Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Cơng nghệ 24 (2008) 261-270 Nghiên cứu điều tra chất ức chế proteinase phần khác thân hạt tơ mộc (Caesalpinia sappan L.) Hồng Thu Hà, Phạm Thị Trân Châu* Viện Vi sinh vật Công nghệ Sinh học, ðHQGHN, 144 Xuân Thủy, Hà Nội, Việt Nam Nhận ngày 29 tháng 10 năm 2008 Tóm tắt Cơng trình nghiên cứu tác dụng dịch chiết từ phần khác thân, hạt tơ mộc (C.sappan) đến hoạt độ số proteinase Các kết nghiên cứu cho thấy: Dịch chiết từ phần vỏ phần gỗ thân C sappan có hoạt tính ức chế trypsin (TIA) hoạt tính ức chế chymotrypsin (ChIA) TIA , ChIA phần gỗ lõi gỗ theo thứ tự vào khoảng 6,11 IU 22,44 IU/100 gam nguyên liệu ; TIA , ChIA phần vỏ thân theo thứ tự vào khoảng 52,45 IU 74,94 IU/100 gam nguyên liệu Dịch chiết từ hạt C sappan có TIA, ChIA chất ức chế poteinase P.aeruginosa (PPsIA): TIA, ChIA vỏ nhân hạt không khác nhiều, theo thứ tự, vào khoảng 3000 10000 mIU/g Tuy nhiên, PPsIA vỏ hạt cao nhân hạt khoảng lần, ñạt khoảng 1700mIU/g Phổ ñiện di TI, ChI dịch chiết nhân hạt C sappan tương tự nhau: có băng, tập trung vùng, vùng thứ có độ di động điện di (Rm) tương đương với protein có Mr lớn 43kD, vùng thứ (có băng) tương đương với protein có Mr từ 20-30 kD băng vào khoảng 14 kD Các băng PPsI có Rm tương ứng với protein có Mr lớn 67 kD Sắc ký qua cột Sephadex G-75 G-100 nhận ñược ñỉnh hoạt ñộng (ð2), ñạt hiệu suất 90%, hoạt ñộ riêng tăng từ – lần Mở ñầu∗ nhập vi khuẩn, virus, ký sinh trùng vào thể chủ, có tác dụng kháng viêm v.v… Vì vậy, PI ñối tượng ñã ñang ñược nghiên cứu ñể phát triển thuốc [4], số ñã ñược thương mại hóa [5] Nghiên cứu chúng tơi PI 20 năm [6,7], ñã phát ứng dụng ñược số PI quí PI hạt gấc C.sappan thuộc họ Caesalpiniaceae, hạt họ thường giàu PI chưa tìm thấy cơng bố PI C.sappan Cơng trình nghiên cứu tác dụng dịch chiết từ phần khác thân, hạt C.sappan ñến hoạt ñộ trypsin, chymotrypsin, proteinase tách từ Pseudomonas aeruginosa; Cây Caesalpinia sappan (Cs) có nhiều số tỉnh miền núi nước ta, gỗ thân có tác dụng kháng khuẩn, kháng viêm, tiêu viêm, sử dụng ñể ñiều trị số bệnh bệnh thấp khớp, viêm v.v… ñược dùng làm chất mầu [1-3] Cho đến có nhiều cơng trình nghiên cứu thành phần hóa học gỗ C sappan, chưa có cơng trình nghiên cứu chất ức chế proteinase Một số chất ức chế proteinase (PI) có tác dụng kháng khuẩn, ngăn cản trình xâm _ ∗ Tác giả liên hệ ðT: 84-4-37547638 E-mail: chauptt@vnu.edu.vn 261 262 H.T Hà, P.T.T Châu / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên Công nghệ 24 (2008) 261-270 nghiên cứu phân bố, ñiều kiện tách tinh sơ chất ức chế proteinase từ hạt chúng Nguyên liệu phương pháp Nguyên liệu: - Qủa hạt C sappan Thạc sĩ Nguyễn thị Hòa, Trung tâm Trồng chế biến thuốc, Viện Dược liệu Trung ương cung cấp Hoá chất: Trypsin, Chymotrypsin, Albumin tinh khiết hãng Sigma Casein hãng Kanto chemicals co., INC, Coomasie brilliant blue G-250 hãng ICN Biomedicals, Inc (ðức) Cao thịt hóng Merck (c), Peptone (Trung Quc) vỏ mềm gỗ lõi - Phương pháp + Xác ñịnh protein theo phương pháp Bradford [8], dùng albumin huyết bị làm chuẩn, đo ñộ hấp thụ bước sóng 595nm + Xác ñịnh hoạt ñộ ức chế trypsin (TIA), chymotrypsin (ChIA) theo phương pháp Anson cải tiến [9] Mỗi ñơn vị ức chế (IU) lượng chất ức chế làm giảm 50% hoạt ñộ 2mg enzyme + ðiện di protein gel polyacrylamide (PAGE) theo phương pháp Laemmeli [10] + ðiện di phát băng chất ức chế: gel có chất casein, sau ñiện di kết thúc, xử lý với enzyme tương ứng, vị trí có chất ức chế proteinase tạo thành băng có mầu đậm gel sáng + Sắc ký qua cột Sephadex G-25 (cột có kích thước 1,1 x 55cm, cân với dung dịch acetic acid 0,005M); Sẹơadex G-75 (cột có kích thước 1,3 x 79 cm, cân với dung dịch ñệm Sorensen 1/15M, pH 6,5) ; Sephadex G100 (cột có kích thước 1,8 x 89cm, cân với dung dịch ñệm Sorensen 1/15M, pH 6,5), rút protein dung dịch cân cột tương ứng + Ni vi khuẩn, tách proteinase P aeruginosa mơ tả trước [11] Kết thảo luận 3.1 Hoạt ñộ ức chế trypsin (TIA) hoạt ñộ ức chế chymotrypsin (ChIA) thân C sappan - Agar hãng Merk (ðức) Màng lọc vô khuẩn Minisart 0,2 µm hãng Sartorius Các hố chất khác ñạt ñộ phân tích Tách riêng thân thành ba phần: lớp vỏ (V), phần gỗ (G) phần lõi (L) Tỷ lệ trọng lượng phần V, G, L so với trọng lượng toàn thân theo thứ tự vào khoảng 39,5, 52,0 8,4% ðể lựa chọn dung dịch chiết rút TI ChI , ñã sử dụng loại dung dịch sau: dung dịch ñệm Sorensen M/15 pH 6,5, dung dịch ethanol 50% dung dịch NaCl 0,9% 263 H.T Hà, P.T.T Châu / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên Công nghệ 24 (2008) 261-270 Bảng Hàm lượng protein, TIA, ChIA thân C sappan sử dụng loại dung dịch khác ñể chiết rút Mẫu Vỏ mềm (vỏ thân) Gỗ Lõi Dung dịch dùng ñể chiết Protein mg/gam ðệm Sorensen Ethanol 50% NaCl 0,9% ðệm Sorensen Ethanol 50% NaCl 0,9% ðệm Sorensen Ethanol 50% NaCl 0,9% 1,46 26,06 0,94 0,81 3,67 0,68 2,20 12,15 0,45 mIU TIA tổng số (mIU/gam) 7,11 524,50 11,18 1,97 19,45 27,53 14,27 41,62 12,71 ChIA tổng số (mIU/gam) 19,00 749,40 20,80 14,85 50,05 0,00 29,20 174,37 HðR (mIU/mg protein) 4,85 20,13 11,92 2,44 5,30 0,00 6,50 3,42 28,24 mIU HðR (mIU/mg protein) 12,95 28,75 22,17 18,35 13,63 0,00 13,30 14,35 mg 30000 1200 25000 1000 20000 800 15000 600 25000 20000 15000 10000 10000 400 5000 5000 S3 S3 S1 S1 200 S3 S2 S2 S2 S1 3 Hình TIA (a), ChIA (b), Protein (c), tính theo tỷ lệ % trọng lượng phần so với toàn thân Vỏ ; gỗ ; Lõi S1: chiết NaCl 0,9% ; S2: chiết ñệm Sorensen 1/15M ; S3: chiết ethanol 50% Bảng Protein, TIA, ChIA phần tính 100g thân (theo tỉ lệ % trọng lượng phần so với tồn thân (100g thân có 39,5 g vỏ mềm; 52,0 g gỗ 8,5 g lõi) Chỉ tiêu phân tích Protein (mg) TIA (mIU ) ChIA (mIU) Dung dịch dùng ñể chiết rút Vỏ mềm Gỗ Lõi ðệm Sorensen Etanol 50% NaCl 0,9% ðệm Sorensen Etanol 50% NaCl 0,9% ðệm Sorensen Etanol 50% NaCl 0,9% 57,97 1029,89 37,15 208,98 20728,24 441,83 750,88 29616,28 822,02 47,36 191,02 35,39 102,53 1012,37 772,94 2605,10 18,50 102,18 3,78 102,01 350,02 106,89 244,06 1466,45 Tính tổng số phần 100 g thân 123,83 1232,09 76,32 413,52 22090,63 548,72 1767,88 33687,83 822,02 HðR (mIU/mg protein) 3,34 17,93 7,19 14,28 27,34 10,77 264 H.T Hà, P.T.T Châu / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên Công nghệ 24 (2008) 261-270 Kết bảng cho thấy TIA ChIA dịch chiết ethanol 50% V, G L cao dịch chiết khác Từ số liệu bảng tính dịch chiết ethanol 100g vỏ thân có TIA , ChIA theo thứ tự vào khoảng 52,45 IU 74,94 IU; TIA, ChIA phần gỗ thấp nhất, tính tổng TIA, ChIA gỗ lõi, theo thứ tự vào khoảng 6,11 IU 22,44 IU/100gam, thấp giá trị tương ứng vỏ mềm khoảng 8,5 lần Kết cho thấy: ChIA cao TIA, giống kết qủa nghiên cứu trước chúng tơi nhiều thuốc khác [12] Dựa vào tỉ lệ trọng lượng phần V, G, L so với trọng lượng toàn thân để tính protein, TIA, ChIA có 100 g thân, cho thấy: protein, TIA ChIA DC ethanol phần vỏ thân (V) cao phần khác, chiếm 39,5% trọng lượng thân (bảng 2, hình 1) Do đó, TIA, ChIA phần vỏ chiếm tỉ lệ % cao tổng TIA ChIA thân, dịch chiết ethanol NaCl chiếm đến 80% (hình 2) TIA 100% 80% loi 60% go 40% vo mem 20% 0% dem sorensen NaCl 0,9% a) Ethanol 50% ChIA 100% 80% loi 60% go 40% vo mem 20% 0% demsor ensen NaCl 0,9% Ethanol 50% b) protein 100% 80% loi 60% go 40% vo mem 20% 0% dem sorensen NaCl 0,9% Ethanol 50% c) Hình TIA (a), ChIA (b), Protein (c) tính theo % tổng protein TIA ChIA toàn thân chiết dung dịch khác Tóm lại, ta thấy phần vỏ thân (V) có hàm lượng protein, hoạt độ ức chế trypsin (TIA), ức chế chymotrypsin (ChIA) cao hẵn phần khác thân ðiều phần V có chứa mạch libe nên giầu chất so với phần gỗ Trypsin chymotrypsin proteinase có hệ tiêu hố nhiều động vật, TIA ChIA phần V cao ñể thực chức bảo vệ H.T Hà, P.T.T Châu / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên Công nghệ 24 (2008) 261-270 3.2 Hoạt ñộ ức chế proteinase (PIA) vỏ nhân hạt chín Các kết nghiên cứu trước chúng tơi hạt họ bí [6] cho thấy hạt già TIA cao, giai đoạn nước (desiccation), vậy, chúng tơi ñã 265 nghiên cứu lựa chọn ñược hạt giai đoạn có PIA cao, gọi hạt chín Sự phân bố TIA phần hạt khơng đồng đều, chúng tơi tách riêng vỏ hạt, nhân hạt chín xác định hoạt độ ức chế proteinase (PIA) phần Bảng Hàm lượng protein, hoạt ñộ ức chế proteinase (PIA) vỏ nhân hạt C.sappan chín Chỉ tiêu Phân tích Chất khô (%) Protein (mg/gam) PPsIA (mIU/gam) TIA (mIU/gam) ChIA (mIU/gam) Vỏ hạt Tính theo trọng lượng tươi 79,1 5,18 1709,00 2861,10 11.453,60 Tính theo trọng lượng khơ 7,81 2160,55 3617,06 14479,90 Kết bảng cho thấy TIA ChIA vỏ nhân hạt cao TIA, ChIA vỏ thân khoảng ñến 14 lần So sánh vỏ nhân hạt, ta thấy TIA ChIA khác khơng nhiều, hoạt độ ức chế proteinase Pseudomonas aeruginosa (PPsIA) DC vỏ hạt cao gấp lần PPsIA DC nhân hạt Thử hoạt tính kháng khuẩn (hình 3) cho thấy DC vỏ hạt có tác dụng ức chế sinh trưởng Nhân hạt Tính theo trọng lượng tươi 67,96 8,20 312,60 3020,00 10498,05 Tính theo trọng lượng khô 12,06 459,97 4443,79 15447,39 Pseudomonas aeruginasa Staphylococcus aureus (phân lập từ mủ vết thương) Tuy nhiên điện di DC vỏ hạt khơng phát băng protein băng PI Có thể PIA DC vỏ chủ yếu chất phân tử thấp, khơng phải protein? Vấn đề ñược tiếp tục nghiên cứu Các thí nghiệm tiếp cơng trình sử dụng nhân hạt Hình Hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết vỏ hạt (a): S aureus ; (b) P aeruginosa 266 H.T Hà, P.T.T Châu / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên Cơng nghệ 24 (2008) 261-270 3.3 Thăm dị ñiều kiện chiết rút chất ức chế trypsin (TI), ức chế chymotrypsin (ChI) từ hạt C sappan ðể lựa chon dung dịch thích hợp chiết rút chất ức chế chúng tơi sử dụng dung dịch thường dùng là: nước Mili Q, ñệm Sorensen 1/15M pH 6,5, dung dịch acetic acid 0,005M, dung dịch ñệm natri acetate 0,02M pH 4,5 (di động chậm) có nhiều so với dung dịch lại ðiều pH thấp (4,5) số protein phân tử lớn bị kết tủa Sử dụng phương pháp PAGE ñồng trùng hợp với chất casein 0,1% phương pháp nhạy, cho phép phát trực tiếp cách đầy đủ TI/ChI từ lượng dịch chiết thô (