Tạp chí Khoa học Đ H QG HN , Khoa học Tự nhiên Công nghệ 23 (2007) 181-187 Một số đặc trưng sinh lý hoá sinh chủng vi khuẩn Streptococcus Sobrinus ATCC 6715 Nguyễn Thị Mai Phương1’*, Phan Tuấn Nghĩa2, Marquis E Robert3 1Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt, Hả Nội,Việt Nam 2Trường Đại học Khoa học Tự n hiên, Đợi học Quốc gia Hà Nội, 334 Nguyễn Trãi,Hà Nội,Việt Nam i Trường Đại học Tổng hợp Rochester, 601 Elmwood Avenue, Rochester 14642, New York, Hoa Kỳ Nhận ngày tháng 12 năm 2005 Tóm tắt Streptococus sobrinus chủng vi khuẩn gây sâu chủ yếu Các số liệu thu cho thấy chùng vi khuẩn có khả hơ hấp, sản xuất chống chịu với H2 cao so với chủng vi khuẩn có khả chịu axit khác s sanguis NCTC10904 gordonii ATCC10588 Chùng vi khuẩn có hoạt tính enzyme NADH oxidase superoxide disniutase cao, gợi ý ertzyme tham gia vào bình bảo vệ tế bào vi khuẩn khỏi tổn thương axit H2 M đầu chế bảo vệ sữess axit oxi hoá khác vi khuẩn đường miệng [2-8], nhiều vấn đề cần làm sáng tỏ chế tượng Cơng trình nghiên cứu cùa chúng tơi tập trung vào số đặc trưng sinh lý hoá sinh chùng s sobrinus ATCC 6715 nhàm góp phần làm sáng tỏ chế chống chịu axit chống chịu oxi hố chúng Trong số lồi vi khuẩn có mặt mảng bám ràng Streptococcus sobrinus xem đối tượng gây sâu có khả sàn xuất axit mạnh đồng thời chịu axit cao Sự tạo thành axit thơng qua qúa trình đường phân làm giảm pH mảng bám xuống chí pH 4,0 dẫn đến việc làm mòn men gây sâu [1] Bên cạnh thay đổi pH, vi sinh vật mảng bám sống môi trường với stress oxi hố, phần vi sinh vật vi khu hệ đường miệng tạo ra, mặt khác việc sử dụng chất oxi hoá ừong sản phẩm bảo vệ răng, miệng Cũng có cơng trình khác nghiên cứu Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Chùng vi sinh vật s sobrinus ATCC 6715, s mutans GS-5, s mutans UA159, s sanguis NCTC 10904 chủng s gordonii ATCC 10558 lấy từ sưu tập giống cùa phịng thí nghiệm GS Robert E Marquis, Đại học Tổng hợp Rochester, New ■Tác giả liên hệ ĐT: 84-4-8360853 E-mai I: phuong_nguyen_99@ yahoo.com 181 182 N T.M Phương nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học T ự Nhiên Công nghệ 23 (2007) 181-187 York, Hoa Kỳ Các chủng vi sinh vật dùng cho nghiên cứu giữ cấy chuyển hàng tuần môi trường thạch (tryptic soy agar -TSA) hãng Difco Tế bào nuôi cấy tĩnh cấy lắc 37°c môi trường chứa 3% tryptone, 0,5% dịch chiết nấm men 1% glucose 2 Hoá chất H20 dạng dung dịch ổn định 30% (9,78M), cytochrom xanthine, xanthine oxidase mua từ hãng Sigma (Mỹ) Các hoá chất cịn lại đạt mức độ tinh phân tích c, 2.3 Hô hấp cùa tế bào Te bào thu từ pha ổn định cùa trình sinh trường Sau li tâm rửa hai lần với dung dịch muổi KC1 50 mM có chứa MgCl2 mM, tế bào hoà vào dung dịch đệm photphat 20 mM có pH khác chứa 0,5% glucose M ật độ tế bào đạt khoảng 1,5 mg trọng lượng khô/ lm l Dung dịch tế bào lẳc kỹ để đạt độ bão hồ khơng khí dùng để đo lượng tiêu thụ nhiệt độ phòng sử dụng máy đo 02,VWR Model 4000 theo phương pháp mô tả Cadwell cộng [9] 2.4 Khả sàn xuất H 20 Djch tế bào chuẩn bị cho thí nghiệm đo hô hấp Ở thời gian định (20-30 phút), ml mẫu lấy ra, li tâm tốc độ 14.000 vòng/ phút, phút để loại bò tế bào Dịch ứên tủa sử dụng để phân tích hàm lượng H 2O vi khuẩn sinh phản ứng với thuốc thử tím tinh thể leuco với có mặt peroxidse theo phương pháp Motolla cộng [10] 2.5 Tác dụng gáy chết cùa H2Oỉ Dung dịch tế bào chuẩn bị pepton 1%, pH với mật độ khoảng 109 tế bào/ml H20 thêm vào mẫu nghiên cứu để có nồng độ cuối đạt 0,1%; 0,3% 0,5% Ở thời điểm khác nhau, 100^1 dịch tế bào đựơc lấy ra, pha loãng ừong dung dich pepton 1% mật độ nhò dần 10 lần cấy trải đĩa thạch Các đĩa đặt vào tủ ấm 37°c khuẩn lạc hình thành rõ rệt đếm bàng mắt thường Tác dụng gầy chết H20 biểu thị qua giá trị D thời gian mà 90% quần thể tế bào vi khuẩn bị chết tác dụng m ột tác nhân (ví dụ H2O 0,3% nghiên cứu này) Ngồi cịn biểu thị giá trị LogN/No, N số tế bào sống sót thời điểm thu mẫu No số tế bào ban đầu Theo cách biểu D thời điểm có LogN/No = -1 2.6 Chuẩn bị tể bào thấm Te bào sau rửa hai lần với dung dịch muối KC1 50 mM có chứa MgClĩ lmM hoà vào đệm Tris-HCl 75mM (pH 7,0) có chứa M gS04 10 mM Sau thêm toluen (ti lệ 1:10), dịch tế bào trộn ủ ° c phút Te bào nhanh chóng làm đơng lạnh sau làm tan 37°c Chu kỳ lặp lại hai lần Toluen loại bỏ cách ly tâm, tế bào hoà trở lại đệm Tris-HCI cất giữ -70°c đến dùng dùng trực tiếp cho phân tích H oạt độ eniyme Chuẩn bị dịch chiết tế bào: Tế bào sau rừa với dung dịch muối hoà ừong đệm Tris-HCl 20 mM, pH 7,0 có chứa K.C1 50mM N T M P h n g v n n k / T p c h í K hoa h ọ c Đ H Q G H N , K hoa h ọ c T ự N h iê n C ô n g n g h ệ (2 0 ) - ĩ 183 MgCh lm M Một thể tích dịch tế bào trộn với thể tích cát thùy tinh (tỷ lệ 1:1) nghiền phá máy làm tế bào Sự phá vỡ hoàn toàn cùa tế bào kiểm tra kính hiển vi Dịch phá tế bào ly tâm 15 000 vòng 10 phút 4°c để thu dịch chiết dùng cho xác định hoạt độ enzyme Hoạt độ NADH oxidase xác định 25°c theo phương pháp Poole Claibome [11] sử dụng cà tế bào thấm dịch chiết tế bào Một đơn vị hoạt độ NADH oxidase lượng enzyme xúc tác để oxi hoá lmmol N \D H thời gian phút điều kiện phản ứng Hoạt độ superoxide dismutase (SOD) xác định theo phương pháp McCord Fredovich [12] thông qua ức chế ừình khử cytochrom c xanthine cỏ mặt xanthine oxidase Một đom vị hoạt độ SOD lượng SOD có khả làm giảm 50% tốc độ khử cytochrom c điều kiện phân tích Thdigkan (phút) Hlnh Khả sân xuất H2 chủng sobrinus ATCC 6715 pH khác 3.2 Khá tiêu thụ oxy Kết nghiên cứu (hình 2) cho thấy hơ hấp chùng s sobrinus pH 7,0 đạt giá trị cao (60 nmol (VphúƯmg trọng lượng khô tế bào) giảm dần pH thấp Tuy nhiên, tế bào thể hô hấp pH 4,0 chí pH 3,0 hoạt động thấp đáng kể so với pH 6,0 pH 7,0 (chỉ đạt 0,2 0,4 nmol (V phút/m g khối lượng khô) Kết nghiên cửu 3.1 Khả sản xuất H 2O Mức độ sản xuất H20 cùa s sobrinus 6715 điều kiện pH khác trình bày đồ thị Kết cho thấy sản xuất H20 của s sobrinus ATCC 6715 không khác đáng kể pH từ 5,0 đến 7,0 đạt khoảng 80 nmol H20 2/mg khối lượng khô tế bào giảm mạnh pH 4,0 Tuy vậy, pH 4,0 tế bào khả sản xuất H20 tương đối mạnh (đạt tới gần 40 nmol H20 2/mg khối lượng khơ tế bào) chí pH 3,0, 30 phút ban đầu chủng có khả sinh H2Ơ mức độ sản xuất lúc chi đạt khoảng 20 nmol HiOỉ/mg trọng lượng khơ tế bào sau bị ngừng lại Nguyên nhân ngừng lại tế bào bị chết pH thấp pH 7.0 pH 6.0 pH s o pH 4.0 pH 3.0 Hlnh Khả hô hấp s sobrinus 6715 pH khác 3.3 Tác dụng gáy chết H ị O Để tìm hiểu khả chống chịu với tổn thương oxi hoá chủng sobrinus nghiên cứu ảnh hường cùa H 2O đến khả sống sót vi khuẩn so sánh với số chủng khác Kết trình bày bảng hình cho thấy tế bào s sobrinus tỏ chống chịu cao với H 2O 184 N T M P h n g v n n k / T p c h í K h o a h ọ c Đ H Q G H N , K hoa h ọ c T ự N h iê n v C ô n g n g h ệ 23 ( 0 ) - Ĩ hoạt độ dịch chiết tế bào, pH 0.1%H202 0.3%H202 0.5%H202 Thời gian (phút) 5,0 cỏn 0,128 đơn vị/ mg protein, cao nhiều so với hoạt độ pH 7,0 cùa hai chủng s sanguis s gordonii chịu axít (bảng 2) Ngồi ra, số liệu bảng cho thấy hoạt độ NADH oxidase SOD dịch chiết loài s sobrinus s mutans GS-5 cao hẳn so với lồi cịn lại (từ 10-30 lần NADH oxidase 3-10 lần SOD) Hình Tác dụng gây chết H20 s sobrinus 6715 Bảng Tác dụng gây chểt cùa H20 0,3% vi khuẩn số chủng Streptococcus Chủng s sobrinus ATCC 6715 s mutans GS-5 s mutans ƯA 159 s sanguisNCTC 10904 s gordonii ATCC 10558 Giá trị D (phút) 46,5 15,0 41,0 15,0 16,0 Ở nồng độ H20 0,3%, sau 30 phút tới 30% tế bào sống sót giá trị D đạt tới 46,5 phút, cao hẳn loài xem chịu axít s mutans GS-5 hay UA159 cao nhiều so với lồi chịu axít s sanguis hay s gordonii 3.4 Hoạt độ NADH oxidase SOD Kết nghiên cứu (hình 4) cho thấy phụ thuộc hoạt độ vào pH môi trường cùa NADH oxidase tế bào thấm dịch chiết tế bào s sobrinus tương tự phát thấy loài Streptococcus khác [13] Tuy vậy, so với dịch chiết tế bảo, hoạt độ NADH oxidase tế bào thấm giảm chậm pH giảm xuống 5,0 Điều liên quan đến khả bảo vệ số hợp phần khác tế bào đổi với NADH oxidase Đặc biệt, Hlnh Hoạt độ NADH oxidase tế bào thấm (A) dịch chiết (B) tế bào s sobrinus Bảng Họạt độ NADH oxidse SOD dịch chiết tế bào vi khuấn gây sâu Sưcptococci Chủng Họat độ enzyme (đơn vị/mg protein) Superoxide NADH oxidase dismutase s sobrinus ATCC 6715 1,280±0,090 279,070±4,700 s mutans GS-5 1,130*0,060 152,050±3,500 S.mutans UA159 0,185±0,041 71,980± 2,370 S.sanguis NCTC 10904 0,00710,001 20,830± 6,710 s.gordonii ATCC 10558 0,01510,002 76,730± 10,520 N T M P h n g v n n k ỉ T p c h í K hoa h ọ c Đ H Q G H N , K hoa h ọ c T ự N h iê n v C ô n g n g h ệ (2 0 ) -1 Thảo ln • Các vi khuẩn thuộc giống Streptococcus khơng có khả tổng hợp nhân hem nên không cỏ hệ thống oxy hố phosphoryl hố có khả hô hấp cao [14] Ở chủng gây bệnh đường miệng s muíans GS-5 hay s sobrinus tiêu thụ oxi liên quan chủ yếu đến hai hệ thống NADH oxidase [15] thông qua phản ứng sau: NADHt-Og + H* NADHorid.-inhHrt >N A Ư , H 2 (a) 2NAJDHf + 2H* NA1 ^ xiJ‘g-mhll*0 ->2NAƯ +2H2 (b) Trong hai NADH oxidase nêu trên, enzyme xúc tác cho phản ứng (a) gọi Nox-1, xúc tác cho phản ứng chuyển điện tử từ NADH sang phân tử oxi giải phóng peroxit hydro với góp mặt proton Enzyme hợp phần cùa phức hệ alkylperoxidase với hai thành phần AhpF (Nox-1) AhpC có hoạt tính peroxidase (phân giải H2O có chất khử) Cịn enzyme cùa phản ứng (b) NADH oxidase (còn gọi Nox-2) xúc tác cho chuyển điện tử từ hai phân từ NADH sang phân tử oxi để tạo hai phân tử nước với góp mặt cùa proton Nox-1 phát có hoạt tính cao chủng vi khuẩn sản xuất H20 chủ yếu Ưong mảng bám s sobrinus, s sanguis, s gordonii, s oralis Nox-2 lại trội hom Nox-1 s mutans NADH oxidase dịch chiết thể Streptococcus tò nhạy với axit gần hồn tồn khơng thể họat tính pH 5,0 [13] Mặc dầu vậy, tiêu thụ oxi thể nguyên vẹn tỏ nhạy với axít vi tế bào có chế trì ApH bên bên ngồi màng tế bào: mơi trường bi axit hố, pH bên ừong tế bào trì cao pH bên ngồi mơi trường [16], tế bào có khà bơm proton bên ngồi thơng 185 qua hoạt động cùa hệ thống F-ATPase định vị màng Điều lý giải té bào s mutans GS-5, s sanguis NCTC [13,17] s sobrinus ATCC 6715 trì hơ hấp pH 4,0 Ngồi ra, tính nhạy cùa NADH oxidase tế bào thấm cỏ thể bảo vệ cùa hợp phần tế bào sờ cho phép tế bảo tri hô hấp môi trường bị axit hoá Bên cạnh sobrinus, s sanguis, s gordonỉi, s oralis xem chủng sản xuất H20 chủ yếu cùa mảng bám [18,19], nghiên cứu khẳng định khả sản xuất H20 cao cùa s sobrinus (hình 1) Thơng thường, chùng sản xuất H20 cao có khả kháng với H20 chùng sản xuất H20 yếu điều khẳng đjnh thêm nghiên cứu chúng tỏi (bảngl) Hoạt độ NADH oxidase cao cùa chủng s sobrinus ATCC 6715 sở giúp cho khà sản xuất H20 cao chủng Trong nghiên cứu cùa chúng tôi, tiêu thụ NADH đánh hoạt độ cùa NADH oxidase điều hiểu hoạt độ alkyperoxidase Mức độ tiêu thụ NADH cao hom cùa s sobrinus so với chủng khác lý giải chủng lại chịu H20 tốt (bảng 2) Điều phù hợp với quan sát cho thấy s mutans GS-5 với Nox-2 sinh H20 chiếm phần cùa hoạt tính NADH oxidase [13] tò nhạy nhiều với tác dụng cùa H20 Cà s mutans s sobrinus vi khuẩn mảng bám chju axit Hoạt độ SOD cao hai chủng so với số chủng chịu axit s gordonii s sanguis gợi ý khả xuất gia tăng gốc superoxide tế bào bị stress axit SOD với vai trò triệt tiêu gốc superoxide hỗ trợ cho tế bào sống tốt hom mơi trường có stress 186 N T M P h n g v n n k / T p c h í K hoa h ọ c Đ H Q G H N , K hoa h ọ c T ự N h iê n v C ô n g n g h ệ 23 (2 0 ) -1 Tài liệu tham khảo [1] R.E Marquis, Oxygen metabolism, oxidative stress and acid-base physiology of dental plaque biìlms, J Indust Microbiol 15 (1995) 198 [2] W.A Belli, R.E Marquis, Adaptation of Streptococci mutans and Enterococcus hirae to acid stress in continuous culture, Appl Environ Microbioỉ 57(1991) 1134 [3] R.M Duckworth, S.N Morgan, A.M Murray, Fluoride in saliva and plaquc following use of íluoride-containing mouthwashes, J Dent Res 59(1987) 1187 [4] I.R Hamilton, N.D Buckley, Adaptation of Streptococcus mutans to acid tolerance, Oraỉ Microbiol Immunol (1991) 65 [5] G.c Jayaraman, J.E Pender, R.A Bume, Transcriptional analysis of the Streptococcus mutans hrcA, grpE and dnaK genes and regulation of expression in responsc to hcat shock and cnvironmcntal aciđiíìcation, Mol Microbioi 25(1997) 329 [6 ] T.N Phan, K.M Kirsch, R.E Marquis, Selective scnsitization of bacteria to peroxiđe damagc associated with íluoride inhibition of catalasc and pseudocatalasc, Oraỉ Microbiol Immunol 16(2001)28 [7] T.N Phan, J.s Reidmiller, R.E Marquis, Scnsitization of Actinomyces naeslundii and Síreptococcus sanguis in biofìlms and suspensions to acid damage by fỉuoride and other weak acids, Arch Microbioỉ 174 (2000) 248 [8 ] L.B Pool, M Highuchi, M Shimada, M L Calzi, Y Kamio, Streptococcus mutans H20 2íorming NADH oxidase isozyme an alkyl hydropcroxidc reductase protein, Free Radical Biol Med 28 (2000) 108 [9] C.E Cadwell, R.E Marquis, Oxygen metabolism by Treponema deníicola O ral Microbiol Immunol 14 (1999) 6 [10] H.A Motolla, B.E Simpson, G Gorin, Absoptiometric detcrmination of hydrogen peroxide in submicrogram amounts with leuco crystal violet and peroxidase as catalyst, Anaỉ Chem 42(1970)410 [11] L.B Pool, A.Claibomc, Intcractions of pyridine nucleotidc with rcdox forms of the flavincontaining NADH pcroxiđase íorm from Streptococus faecali, J Biol.Chem 261(1986) 14525 [12] J.M McCord, I Fredovich, Superoxide dismutasc, An cnzymc íunction of erythrocuprein (hemocuprein), J Bioỉ Chem 244(1969) 6049 [13] T.N Phan, P.T.M Nguyen, J Abranches, R.E Marquis, Inhibition by Auoride and organic weak acids of rcspiration and hydrogen peroxide production of oral strcptococci in acidiíìed environmcnts, Oraỉ Microbiol Immunol 17 (2002) 119 [14] M Highuchi, Y Yamamoto, L.B Poole, M Shimada, Y Sato, N Takahashi, Y Kamio, Functions of two typcs of NADH oxidases in energy metabolism and oxidative stress of Streptococcus mutans , J Bacteriol 18 (1999) 5940 [15] C.M Gibson, T.c Mallctt, A.Calibome, M.G Caparon, Contribution of NADH oxidase to acrobic metabolism of Streptococcus pyogenes , J Bacterioỉ 182 (2000)448 [16] W.À Bclli, D.H Buckley, R.E Marquis, Weak acid effects and íluoride inhibition of glycolysis by Streptococcus mutans GS-5, Can J Microbiol 41 (1995) 785 [17] P.T.M Nguyen, J Abranches, T.N Phan, R.E Marquis, Rcprcsscd rcspiration of oral streptococci grovvn in biìlms, Curr Microbioỉ 44 (2002) 262 [18] c.s Ryan, I Kleinberg, Bacteria in human mouths involvcd in the production and utilization of hydrogcn peroxide, Arch Oraỉ Biot, 40(1995) 753 [19] E L Thomas, K.A Pera, Oxygen metabolism of Streptococcus mutans: Uptake of oxygen and releasc of supcroxidc and hydrogen peroxide, J Bacíerioỉ 154(1983) 1236 N T M P h n g v n n k / T p c h í K h o a h ọ c Đ H Q G H N , K hoa học T ự N h iê n v C ô n g n g h ệ (2 0 ) -1 187 Some physiological and biochemical characteristics of Streptococcus Sobrinus ATCC 6715 Nguyen Thi Mai Phuong1, Phan Tuan Nghia2, Robert E Marquis3 1Institute o f Biotechnology, Vietnamese Academy o f Science and Technology, 18 Hoang Quoc Viet, Hanoi, Vietnam 2College o f Science, VNU, 334 Nguyen Trai, Hanoi, Vietnam 3University o f Rochester, 601 ElmwoodRoad, Rochesíer 14642, N.Y., USA Streptococus sobrinus is one o f the major pathogens in dental carries The obtained đata show that the organism has a higher level o f H20 production and oxygen uptake and hydrogen peroxide resistance compared to some other less aciđ tolerant oral strains including s sanguis N CTC10904 and s gordonii ATCC10588 The organism also exhibits a higher level o f NADH oxidase and superoxide dismutase activities, suggesting the involvement o f enzymes in protection o f the organism from acid and H20 damage ... chết H20 s sobrinus 6715 Bảng Tác dụng gây chểt cùa H20 0,3% vi khuẩn số chủng Streptococcus Chủng s sobrinus ATCC 6715 s mutans GS-5 s mutans ƯA 159 s sanguisNCTC 10904 s gordonii ATCC 10558... hô hấp s sobrinus 6715 pH khác 3.3 Tác dụng gáy chết H ị O Để tìm hiểu khả chống chịu với tổn thương oxi hố chủng sobrinus chúng tơi nghiên cứu ảnh hường cùa H 2O đến khả sống sót vi khuẩn so... 3.1 Khả sản xuất H 2O Mức độ sản xuất H20 cùa s sobrinus 6715 điều kiện pH khác trình bày đồ thị Kết cho thấy sản xuất H20 của s sobrinus ATCC 6715 không khác đáng kể pH từ 5,0 đến 7,0 đạt khoảng