Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 30, Số (2014) 43-50 Khả tích lũy photpho tạo biofilm chủng Bacillus licheniformis A4.2 phân lập Việt Nam Nguyễn Quang Huy*, Ngô Thị Kim Toán Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, 334 Nguyễn Trãi, Thanh Xuân, Hà Nội, Việt Nam Nhận ngày 05 tháng 11 năm 2013 Chỉnh sửa ngày 19 tháng 11 năm 2013; chấp nhận đăng ngày 11 tháng năm 2014 Tóm tắt: Màng sinh học (Biofilm) cấu trúc tập hợp vi sinh vật có vai trị quan trọng chu trình dinh dưỡng cạn nước Nghiên cứu màng sinh học ứng dụng xử lý nước thải nghiên cứu giúp giảm ô nhiễm đặc biệt ô nhiễm nước thải có chứa hợp chất photpho Từ mẫu nước thải thu thập từ số địa điểm Thanh Hóa, Hà Nội chúng tơi phân lập 21 chủng vi sinh vật có khả hình thành màng sinh học Trong số chủng phân lập, chủng A4.2 ngồi khả hình thành màng sinh học cịn có hoạt tính phân giải photpho mơi trường ni cấy Kết phân tích hình thái, đặc điểm sinh lý hóa sinh so sánh trình tự đoạn gen 16S rRNA cho thấy chủng A4.2 tương đồng 99,9% (1411/1413bp) với Bacillus licheniformis_X68416 Chủng A4.2 sau ngày nuôi cấy chuyển hóa hồn tồn lượng photpho mơi trường tương đương mg/l Khi tăng hàm lượng photpho lên 18 mg/l chủng A4.2 chuyển hóa 39,32% lượng photpho bổ sung sau ngày ni cấy Từ khóa: Màng sinh học, tích lũy photpho, Bacillus licheniformis Mở đầu∗ biofilm [1-3] Theo nghiên cứu Kokare cộng tự nhiên tồn nhiều chủng vi khuẩn có hoạt tính tạo biofilm bao gồm vi khuẩn Gram dương (Streptococcus sp., Bacillus subtilis…) vi khuẩn Gram âm (Escheriachia coli, Pseudomonas aeruginosa, Vibrio cholera…) Vi sinh vật tạo biofilm nghiên cứu, ứng dụng lĩnh vực y học, công nghiệp đặc biệt xử lý nước thải Tại Việt Nam, kết nghiên cứu Nguyễn Quang Huy cộng Trần Thúy Hằng phân lập số nhóm vi Màng sinh học (biofilm) dạng sống tồn phổ biến tự nhiên vi sinh vật Việc hình thành biofilm đem lại nhiều lợi ích cho thân vi sinh vật giúp tế bào tồn chống chịu điều kiện bất lợi, tận dụng nguồn dinh dưỡng môi trường thơng qua mối quan hệ hợp tác lồi _ ∗ Tác giả liên hệ ĐT: 84-4-38582178 E-mail: huynq17@gmail.com 43 44 N.Q Huy, N.T.K Toán /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Cơng nghệ, Tập 30, Số (2014) 43-50 sinh vật có hoạt tính tạo biofilm từ nguồn nước, đất thải ô nhiễm [4,5] Lê Thị Nhi Công cộng phân lập nhóm vi khuẩn tạo biofilm từ nước biển đồng thời có hoạt tính chuyển hóa chất độc hại hydrocarbon thơm đa vòng naphthalene, anthracene, pyrene [6] Các hợp chất chứa photpho tự nhiên thường khó phân giải [7] Các nguồn nước thải chăn ni, biogas thường có hàm lượng photpho cao Theo tiêu chuẩn Việt Nam nước thải, hàm lượng photpho nước thải vượt mg/l dẫn đến tượng phú dưỡng (dư thừa chất dinh dưỡng), gây tác động trực tiếp đến động vật, thực vật gây ảnh hưởng đến môi trường sinh thái Việc xử lý nước thải giàu photpho thường khó thực đường sinh học tự nhiên số lượng lồi vi sinh vật phân giải chuyển hóa photpho không nhiều Một số chủng vi sinh vật phân lập tự nhiên có khả tích lũy phosphate cao thuộc chi: Acinetobacter, Aeromonas, Pseudomonas, Alcaligenes, Bacillus,…[8,9] Kết nghiên cứu Bao cộng khả thu nhận tích lũy photpho chi vi khuẩn cho thấy sau 20 vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas có khả thu nhận 14,34 mg/l tiến hành điều kiện yếm khí, chi Enterobacteriaceae có khả thu nhận 8,91 mg/l, chi Alcaligenes 6,43 mg/l, Staphylococcus 6,23 mg/l, Bacillus 4,41 mg/l điều kiện hiếu khí [8] Sự tích lũy phosphate cung cấp nguồn lượng cho vi sinh vật phát triển Trong thể vi sinh vật, photpho tích lũy dạng chủ yếu phosphate Phosphate chiếm đến 12% trọng lượng tế bào vi khuẩn có hoạt tính tích lũyphotphate, vi khuẩn khơng tích lũy photphate có khoảng 1-3% Việc nghiên cứu chủng vi sinh vật có hoạt tính tạo biofilm đồng thời có hoạt tính phân giải chuyển hóa hợp chất chứa photpho có ý nghĩ việc nâng cao việc xử lý nước thải áp dụng phương pháp sinh học Hiện Việt Nam chưa có cơng trình đề cập đến việc vi sinh vật có hoạt tính tạo biofilm đồng thời có khả tích lũy photpho Trong báo chúng tơi trình bày kết nghiên cứu bước đầu phân lập chủng vi sinh vật có khả tích lũy photpho để làm sở ứng dụng việc tạo sản phẩm giúp làm giảm nhiễm nước có hàm lượng hợp chất photpho cao Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu Các mẫu nước thải thu thập số địa điểm có chứa hàm lượng photpho cao nước thải bế biogas từ Vĩnh Lộc - Thanh Hóa, khu tập trung nước thải làng Vạn Phúc - Hà Đông - Hà Nội Các mẫu sau thu thập bảo quản lạnh sau vận chuyển phịng thí nghiệm để phân tích ngày Môi trường nuôi cấy Môi trường nghiên cứu sử dụng mơi trường khống acetae (AMM) với thành phần: CH3COONa: 3,68 g; Na2HPO4: 28,73 mg; NH4Cl: 57,27 mg; MgSO4: 131,82 mg; K2SO4: 26,74 mg; CaCl2 2H2O: 17,2 mg; HEPES: 12 g; dung dịch khoáng vi lượng: ml; thạch: 15 g; nước cất: lít Thành phần dung dịch khoáng vi lượng sử dụng bao gồm: EDTA: 50 g; FeSO4 7H2O: g; CuSO4 5H2O: 1,6 g; MnCl2 4H2O: g; (NH4)6Mo7O24 4H2O: 1,1 g; H3BO3: 50 mg; KI: 10 mg; CoCl2 6H2O: 50 mg; nước cất: lít [9] Đánh giá khả tạo màng sinh học Đánh giá hình thành màng sinh học theo phương pháp nhuộm với tím kết tinh Mật độ tế N.Q Huy, N.T.K Tốn /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 30, Số (2014) 43-50 bào biofilm xác định cách đo độ hấp thụ bước sóng 570 nm [10] Mật độ tế bào môi trường đánh giá cách đo độ hấp thụ bước sóng 620nm Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố môi trường đến phát triển tạo biofilm: Các chủng vi sinh vật có hoạt tính tạo màng biofilm sau phân lập nuôi cấy nhiệt độ, pH khác 24 giờ, sau quan sát, đánh giá khả hình thành màng biofilm cách đo độ hấp thụ ánh sáng bước sóng 570 nm Phân loại chủng vi sinh vật nghiên cứu dựa kit thử API trình tự gen 16 S rARN Phương pháp phân loại vi sinh vật tiến hành quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào qua kính hiển vi điện tử kính hiển vi quang học, kết hợp với phân tích đặc điểm sinh lý sinh hóa (kit API, BioMérieus, Pháp) Giải trình tự gen 16S rARN thực máy giải trình tự gen tự động ABI PRISM 3100 Avant (Hoa Kỳ) Viện Vi sinh vật Công nghệ sinh học, ĐHQG HN Kết giải trình tự so sánh với trình tự 16S rARN lồi có ngân hàng gen quốc tế Ảnh kính hiển vi điện tử chụp Trung tâm Khoa học Vật liệu, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên Đánh giá khả tích lũy photpho mơi trường Hàm lượng phosphate đánh giá dựa nguyên tắc tạo phức gốc phosphate, amonium molypdat kali antimon tatrat thành phức chất màu xanh đậm đo bước sóng 710 nm [11] Kết thảo luận 3.1 Phân lập chủng có khả tạo màng sinh học Từ mẫu nước thải từ bể xử lý biogas nước thải khu vực nuôi tôm môi trường AMM phân lập 21 chủng vi sinh vật (bảng 1) Các chủng vi sinh vật phân lập có đặc điểm chung có màu trắng đục, vàng, hay hồng, hình thái khuẩn lạc trịn, số khuẩn lạc có viền xung quanh Bằng phương pháp nhuộm với tím kết tinh bước đầu chúng tơi đánh giá khả hình thành biofilm 21 chủng vi khuẩn phân lập Kết cho thấy số chủng vi khuẩn phân lập có khả hình thành biofilm, chủng A4.2, A5.1, A5.2 A5.3 có khả hình thành màng sinh học tốt so với chủng lại Giá trị OD bước sóng 570 nm chủng A4.2, A5.1, A5.2 A5.3 tương ứng 2,42; 5,13; 2,01 2,14 chủng phân lập khác cịn lại thấp 2,0 (Hình 1) Đánh giá khả tích lũy photpho vi sinh vật thơng qua hàm lượng phosphate cịn lại Bảng Đặc điểm số lượng chủng vi sinh vật phân lập Địa điểm thu mẫu Nước thải từ bể biogas Vĩnh Lộc – Thanh Hóa Nước thải khu tập trung rác thải Vạn Phúc – Hà Đông – Hà Nội Số lượng chủng phân lập 13 chủng chủng 45 Ký hiệu Các chủng từ A1.1 đến A1.8; Các chủng A2.1 A2.2 chủng từ A3.1 đến A3.3 Các chủng từ A4.1 đến A4.3; Các chủng từ A5.1 đến A5.5 46 N.Q Huy, N.T.K Tốn /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 30, Số (2014) 43-50 Hình Khả tạo biofilm số chủng vi sinh vật phân lập 3.2 Khả tích lũy phân giải phosphat chủng tạo biofilm Khả sử dụng photpho chủng có hoạt tính tạo biofilm phân lập đánh giá thơng qua hàm lượng phosphate tích lũy vi sinh vật dẫn đến việc giảm hàm lượng hợp chất môi trường nuôi cấy Kết nghiên cứu cho thấy, chủng vi sinh vật có hoạt tính tạo biofilm tuyển chọn có khả tích lũy photpho nhanh mạnh Với hàm lượng photpho mg/l môi trường nuôi cấy, chủng A5.1, A5.2, A5.3 4.2 sau ngày ni cấy khơng cịn phát phosphate cịn mơi trường (hình 2A) Chúng tơi tiếp tục bổ sung tăng hàm lượng photpho môi trường nuôi cấy lên gấp lần mức 18 mg/l Tại nồng độ kết nghiên cứu cho thấy chủng A4.2 có khả sử dụng phosphate tốt so với chủng lại Lượng phosphate dịch nuôi chủng A4.2 giảm 39,32% sau ngày với chủng A5.1, A5.2, A5.3 lượng giảm tương ứng 29,88%, 20,77% 17,94% (hình 2B) Đây kết trình bày khả tích lũy phosphate từ chủng vi sinh vật tạo biofilm phân lập Việt Nam N.Q Huy, N.T.K Tốn /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 30, Số (2014) 43-50 (A) 47 (B) Hình Khả tích lũy phosphate chủng vi sinh vật môi trường AMM A: với hàm lượng phosphate mg/l; B: với hàm lượng phosphate 18mg/l 3.3 Đặc điểm sinh học, phân loại ảnh hưởng số yếu tố môi trường đến sinh trưởng tạo màng biofilm chủng A4.2 Hình thái khuẩn lạc chủng A4.2 phân lập mơi trường AMM có hình trịn, nhăn, màu trắng đục, có viền tia xung quanh lan tồn mặt thạch (hình 3A) Kết nhuộm Gram quan sát kính hiển vi quang học cho thấy tế bào chủng A4.2 Gram (+) có hình que, dạng chuỗi (Hình 3B) Khi quan sát kính hiển vi điện tử quét tế bào hình que A4.2 liên kết chặt chẽ với qua mạng lưới ngoại bào, cấu trúc điển hình biofilm (Hình 3C) Trên kết phân tích hình thái tế bào nhuộm Gram kết luận bước đầu chủng A4.2 thuộc chi Bacillus Hình Hình thái chủng tế bào chủng A4.2 mơi trường AMM (A), qua kính hiển vi quang học ×1000 lần (B) qua kính hiển vi điện tử quét ×10.000 lần (C) Nhiệt độ pH yếu tố có ảnh hưởng đến khả hình thành màng sinh học hoạt tính tích luỹ photpho chủng vi sinh vật đặc điểm sinh lý hóa sinh phân loại Kết thí nghiệm đánh giá khả hình thành màng sinh học chủng A4.2 điều kiện pH nhiệt độ khác trình bày bảng Bảng Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến phát triển tạo biofilm chủng A4.2 Nhiệt độ (oC) 25 30 37 45 50 55 Yếu tố môi trường Nhiệt độ Khả hình thành biofilm (OD 570 nm) pH 0,932 ± 0,0145 1,245 ± 0,0464 1,290 ± 0,0054 1,511 ± 0,0302 2,370 ± 0,0145 0,458 ± 0,0042 Độ pH Khả hình thành biofilm (OD 570 nm) 0,037 ± 0,0068 0,020 ± 0,0004 1,006 ± 0,1448 1,795 ± 0,0335 1,065 ± 0,1374 0,170 ± 0,0034 48 N.Q Huy, N.T.K Tốn /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 30, Số (2014) 43-50 Chủng A4.2 có khả hình thành màng sinh học nhiệt độ từ 30-50oC có khả hình thành màng biofilm tốt 50oC Đây đặc điểm ý chủng tạo biofilm thường có khả chống chịu với điều kiện bất lợi có yếu tố nhiệt độ từ mơi trường Chủng A4.2 hình thành màng biofilm tốt dải pH rộng từ 6-8 tối ưu pH môi trường nuôi cấy 7,0 (Bảng 2) Kết phù hợp với điều kiện mẫu thu thập môi trường phân lập kết nghiên cứu trước Nguyễn Quang Huy [4] Trần Thuý Hằng [5] chủng tạo biofilm phân lập vùng bị ô nhiễm Việt Nam Bảng Một số đặc điểm sinh hoá chủng A4.2 theo kit API (BioMérieus) Khả sử dụng chất Chủng A4.2 KNO3 L- tryptophan L- arginine Urea Esculin ferric citrate Gelatine 4-nitrophenyl β D-galactopyranoside D- glucose L- arabinose D- mannose D- mannitol N- acetyl- glucosamine D- mantose Potassium gluconate Capric acid Adipic acid Malic acid Trisodium Citrate Phenyl Acetic acid + + + + + + + + + + + + + - Đối chứng Bacillus subtilis + + + + + + + + + + - Ghi chú: -: Khơng sử dụng; +: Có sử dụng Kết bảng cho thấy chủng A4.2 sử dụng hầu hết loại chất cacbon khác (bảng 3) Chủng A4.2 sử dụng nitrat, điều phù hợp với chủng có khả tích lũy phosphate chuyển hóa hợp chất chứa nitơ nghiên cứu Jorgensen Pauli [9] So sánh kết phân tích theo kit API so sánh với chủng chuẩn B subtilis tương ứng chủng A4.2 có khả thuộc chi Bacillus Kết phân tích trình tự gen 16S rARN chủng A4.2 cho thấy đoạn gen tương đồng 99,9 % (1411/1413 bp) với đoạn gen 16S rARN Bacillus licheniformis_X68416 ngân hàng gen (Hình 4) Kết hợp với đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa, chủng A4.2 Bacillus licheniformis Kết nghiên cứu Jorgensen Pauli [9] kết Bao cộng [8] cho thấy nhiều lồi chi Bacillus có khả tích lũy photpho phổ biến tự nhiên Bacillus cereus chủng vi sinh vật nghiên cứu khả thu nhận photpho, điều kiện yếm khí sau B cereus thu nhận 13,7 mg/l photpho môi trường so với mẫu đối chứng [12] N.Q Huy, N.T.K Tốn /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 30, Số (2014) 43-50 0.01 89 68 49 66 Bacillus methylotrophicus_EU194897 68 Bacillus amyloliquefaciens_NR041455 Bacillus siamensis_GQ281299 62 Bacillus velezensis_AY603658 59 Bacillus nematotocita_AY820954 71 Bacillus vallismortis_AB021198 Bacillus subtilis_AB042061 100 81 Bacillus mojavensis_AB021191 Bacillus axarquiensis_AY603657 77 99 59 Bacillus malacitensis_AY603656 Bacillus atrophaeus_AB021181 Bacillus sonorensis_AF302118 100 Bacillus aerius_AJ831843 100 Bacillus licheniformis_X68416 100 A4.2 97 Bacillus pumilus_AY876289 Bacillus safensis_AF234854 100 Bacillus stratosphericus_AJ831841 99 Bacillus altitudinis_AJ831842 99 Bacillus aerophilus_AJ831844 Bacillus isabeliae_AM503357 100 Bacillus idriensis_AY904033 Bacillus indicus_AJ583158 100 Bacillus cibi_AY550276 Staphylococcus aureus_X68417 Hình Cây phát sinh chủng loại dựa vào trình tự 16S rARN chủng vi khuẩn A4.2 Kết luận Đã phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn A4.2 có khả sử dụng photpho tạo màng sinh học từ mẫu nước thải ô nhiễm Việt Nam Dựa đặc điểm hình thái tế bào, đặc điểm sinh lý sinh hóa kết phân tích trình tự gen 16S rARN cho thấy chủng A4.2 thuộc loài Bacillus licheniformis Chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis A4.2 sau ngày ni cấy chuyển hóa hồn tồn mg/l photpho mơi trường ni cấy Lời cảm ơn Cơng trình hồn thành với kinh phí từ đề tài:“Nghiên cứu phát triển công nghệ màng sinh học xử lý nước thải giàu N, P” Bộ Công thương tài trợ Cơng trình có sử dụng trang thiết bị Phịng thí nghiệm Trọng điểm cơng nghệ Enzym Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tài liệu tham khảo [1] [2] [3] CR Kokare, S Chakraborty, AN Khopade, KR Mahadik, Biofilm: Importance and applications, Ind J Biotechnol (2009) 159 HC Flemming, 1993, Biofilm and environmental protection, Wat Scien Technol, 27(1993) V Lazarova, J Manem, Innovative biofilm treatment technologies for water and wastewater treatment, Biofilms II: process analysis and applications, Wiley-Liss, New York, United States (2000) 159 50 [4] [5] [6] [7] [8] N.Q Huy, N.T.K Tốn /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 30, Số (2014) 43-50 NQ Huy, NTP Lien, TT Hang, Characterization of biofilm-forming bacteria isolated from soil in Vietnam, J Science VNU 27(2S) (2011) 187 TT Hang, NQ Huy, Isolate biofilm forming Bacillus strains from contamination site in trade villages in Vietnam, J Science VNU 27(2S) (2011) 157 LT N Cong, HT Huyen, NN Minh, Phenol degradation of biofilm formed by mixingmarine bacteria, J Science VNU 28 (2S) (2012) 75 WAJ Benthum, MDM Loosdrecht, JJ Heijnen, Control of heterotrophic layer formation on nitrifying biofilms in a biofilm airlift suspension reactor Biotechnol Bioeng 53(4) (1997) 397 LL Bao, L Dong, H Xiang-kun, Z Rong-xin, L Jie, X Yang, Guang-qing, Photphorus accumulation by bacteria isolated from a continuous-flow two-sludge system, J Environ Sci 19 (4) (2007) 391 [9] K JØrgensen, A Paulii, Polyphosphate accumulation among denitrifying bacteria in activated sludge, Anaerobe (1995) 161 [10] GA O’Toole, R Kolter, The initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signaling pathways: a genetic analysis, Mol Microbiol 28 (1998) 449 [11] APHA/AWWA/WEF, Standard methods for the examination of water and wastewater, 19th ed (1995), Washington, DC [12] M Sidat, F Bux, H Kasan, Polyphosphate accumulation by bacteria isolated from activated sludge, Water SA 25 (2) (1999) 175 Phosphorus Accumulation by Bacillus licheniformis A4.2 Isolated from Vietnam Nguyễn Quang Huy*, Ngơ Thị Kim Tốn Faculty of Biology, VNU University of Science, 334 Nguyễn Trãi, Hanoi, Vietnam Abstract: Biofilms can be defined as communities of microorganisms Biofilms are applied in medicine, industry and wastewater treatment In this study, we have isolated 21 bacteria strains on acetate mineral medium (AMM) Among these isolate, four strains A4.2, A5.1, A5.2, and A5.3 showed strong biofilm forming ability Strain A4.2 was highest phosphorus accumulation among four strains This bacterium was formed biofilm optimal temperature at 50oC and optimal pH at This strain use to much substance such as D- glucose, L- arabinose, D- mannose, D- maltose for growth 16S rRNA sequence analysis of strain A4.2 indicated that strain was related phylogenetically to Bacillus genus Strain A4.2 was 99.9% similarity in 16S rRNA sequence with Bacillus licheniformis_X68416 in Gene bank Strain Bacillus licheniformis A4.2 has completely degraded mg per liter of photphorus in the culture media and accumulated 39.32% (18 mg per liter) photphorus supplemented in the medium after days Keywords: Bacillus licheniformi, biofilms, photphorus accumulation ... Tập 30, Số (20 14) 43-50 Hình Khả tạo biofilm số chủng vi sinh vật phân lập 3 .2 Khả tích lũy phân giải phosphat chủng tạo biofilm Khả sử dụng photpho chủng có hoạt tính tạo biofilm phân lập đánh... giá khả hình thành biofilm 21 chủng vi khuẩn phân lập Kết cho thấy số chủng vi khuẩn phân lập có khả hình thành biofilm, chủng A4 .2, A5.1, A5 .2 A5.3 có khả hình thành màng sinh học tốt so với chủng. .. chủng lại Giá trị OD bước sóng 570 nm chủng A4 .2, A5.1, A5 .2 A5.3 tương ứng 2, 42; 5,13; 2, 01 2, 14 chủng phân lập khác lại thấp 2, 0 (Hình 1) Đánh giá khả tích lũy photpho vi sinh vật thơng qua hàm