường cong từ hố mẫu ño nhiệt ñộ khác từ 150 K ñến 400 K từ trường song song với từ trường dùng ñể ñịnh hướng mẫu Kết ñược sử dụng để tính tốn biến thiên entropy từ mẫu ðể phân tán hạt nano vào dung môi hữu cơ, chúng tơi lấy 0,5 g hạt nano từ tính chứa 20 ml nước khuấy mạnh với 10 ml axít oleic (9Octadecenoic acid C18H34O2, số ñăng ký CAS: 112-80-1) thời gian 30 phút ñể tạo lớp OA bao bọc quanh hạt nano thơng qua tương tác nhóm carboxyl OA với bề mặt hạt Sau thời gian khuấy hạt nano từ tính chuyển từ pha nước sang OA làm cho OA ban ñầu suốt trở nên có màu đen pha nước có chứa hạt nano có màu đen trở thành suốt khơng cịn hạt nano Loại bỏ phần nước rửa OA dư n-hexane lần sử dụng phương pháp tách từ ñể thu ñược hạt nano bao bọc OA (NPOA) phân tán 20 ml n-hexane 194 N.H Hải nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên Cơng nghệ 24 (2008) 192-204 ðể bao bọc hạt nano hai lớp chất hoạt hóa bề mặt, khuấy dung dịch có chứa hạt nano nói với 40 ml dung dịch có chứa g natri dodecyl sulfate (natri lauryl sulfate C12H25OSO3 Na, số ñăng ký CAS: 151-21-3) thời gian h Sau khuấy, hạt nano n-hexane chuyển sang nước Loại bỏ nhexane, rửa tách từ lần nước cấy ta thu ñược hạt nano bao bọc hai lớp chất hoạt hóa bề mặt OA SDS (NP-OA-SDS) phân tán 20 ml nước ðể nhồi thuốc kháng sinh Cm lên hạt nano từ tính, 96 mg Cm hịa tan 2,5 ml ethanol sau nhỏ thêm nước cất ñể thu ñược 10 ml ðổ 10 ml dung dịch chứa Cm vào 20 ml dung dịch chứa NP-OA-SDS khuấy ñều máy khuấy từ 15 h Sau đó, thuốc kháng sinh cịn dư loại bỏ tách từ rửa nước cất lần Kết cuối hạt nano từ tính bao bọc hai lớp chất hoạt hóa bề mặt OA SDS ñã ñược nhồi thuốc kháng sinh Cm (NPCm) phân tán 20 ml nước ñược giữ nhiệt ñộ °C trước ñưa sử dụng Cấu trúc hạt nano từ tính phân tích máy nhiễu xạ tia X Bruker D5005, kích thước hạt ñược quan sát kính hiển vi ñiện tử truyền qua (TEM) JEOL JEM 1010 Tính chất từ đo từ kế mẫu rung (VSM) DMS 880 Phép phân tích nhiệt để xác định tỷ phần chất hoạt hóa bề mặt thuốc kháng sinh đo máy SDT 2960 TA Phổ hồng ngoại biến ñổi Fourier có từ máy đo Nicolet Impact 410 cho biết liên kết chất hoạt hóa bề mặt lên bề mặt hạt nano từ tính ðể xác định khả ức chế sinh trưởng thuốc kháng sinh lên vi khuẩn E coli (chủng DH 5α), đĩa thủy tinh có đường kính 10 cm chứa 20 ml mơi trường đặc Luria-Bertani (LB), với thành phần gồm % trypton, 0,5 % dịch chiết nấm men, % muối NaCl, 1,6 % thạch, ñược dùng ñể cấy E coli lên bề mặt Sau đó, đĩa thạch LB để khơ nhiệt ñộ 37°C ñược ñục lỗ nhỏ có đường kính khoảng 0,5 cm Hạt nano chứa thuốc NP-Cm hịa tan nước nhỏ vào lỗ ñược ñục sẵn Thuốc kháng sinh khuếch tán từ lỗ xung quanh ức chế sinh trưởng vi khuẩn E coli ðể thuốc khuếch tán xung quanh, chúng tơi giữ đĩa thạch nhiệt độ từ 4°C đến 10°C thời gian h, sau chúng tơi nâng nhiệt độ lên 37°C vài ngày ñể ủ cho vi khuẩn phát triển thành ñám khuẩn lạc Nếu thuốc có tác dụng sau thời gian, vi khuẩn không phát triển vùng xung quanh lỗ thử Ngược lại, thuốc không tác dụng vi khuẩn phát triển thường Vùng vi khuẩn phát triển vùng vi khuẩn không phát triển được nhận biết nhờ màu sắc vùng khơng giống Bằng cách đo đường kính vịng trịn ức chế sinh trưởng vi khuẩn xung quanh lỗ thử ta xác ñịnh ñược khả kháng khuẩn thuốc kháng sinh ñược mang hạt nano so sánh với thuốc kháng sinh đối chứng khơng có hạt nano Việc xác định đường kính kháng khuẩn thơng qua chụp ảnh xử lý phần mềm Image J [7] Kết thảo luận 3.1 Cấu trúc hình thái học hạt nano từ tính Fe3O4 Kết nhiễu xạ tia X hạt nano từ tính magnetite với số nồng ñộ ion Fe2+ 0,001, 0,002, 0,005, 0,01 0,2 M/l cho hình Các ñỉnh nhiễu xạ mẫu 195 440 511 422 400 0,2 M/l 222 311 220 111 N.H Hải nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên Công nghệ 24 (2008) 192-204 C−êng ®é 0,01 M/l 0,005 M/l 100 nm 0,002 M/l 0,001 M/l 20 30 40 50 2θ (®é) 60 70 Hình Kết nhiễu xạ tia X hạt nano từ tính magnetite với nồng độ ion Fe2+ 0,001, 0,002, 0,005, 0,01 0,2 M/l Các ñỉnh nhiễu xạ mẫu trùng khớp với ñỉnh nhiễu xạ mẫu chuẩn Fe3O4 (số 1-1111) ñược thể dọc mẫu với nồng ñộ khác tương tự trùng khớp với ñỉnh nhiễu xạ mẫu Fe3O4 chuẩn (số 1-1111) ðiều cho thấy mẫu thu có cấu trúc spinel đảo giống mẫu khối Ngồi đỉnh nhiễu xạ magnetite, kết khơng cho thấy có nhiễu xạ pha lạ Sự mở rộng đỉnh nhiễu xạ mẫu có nồng độ thấp kết tồn hạt có kích thước nm mẫu Khi nồng ñộ tiền chất tăng, ñỉnh trở nên sắc nét hẹp Từ ñộ rộng ñỉnh nhiễu xạ [8], kích thước hạt tính 0,5, 8,9, 9,4, 10,3, 13,8 nm tương ứng với nồng ñộ tiền chất nói Giá trị 0,5 nm mẫu có nồng độ tiền chất 0,001 M/l chưa giá trị thực hạt nano mà cho thấy mức độ tinh thể hóa hạt nano nồng độ tiền chất lỗng thấp Cơ chế hình thành hạt nano từ tính q trình đồng kết tủa hiểu sau [9]: Hình Ảnh hiển vi điện tử truyền qua hạt nano từ tính magnetite nồng độ ion Fe2+ thay đổi Hình trái nồng độ 0,05 M/l; hình phải nồng độ 0,25 M/l nồng độ ion tiền chất tham gia phản ứng ñạt ñến nồng ñộ bão hòa ñịnh xuất hình thành đột ngột mầm tinh thể Các mầm tinh thể hấp thu vật chất dung dịch liên tục ñể phát triển thành hạt nano hoặc/và kết tụ với ñể tạo hạt lớn Kích thước hạt nano phản ứng ñồng kết tủa phụ thuộc vào ñộ pH nồng ñộ ion Khi thay ñổi nồng ñộ ion cố định pH kích thước hạt thay ñổi từ nhỏ ñến lớn nồng ñộ ñi từ lỗng đến đặc [10] Các hạt nano có kích thước từ 10 nm đến 100 nm tạo thành từ phương pháp [11] Ảnh hiển vi ñiện tử truyền qua hạt nano từ tính magnetite nồng độ ion Fe2+ thay đổi cho hình Khi nồng ñộ tiền chất thấp khuếch tán vật chất lên mầm tinh thể nhỏ kết kích thước hạt nhỏ Từ hình thấy kích thước trung bình hạt nano nồng ñộ tiền chất 0,05 M/l 10,0 ± 2,8 nm cịn kích thước hạt nano nồng ñộ 0,25 M/l 28,6 ± 6,2 nm 3.2 Từ tính hạt nano Sự phụ thuộc từ độ (M) vào từ trường ngồi (H) mẫu cho thấy tính siêu thuận N.H Hải nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên Công nghệ 24 (2008) 192-204 60 70 40 60 20 M (emu/g) 80 50 60 40 40 M (emu/g) Ms (emu/g) 196 30 20 20 MF23 MF17 -20 -40 -20 -60 -40 10 Trong N2 Trong không khí -60 -10000 -5000 0 5000 -10000 -5000 10000 H (Oe) -2.5 -2.0 -1.5 -1.0 -0.5 5000 10000 H (Oe) Log(c) Hình Sự phụ thuộc từ độ bão hịa vào nồng độ tiền chất c Hình nhỏ đường cong từ hóa mẫu có nồng ñộ tiền chất c = 0,005 từ nhiệt ñộ phịng với từ độ bão hịa thay đổi từ emu/g nồng độ lỗng 74 emu/g nồng độ tiền chất đặc Từ độ bão hịa Ms ñược xác ñịnh từ việc làm khớp với ñường cong từ hóa vùng từ trường cao theo cơng thức gần bão hòa sau: M = Ms(1-b/H2 ), với H từ trường ngồi, b thơng số làm khớp [12] Siêu thuận từ tượng thú vị mà vật liệu sắt từ đạt đến kích thước nm có Ở đó, chuyển ñộng nhiệt ñủ mạnh ñể phá vỡ trật tự sắt từ Mỗi hạt nano lúc giống nguyên tử trạng thái thuận từ với mômen từ lớn nhiều mômen từ nguyên tử nên gọi siêu thuận từ Vật liệu có tính siêu thuận từ nhiệt độ có từ độ bão hịa (Ms ) tương đối cao khơng có lực kháng từ, tức là, vật liệu hồn tồn bị khử từ khơng có từ trường ngồi ðể biết vật liệu có tính siêu thuận từ hay khơng người ta phải xác định từ phụ thuộc từ độ vào từ trường ngồi nhiệt độ khác M(H) Sau so sánh ñường cong M(H/T) ñường cong ñó vùng Hình ðường cong từ hóa mẫu có nồng ñộ tiền chất 0,002 ñược chế tạo môi trường khơng khí mơi trường khí N2 nhiệt độ mà vật liệu thể tính siêu thuận từ Nếu đường cong M(H/T) trùng khơng có lực kháng từ vật liệu siêu thuận từ Một cách khác ñể biết vật liệu trạng thái siêu thuận từ ño ñường cong từ ñộ phụ thuộc vào nhiệt ñộ M(T) từ trường thấp ñược làm lạnh từ trường không (ZFC) khác khơng (FC) Ở nhiệt độ thấp, vật liệu có tính sắt từ hai đường cong FC ZFC tách rời Ở nhiệt độ cao, vật liệu có tính siêu thuận từ, hai đường cong trùng Nhiệt ñộ mà ñó hai ñường cong bắt ñầu tách nhau, thơng thường đỉnh cực đại đường cong ZFC, ñược gọi nhiệt ñộ chuyển siêu thuận từ, TB Với kích thước vài đến vài chục nm, hạt nano magnetite hạt đơn đơmen Q trình quay mơmen từ chuyển động nhiệt phải thắng hàng rào lượng dị hướng từ tinh thể KV, ñó K dị hướng từ tinh thể bậc 1, V thể tích hạt nano từ tính Nhiệt ñộ chuyển siêu thuận từ ñược xác ñịnh từ công thức Néel-Arrhenius: ln(τ/τ0)kBTB = KV [13], kB số Boltzman, T nhiệt ñộ tuyệt ñối, τ0 số có giá trị khoảng 10-9 – 10-10, τ thời gian hồi phục Giá N.H Hải nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên Công nghệ 24 (2008) 192-204 197 0.06 Tõ ®é |∆Sm|(J / kg.K) 0.05 0,020 M/l 0,010 M/l 0,005 M/l 0,002 M/l 150 200 250 0.04 0.03 0.02 0.01 0.00 150 300 350 400 200 250 300 350 400 T (K) NhiƯt ®é (K) Hình ðường cong ZFC hạt nano từ tính với nồng độ tiền chất c = 0,002, 0,005, 0,01, 0,02 trị ln(τ/τ0) dao ñộng khoảng 22 – 25 (thường ñược lấy 25) mà thời gian hồi phục τ có giá trị thời gian phép đo từ tính, thơng thường khoảng 30 s Vế phải lượng dị hướng từ tinh thể, vế trái số ñại diện cho thời gian hồi phục mômen từ nhân với lượng nhiệt Với loại vật liệu TB tỷ lệ với kích thước hạt nano, hạt lớn TB lớn Vật liệu siêu thuận từ lý tưởng cho ứng dụng y sinh, nhiên, vật liệu có tính chất giống siêu thuận từ, tức chất chất sắt từ lực kháng từ nhỏ ñược sử dụng nhiều y sinh học [14] Hình cho thấy phụ thuộc từ độ bão hịa vào nồng độ tiền chất Khi nồng độ tiền chất lỗng từ độ bão hịa thấp, đạt emu/g ñối với nồng ñộ tiền chất 0,001 M/l Khi nồng độ tiền chất cao từ độ bão hịa cao Giá trị lớn 74 emu/g ñạt ñược nồng độ tiền chất 0,01 M/l Hình nhỏ hình cho biết dáng điệu đường cong M(H) với nồng ñộ tiền chất 0,005 M/l Hình Hình Biến thiên entropy từ cực đại mẫu tạo thành từ hạt nano từ tính phân tán epoxy Từ trường ñặt vào mẫu song song với từ trường (1 T) ñặt vào epoxy bị đặc cho thấy vật liệu khơng có lực kháng từ Các giá trị từ độ bão hịa nhỏ giá trị từ ñộ khối vào khoảng 95 emu/g kích thước nhỏ nguyên tử bề mặt có từ tính yếu chiếm tỷ phần đáng kể Từ tính yếu ngun tử bề mặt ơxi hóa q trình phản ứng ðể khẳng định điều này, chúng tơi tiến hành chế tạo mẫu với nồng độ tiền chất 0,001 M/l mơi trường khí nitơ N2 Kết từ độ bão hịa tăng lên đáng kể Nếu chế tạo khơng khí, hạt nano từ có Ms emu/g chế tạo N2 Ms đạt đến 64 emu/g (hình 4) ðiều khẳng định mơi trường quan trọng từ tính hạt nano nồng ñộ tiền chất thấp Tuy nhiên, với nồng ñộ tiền chất cao, Ms khơng khác biệt nhiều chế tạo hai mơi trường khác Hình ñường cong ZFC số mẫu với nồng ñộ tiền chất thấp Nhiệt ñộ TB rút từ cực ñại ñường cong ZFC 205 K, 225 K, 245 K, 350 K với nồng ñộ tiền chất 0,002, 0,005, 0,01, 0,02 M/l Kết lần khẳng ñịnh nồng 198 N.H Hải nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên Công nghệ 24 (2008) 192-204 Oleic acid H 3C O-H O-H C=O CH2 CH2 C=O O H 3C HÊp thô OA Fe3O4-OA 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 -1 Sè sãng (cm ) Hình Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier hạt nano từ tính Fe3O4 (dưới), hạt nano từ tính bao bọc axít oleic (giữa), axít oleic tinh khiết (trên) độ tiền chất cao ảnh hưởng đến kích thước hạt làm tăng nhiệt độ chuyển siêu thuận từ ðể tính ñược biến thiên entropy từ ñoạn nhiệt mẫu bột ñịnh hướng, ño loạt ñường cong từ hóa ban đầu mẫu nhiệt độ biến thiên từ 150 K ñến 400 K sử dụng công thức [15]: H max ∆S m (T , ∆H ) = ∫ δM (T , H ) dH δT H (1) Hmax từ trường ngồi lớn ñặt vào mẫu Trong phép ño chúng tơi, từ trường đạt 13,5 kOe Thơng thường, từ trường biến đổi khơng liên tục mà theo ñại lượng rời rạc nên biến thiên entropy từ ñoạn nhiệt ñược xác ñịnh sau: ∆S m = ∑ O CH3 O CH3 Fe3O4 Hình Sơ đồ mơ tả liên kết hạt nano từ tính với axít oleic Nhóm carboxyl OA gắn kết với bề mặt hạt nano để lại phần hydrocarbon hướng ngồi Fe3O4 4000 OH M i − M i+1 ∆H Ti − Ti+1 (2) Mi Mi+1 giá trị từ ñộ nhiệt ñộ tương ứng Ti Ti+1 với biến thiên từ trường ∆H Giá trị biến thiên entropy mẫu với nồng ñộ tiền chất 0,01 M/l ñược cho hình Giá trị cực ñại 0,055 J/kg.K ñạt ñược nhiệt ñộ 280 K Giá trị thấp nhiều giá trị biến thiên entropy từ vật liệu khác vật liệu perovskite [16] băng từ nano tinh thể [17] Tuy nhiên, cần lưu ý mẫu chúng tơi mẫu bột định hướng với tỷ phần hạt nano từ tính/epoxy = 1/15 Như vậy, giá trị biến thiên entropy cực ñại hạt nano tinh thể 0,825 J/kg.K, giá trị so sánh với giá trị hệ mẫu ferrite Ni1-xZnxFe2O4 [18] Một ñặc ñiểm ñáng lưu ý giá trị biến thiên entropy từ cực ñại lớn gần nhiệt độ phịng tương đối sắc nét nên có ứng dụng tương lai 3.3 Phân tán hạt nano dung môi chế tạo phức hệ hạt nano-thuốc kháng sinh Hạt nano từ tính sau chế tạo chưa chất lỏng từ ổn ñịnh Muốn tạo ñược hệ phân tán ổn ñịnh (chất lỏng từ), bề mặt hạt nano từ tính cần bao bọc chất hoạt hóa bề mặt Axít oleic sử dụng làm chất ổn ñịnh ñể hạt nano phân tán dung mơi khơng phân cực n-hexane Hình phép ño hồng ngoại khai triển Fourier (FTIR) hạt nano từ tính bao bọc OA so sánh với phép ño tiến hành hạt nano không bao bọc OA tinh khiết Phổ hấp thụ hồng ngoại OA tinh N.H Hải nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên Công nghệ 24 (2008) 192-204 s= • ••••• •• •• •• ••• • •• • •• ••••• • ••••• •• •• •• ••• • •• • •• ••••• Hình Sơ đồ mơ tả hạt nano từ tính bao bọc lớp (hình trái) hai lớp (hình phải) chất hoạt hóa bề mặt Nếu hạt nano ñược lớp OA bao bọc, chúng có tính ưa dầu nên phân tán n-hexane Nếu hạt nano ñược hai lớp chất hoạt hóa bề mặt bao bọc, lớp OA bên lớp SDS bên ngoài, chúng có tính ưa nước nên phân tán nước Khoảng hai lớp OA SDS khoảng trống thân dầu, đó, thuốc thân dầu Chloramphenicol khu trú khiết cho thấy ñỉnh hấp thụ tương ứng với dao ñộng nhóm C=O 1707 cm-1 1280 cm-1; nhóm O-H 3000 cm-1 (đỉnh rộng), 1460 cm-1 (dao ñộng mặt phẳng) 910 cm-1 (dao ñộng mặt phẳng); nhóm CH2 2932 cm-1 2861 cm-1 Phổ hồng ngoại hạt nano có bao bọc OA ngồi đỉnh hấp thụ đặc trưng cho Fe3O4 thấy tồn hai đỉnh hấp thụ đặc trưng cho dao động nhóm CH2 Các dao động nhóm C=O O-H khơng thấy xuất ðiều cho thấy nhóm carboxyl OA biến phân tử OA tạo liên kết hóa học với bề mặt hạt nano từ tính [6] (hình 8) Như vậy, đầu phân cực OA liên kết với hạt nano khơng phân cực hướng vào dung môi n-hexane Dựa vào hàm lượng OA mẫu Fe3O4 bao phủ OA với giả thiết có lớp phân tử OA bao xung quanh hạt nano kích thước trung bình hạt nanơ Fe3O4 xác định từ phép đo ảnh hiển vi điện tử truyền qua đánh giá diện tích bề mặt hạt nanơ chiếm phân tử OA theo công thức: 6(1 − c) M 24 10 cDρN 199 (3) với s diện tích chiếm phân tử OA (nm2), c hàm lượng OA mẫu (c = % khối lượng), M khối lượng mol OA (M = 282,5 g/mol), D đường kính trung bình hạt nano Fe3O4 (20 nm), ρ khối lượng riêng Fe3O4 (ρ = 5180 kg/m3), N số Avogadro Kết tính s = 0,31 nm2 kết phù hợp với kết ñã công bố [19] s = 0,28 nm2, chứng tỏ hạt Fe3O4 ñược bao phủ lớp OA Sau bao học thêm lớp SDS, hạt nano từ tính bao phủ hai lớp phân tử gồm OA SDS hình Phép ño phân tích nhiệt vùng nhiệt ñộ từ nhiệt ñộ phòng ñến 500°C với tốc ñộ gia nhiệt 20°C/phút cho hình 10 Trong hình đó, trục tung tỷ lệ khối lượng mẫu nhiệt ñộ khác so với khối lượng mẫu nhiệt ñộ phòng Trên ñồ thị ta thấy tất mẫu dù sấy khơ có độ ẩm ñịnh thể suy giảm khoảng % khối lượng nhiệt ñộ 100°C ðối với mẫu Fe3O4 suy giảm khối lượng khơng cịn suy giảm khác tồn dải nhiệt độ khảo sát, điều dễ hiểu Fe3O4 có nhiệt độ sơi cao nhiều so với dải nhiệt ñộ khảo sát ðối với mẫu Fe3O4 bao phủ OA có suy giảm khoảng % khối lượng nhiệt ñộ khoảng 300°C vùng nhiệt ñộ từ 220°C ñến 420°C Trong theo kết cơng bố OA bay mạnh nhiệt ñộ khoảng 250°C dải nhiệt ñộ từ 150°C ñến 400°C [6] Kết khơng cho phép kết luận có mặt OA mẫu mà cho phép kết luận có liên kết OA với bề mặt hạt nanơ làm cho OA khó bay 200 N.H Hải nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên Công nghệ 24 (2008) 192-204 1.02 Khèi l−ỵng rót gän 1.00 Fe3O4 0.98 0.96 0.94 NP-OA 0.92 NP-OA-SDS 0.90 0.88 0.86 cephalosporin, Cm có tính thân dầu cao Trong q trình khuấy với hạt NP-OA-SDS, phân tử thuốc kháng sinh không ưa nước khu trú vào khoảng không gian hai lớp chất hoạt hóa bề mặt Phức hệ NP-Cm có từ tính suy giảm khoảng 10 % so với từ tính hạt nano khơng bao bọc Sự suy giảm nhỏ so với nhiều phương pháp khác, ñó từ ñộ suy giảm 50 % NP-Cm 100 200 300 400 500 NhiƯt ®é (C) Hình 10 Khối lượng hạt nano Fe3O4, NP-OA, NP-OA-SDS, NP-Cm nhiệt ñộ khác ðối với mẫu Fe3O4 bao phủ lớp chất hoạt hoá bề mặt kép NP-OA-SDS ta thấy suy giảm khối lượng độ ẩm mẫu cịn có thêm hai suy giảm khối lượng khác Thứ suy giảm khoảng % khối lượng xảy dải nhiệt ñộ từ 180°C ñến 300°C Sự suy giảm chủ yếu OA bay có phần SDS bay dải nhiệt độ Thứ hai suy giảm khoảng % khối lượng chủ yếu SDS bay xảy dải nhiệt ñộ từ 300 °C ñến 420 °C Hình 10 cho thấy mát khối lượng hạt nano bọc hai lớp chất hoạt hóa bề mặt nhồi thuốc kháng sinh Cm So sánh với suy giảm khối lượng hạt nano NP-OA-SDS không nhồi thuốc, hạt nano NPCm giảm khối lượng nhiều hơn, khác biệt hai mẫu % khối lượng có mặt thuốc kháng Cm bay nhiệt ñộ cao ðiều ñó cho thấy tỷ phần khối lượng thuốc Cm/NP-Cm % Bản chất trình nhồi thuốc kháng sinh nhờ tượng thân dầu phân tử thuốc Cm So với số loại kháng sinh khác ampicilin, 3.4 Ức chế sinh trưởng vi khuẩn E Coli phức hệ NP-Cm ðể tìm hiểu khả giải thuốc phức hệ NP-Cm, tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng thuốc kháng sinh phức hệ nói lên q trình phát triển vi khuẩn E coli cấy ñĩa thạch Hình 11 ảnh chụp đĩa thạch cấy vi khuẩn E coli sau 14 h nhỏ thuốc kháng sinh Cm phức hệ NP-Cm vào lỗ ñược ñục ñĩa thạch Các lỗ ñược ñánh số từ ñến lỗ ñược nhỏ 50 µl NPCm với nồng ñộ NP-Cm tương ứng 200, 40, 20, 10 µg/ml Các lỗ đánh số từ đến 10 lỗ nhỏ 50 µl nước có chứa thuốc kháng sinh đối chứng Cm tương ứng 200, 40, 20, 10 µg/ml Hình trịn đánh dấu cho thấy vùng kháng khuẩn thuốc kháng sinh có tác dụng Ở bên ngồi hình trịn, vùng có màu sáng đục vùng mà vi khuẩn phát triển thành ñám khuẩn lạc Ở bên trong, vùng có màu sẫm suốt vùng mà vi khuẩn khơng thể phát triển ðiều thú vị chỗ, ta so sánh cặp lỗ: 1-6, 2-7, 3-8, 4-9, 5-10 sau 14 h, đường kính hình trịn kháng khuẩn phức hệ NP-Cm ln lớn đường kính hình trịn kháng khuẩn thuốc Cm đối chứng lượng thuốc kháng sinh Cm phức hệ NP-Cm thấp nhiều so với lượng thuốc kháng sinh ñối chứng Sở dĩ N.H Hải nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên Công nghệ 24 (2008) 192-204 201 thuốc kháng sinh hai vị trí cách khoảng ∆x Hệ số khuếch tán D có liên quan đến nhiệt độ T độ nhớt mơi trường η theo công thức Stockes-Einstein: D ⋅η = k BT / 6πR Hình 11 ðường kính vịng kháng khuẩn lỗ có chứa phức hệ NP-Cm Cm đối chứng sau 14 h ủ Các lỗ ñược ñánh số từ đến lỗ chứa µm dung dịch có phức hệ NP-Cm với nồng độ tương ứng 200, 40, 20, 10, µg/ml Các lỗ ñược ñánh số từ ñến 10 lỗ chứa µm dung dịch có thuốc kháng sinh Cm với nồng ñộ tương ứng 200, 40, 20, 10, µg/ml để đối chứng Vịng kháng khuẩn đánh dấu hình trịn màu trắng phân tách vùng kháng khuẩn bên vùng vi khuẩn phát triển bên ngồi đo thời gian ngắn 14 h phải có thời gian ñủ dài ñể thuốc kháng sinh khuếch tán xung quanh Sự khuếch tán thuốc Cm ñối chứng dễ dàng hình dung khuếch tán thuốc kháng sinh Cm phức hệ NP-Cm phức tạp Tuy nhiên, khuếch tán xảy hai trường hợp ñều chênh lệch nồng ñộ Cm vùng có nồng ñộ Cm cao vùng có nồng độ Cm thấp xung quanh Sự khuếch tán phụ thuộc vào chênh lệch nồng độ, độ nhớt mơi trường, khoảng cách, thời gian nhiệt độ Mật độ dịng khuếch tán J ñược cho công thức sau: (5) với kB số Boltzman, R bán kính phân tử thuốc kháng sinh ðiều có nghĩa nhiệt độ tăng mật độ dịng khuếch tán tăng lên theo nhiệt độ thơng qua phụ thuộc tuyến tính hệ số khuếch tán vào nhiệt ñộ phụ thuộc phi tuyến độ nhớt mơi trường vào nhiệt ñộ Khi bảo quản phức hệ NPCm nhiệt độ gần nhiệt độ đóng băng nước, khuếch tán Cm từ chỗ có nồng độ cao ñến chỗ nồng ñộ thấp bị hạn chế lúc độ nhớt mơi trường lớn Khi sử dụng làm thí nghiệm 37°C q trình khuếch tán gia tăng mạnh làm cho thuốc có tác dụng xung quanh Phép kiểm tra ảnh hưởng nước đến q trình phát triển vi khuẩn cho thấy nước khơng ảnh hưởng đến q trình phát triển vi khuẩn ðiều có nghĩa thuốc kháng sinh mang phức hệ NP-Cm có tác dụng ức chế vi khuẩn mạnh thuốc kháng sinh ñối chứng sau 14 h Thuốc kháng sinh Cm tinh khiết tan nước dễ bị thuỷ phân làm hoạt tính sau thời gian dài Thuốc kháng sinh phức hệ NPCm ñược bảo vệ lớp chất hoạt hóa bề mặt nên khó bị thuỷ phân mơi trường nước (4) ðể tìm hiểu sâu trình tác dụng thuốc kháng sinh hai trường hợp tiến hành nghiên cứu trình ức chế sinh trưởng vi khuẩn theo thời gian D hệ số khuếch tán, A diện tích bề mặt tiếp xúc, ∆C chênh lệch nồng ñộ Quá trình khuếch tán thuốc phụ thuộc vào thời gian theo ñịnh luật Fick: J = D ⋅ A ⋅ ∆C / ∆x 202 N.H Hải nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên Cơng nghệ 24 (2008) 192-204 16 Cm-NP (40 µg/ml) Cm (60 µg/ml) 14 D (mm) 12 10 12 (a) 16 20 24 28 32 36 40 44 t (h) 10 Cm-NP (20 µg/ml) Cm (30 µg/ml) D (mm) 12 (b) 16 20 24 28 32 36 40 t (h) Hình 12 ðường kính vịng kháng khuẩn lỗ chứa NP-Cm Cm ñối chứng theo thời gian với nồng ñộ thuốc kháng sinh cao (trên) thấp (dưới) C ( x, t ) = C (0,0) erfc( x / Dt ) (6) với C(x,t) nồng ñộ thuốc thời ñiểm t cách nguồn khuếch tán khoảng cách x ðiều có nghĩa là, với thời gian đủ dài thuốc kháng sinh khuếch tán khắp bề mặt ñĩa thạch vi khuẩn khơng thể sinh trưởng vị trí đĩa thạch Tuy nhiên, q trình ức chế sinh trưởng vi khuẩn thuốc kháng sinh bị hạn chế hai yếu tố nồng ñộ phải ñủ cao ngưỡng ñịnh thời gian tác dụng phải đủ lâu Chúng tơi tiến hành nghiên cứu trình ức chế sinh trưởng theo thời gian với hai nồng ñộ khác nhau: cặp lỗ số 2-7 (thí nghiệm A, nồng độ cao) cặp lỗ số 38 (thí nghiệm B, nồng độ thấp) Trong thí nghiệm trước, lỗ số nhỏ 50 µl dung dịch có chứa NP-Cm với nồng độ 40 20 µg/ml Lỗ số nhỏ 50 µl dung dịch có chứa Cm với nồng độ 40 20 µg/ml Ở thí nghiệm trước (hình 11), thấy đường kính kháng khuẩn lỗ số ln lớn lỗ số đường kính lỗ số ln lớn lỗ số Chúng tơi muốn sau 14 h đường kính hai lỗ phải nên tăng nồng ñộ thuốc Cm lỗ số thí nghiệm theo thời gian tương ứng 60 30 µg/ml so sánh với lỗ với nồng ñộ NP-Cm giữ nguyên cũ Hình 12 kết phụ thuộc đường kính vịng kháng khuẩn theo thời gian Chúng ta thấy sau 14 h đường kính vịng kháng khuẩn hai lỗ chứa NP-Cm gần chúng lớn đường kính vịng kháng khuẩn lỗ có thuốc Cm đối chứng Trong hai thí nghiệm so sánh trên, đường kính vịng kháng khuẩn lỗ có Cm ñối chứng suy giảm liên tục theo thời gian đường kính vịng kháng khuẩn NP-Cm đạt cực đại sau suy giảm Về ngun tắc, theo định luật Fick đường kính vịng kháng khuẩn phải ln tăng theo thời gian nồng độ tỷ lệ với thời gian khuếch tán Tuy nhiên thấy đường kính vịng kháng khuẩn lỗ chứa NP-Cm tăng đến giá trị suy giảm ðường kính vịng kháng khuẩn lỗ chứa NP-Cm ñạt cực ñại khoảng thời gian từ 16 h ñến 18 h sau cấy Như ñã lưu ý, giá trị cực ñại cạnh tranh trình khuếch tán tăng theo thời gian trình phân huỷ thuốc kháng sinh tăng theo thời gian Chúng ta không thấy cực ñại N.H Hải nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên Cơng nghệ 24 (2008) 192-204 đường kính vịng kháng khuẩn lỗ chứa thuốc Cm đối chứng cực đại xảy thời điểm trước 14 h Ở thí nghiệm A, đường kính vịng kháng khuẩn lỗ có thuốc Cm đối chứng sau 14 h đường kính vịng kháng khuẩn lỗ có chứa NP-Cm sau 36 h Lưu ý nồng ñộ Cm lỗ có NP-Cm thấp hàng chục lần nồng độ Cm lỗ có Cm đối chứng Như ức chế sinh trưởng vi khuẩn thuốc kháng sinh mang hạt nano có tác dụng ức chế sinh trưởng thuốc kháng sinh ñối chứng lên nhiều lần ðiều giải thích nước, Cm bị thuỷ phân làm phần lớn hoạt tính nhanh Khi phức hệ NP-Cm, thuốc kháng sinh ñược bảo vệ phân tử chất hoạt hóa bề mặt nên có tác dụng kéo dài thuốc kháng sinh khơng bảo vệ Kết tương tự với nhiều kết kéo dài thời gian tác dụng thuốc phương pháp bao bọc khác [20] Kết luận Chúng tơi chế tạo hạt nano từ tính Fe3O4 với kích thước thay ñổi phân tán chúng dung môi hữu nước để tạo chất lỏng từ tính Các hạt nano từ tính có từ độ bão hịa ñạt ñến 74 emu/g biến thiên entropy từ cực đại đạt đến 0,825 J/kg.K Hạt nano từ tính cịn ñược sử dụng ñể mang thuốc kháng sinh Chloramphenicol với tỷ phần nhồi thuốc % khối lượng Nghiên cứu ức chế kháng sinh lên vi khuẩn E coli cho thấy thuốc mang hạt nano có tác dụng kéo dài nhiều lần so với thuốc ñối chứng Nghiên cứu có ưu ñiểm hệ thuốc hạt nano có từ tính cao 203 Lời cảm ơn Cơng trình giúp đỡ tài từ ðề tài QT-07-10 ðại học Quốc gia Hà Nội ðề tài 406006 Chương trình nghiên cứu cấp nhà nước Tài liệu tham khảo [1] S Yean, L Cong, C T Yavuz, J T Mayo, W W Yu, A.T Kan, V L Colvin, M B Tomson, Effect of magnetite particle size on adsorption and desorption of arsenite and arsenate, J Mater Res 20 (2005) 3255 [2] I Safarik, M Safarikova, Magnetic techniques for the isolation and purification of proteins and peptides, Biomag Res Tech (2004): www.biomagres.com/content/2/1/7 [3] D.L Leslie-Pelecky, V Labhasetwar, R.H Kraus, Jr., Nanobiomagnetics, in Advanced Magnetic Nanostructures, edited by D.J Sellmyer and R.S Skomski, Kluwer, New York, 2005 [4] Q.A Pankhurst, J Connolly, S.K Jones, and J Dobson, Applications of magnetic nanoparticles in biomedicine, J Phys D: Appl Phys 36 (2003) R167 [5] C Alexiou, W Arnold, R.J Klein, F.G Parak, P Hulin, C Bergemann, W Erhardt, S Wagenpfeil, and A.S Lubbe, Distribution of Mitoxantrone after magnetic drug targeting: fluorescence microscopic investigations on VX2 squamous cell Carcinoma cells, Cancer Res 60 (2000) 6641 [6] T.K Jain, M.A Morales, S.K Sahoo, D.L Leslie-Pelecky, V Labhasetwar, Iron-oxide nanoparticles for sustained delivery of anticancer agents, Molecular Pharmaceutics (2005) 194 [7] http://rsb.info.nih.gov/ij/ [8] B.E Warren, X-ray diffraction, AddisonWesley, Mineola NY, 1990 [9] P Tartaj, M P Morales, S VeintemillasVerdaguer, T Gonzalez-Carreno, C.J Serna, The preparation of magnetic nanoparticles for applications in biomedicine, J Phys D: Appl Phys 36 (2003) R182 204 N.H Hải nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên Công nghệ 24 (2008) 192-204 [10] J.P Jolivet, Metal Oxide Chemistry and Synthesis: From Solutions to Solid State, Willey, New York, 2000 [11] I.J Bruce, J Taylor, M Todd, M.J Davies, E Borioni, C Sangregorio, T Sen, Synthesis, characterization and application of silicamagnetic nanocomposites, J Magn Magn Mater 284 (2004) 145 [12] S Chikazumi, Physics of Ferromagnetism, Clarendon Press, Oxford, 1997 [13] Y.P He, S.Q Wang, C.R Li, Y.M Miao, Z.Y Wu, B.S Zou, Synthesis and characterization of functionalized silica-coated Fe3O4 superparamagnetic nanocrystals for biological applications, J Phys D: Appl Phys 38 (2005) 1342 [14] I.J Bruce, T Sen, Surface Modification of Magnetic Nanoparticles with Alkoxysilanes and Their Application in Magnetic Bioseparations, Langmuir 21 (2005) 7029 [15] L Neel, Propriétés magnétiques des ferrites: ferrimagnétisme et antiferrimagnétisme, Ann de Phys (1948) 137 [16] N Chau, D.T Hanh, N.D Tho, N.H Luong, Large magnetocaloric effect around room temperature in La0.7Ca0.3−xPbxMnO3 perovskites, J Magn Magn Mater 303 (2006) e335 [17] N Chau, P.Q Thanh, N.Q Hoa, N.D The existence of giant magnetocaloric effect and laminar structure in Fe73.5−xCrxSi13.5B9Nb3Cu1, J Magn Magn Mater 304 (2006) 36 [18] N Chau, N.K Thuan, N.H Luong, N.H Hai, D.L Minh, Effects of Zn Content on the Magnetic and Magnetocaloric Properties of NiZn Ferrites, to be published [19] Liliana Patricia Ramirez Rios, Superpara- and paramagnetic polymer colloids by miniemulsion processes, Luận án tiến sỹ, Viện Max-Planck, 2004 [20] K.J Whittlesey, L.D Shea, Delivery system for small drugs, proteins, and DNA: the neuroscience/biomaterials interface, Expimental Neurology 190 (2004) Inhibitory effect of Chloramphenicol on bacteria by loading it on magnetic nanoparticles Nguyen Hoang Hai1, Can Van Thach 1, Nguyen Hoang Luong1, Nguyen Chau1, Khuat Thi Thu Nga2, Nguyen Thi Van Anh2, Phan Tuan Nghia2 Center for Materials Science, Faculty of Physics, College of Science, Vietnam National University, Hanoi, 334 Nguyen Trai, Hanoi, Vietnam Center for Life Science, Faculty of Biology, College of Science, Vietnam National University, Hanoi, 334 Nguyen Trai, Hanoi, Vietnam Magnetic nanoparticles Fe3O4 prepared by coprecipitation method have particle size from 10 to 30 nm, superparamagnetic behavior with the saturation magnetization up to 74 emu/g Magnetic entropy change reached 0.825 J/kg.K at room temperature region The nanoparticles were coated by a double layer of surfactants oleic acid and natri dodecyl sulfate Antibiotics Chloramphenicol (3 wt %) was loaded to the hydrophobic space between the two layers of surfactants to create a complexe particledrug The inhibitory effect of the antibiotics on Escherichia coli showed an extension of the inhibitory effect of the drug loaded on the nanoparticles  ... J/kg.K Hạt nano từ tính cịn sử dụng ñể mang thuốc kháng sinh Chloramphenicol với tỷ phần nhồi thuốc % khối lượng Nghiên cứu ức chế kháng sinh lên vi khuẩn E coli cho thấy thuốc mang hạt nano có... vịng trịn ức chế sinh trưởng vi khuẩn xung quanh lỗ thử ta xác định ñược khả kháng khuẩn thuốc kháng sinh ñược mang hạt nano so sánh với thuốc kháng sinh đối chứng khơng có hạt nano Vi? ??c xác định... Như ức chế sinh trưởng vi khuẩn thuốc kháng sinh mang hạt nano có tác dụng ức chế sinh trưởng thuốc kháng sinh ñối chứng lên nhiều lần ðiều giải thích nước, Cm bị thuỷ phân làm phần lớn hoạt tính