Nghiên cứu tỷ lệ đột biến kháng thuốc hiv 1 ở đối tượng tiêm chích ma túy và gái mại dâm tại hải phòng

NGHIÊN CỨU TỶ LỆ ĐỘT BIỂN KHÁNG THUỐC HIV-1 Ở ĐỐI TƯỢNG TIÊM CHÍCH MA TÚY VÀ GÁI MẠI DÂM TẠI HẢI PHÒNG ThS Trần Th ị Vượng*; BS Phạm T h ị Tâm*; BS Trịnh T hị Hằng* TÓM T T Xác định tỷ iệ nhiễm, tỷ lệ đột biến kháng thuốc HIV đối tượng tiêm chích ma túy gái mại dâm Hài Phòng Đối tượng phutmg pháp: Thu thập mẫu huyết từ 633 đối tượng Hải Phòng chia làm nhổm: Tiêm chích ma túy 492 đối tượng gái mại đâm 141 đối tượng Sàng lọc HIV đương tính test nhanh ABBOT, tách ARV virut, khuếch đại vùng gen /?ớ/­Protease pol-KỸ, giải tr nh tự gen để xác định điểm đột biến kháng thuốc Kết quả: Tỷ lệ nhiễm HIV­1 đối tượng tiêm chích ma túy vịi gái mạ dâm Hải Phòng là: 35.2% (173/492) 24,1% (34/141) Không phát ca kháng thuốc loại ức chế protease ca mang đột biến kháng thụốc ức chể RT điểm K101E, G190E (2 ca), K219E Như vậy, tỷ lệ đột biến kháng thuốc tự nhiên cùa HIV Hải Phòng ỉà 2,5% * Từ khóa: HIV; Đột biến kháng thuốc Hrv, Prevalence o f H IV ­ ĩ drug ” resừtant mutation am ong injection drug user a n dfem al sex workers in H aiphong Sum m ary This study was caned'out to investigate the prevalence of HIV­1 infection and HIV­1 drag resistance mutation among injection drag users and femal sex worker in Haiphong Subject and methods: Plasma sample were collected from 633 subjects among different groups in Haiphong: injection drug users (IDU, n = 492), femai sex workers (FSW, n = 141) Samples were screened for the HĨV antibody Pol PR, Pol RT were amplified by One­Step: One­Step RT­PCR and Nesied PCR The PVR products were sequenced directly and checking drug resistance mutation using HTV database of Stanford and International AIDS Society­USA November 2011 list Results and conclusion: H iv I antibody prevalence was 35.2% in ĨDU (173/492), 24.1% in FSW (34/141) Nucleoside revers­transcriptase inhibitor resistance mutations were found in one case (K219E) and nonucleoside revers­ transcriptase inhibitor resistance mutations were found in cases (1 case with K1Ữ1E, cases with G190E) of 159 successfully analyzed cases Thus, the prevalence of HIV­1 drug resistance mutation in Haiphong was 2.5%, that suggest the Preventing HIV Project in Vietnam, which targets injection drug users and femal sex workers may have taken effect to restrain HIV harm * Key words: HIV; HIV drug ­ resistance mutation: Ĩ.ĐẶ TVẤ NĐ Ở Việt Nam, ca nhiễm HIV phát thành phố Hồ Chí M inh vào năm 1990 [1] Với tốc độ lây an nhanh, đến năm 1999, tỷ lệ mắc HIV đuợc phát đa sổ tỉnh thành toàn quốc [2], cuối năm 2010, số người nhiễm HIV vào khoảng 254.000 người [3] Theo nghiên cứu, hầu hết người nhiễm HIV V iệt Nam có kiểu gen CRF­01AE, số cịn lại kiểu gen B, c B­C Liệu pháp điều trị kết hợp dùng thuốc kháng retrovirus (ART­antiretroviral therapy) thuốc RTI (ức ché RT bao gồm NRTI (nucleosiđ reverse transcriptase inhibitor) v NNRTI (Non­ nucleosid reverse transcriptase inhibitor) PI (ức ché protease) trờ thành phương pháp điều trị phổ biến từ cuối năm thập kỷ 90, phương pháp điều trị giúp cải thiện đáng kể việc tiên luợng bệnh nhân nhiễm HIV, đặc biệt nước phát triển Phương pháp kháng virat áp dụng phổ biến Việt N am từ năm 2003 với số lượng người trưởng thành sử dụng thuốc tăng từ 30% năm 2007 đến 53,7% năm 2009 [3] Chính việc sử dụng thuốc rộng rãi * Đại học Y Dược Hăỉ Phịng 498 khơng kiểm soát chặt chẽ tạo áp lực chọn lọc đột biến cho virut dẫn đến tăng lan truyền chủng kháng thuốc Việt Nam Đ ã có nhiều nghiên cứu công bố tỷ lệ kháng thuốc vịng miền khác tồn quốc [4, 5] V vậy, tiến hành nghiên cứu nhằm: X c định tỷ lệ nhiễm tỷ lệ đột biến kh ản g thuốc H I V tự n hiên đối tượn g tiêm chích m a túy gải m i đâm tợi H ả i Phồng II ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c u 2.1 Đổi tư ợn g n ghiên cứu 633 người, 492 đối tượng thuộc nhóm tiêm chích m a túy 141 đối tượng gái mại dâm trại cai nghiện trung tâm phục hồi nhân phẩm Hải Phòng Huyết lấy vào ống chống đông EDTA­K2 DNAse va RNAse FREE 2.2 Phưcm g p h áp ngh iên u * Sàng lọc HIV test nhanh ABBORT, Nhật Bản * Tách ARN ­H TV ­1 từ huyết tương kit SMITEST EX­R&D (Genome Science Laboratories, Fukushima, Nhật Bản) * Khuếch đại vùng gen pol­ RT pol­ PR kỹ thuật one­step RT­PCR nested PCR + Khuếch đại vùng gen pol­ PR “>Bước 1: One­step RT­PCR Cặp mồi ĐRPR05 (5*AGACAGGYTAATTTTTTGGGA­3’) DRPR02(5 *ÀTGGATTTTC AGGCCCAATTTTTGA­3 ’) M IX (12,5 ịxĩ 2x reaction; 8,5 ụĩ DW; 0,5 ụì 10 ^iM DRPR05; 0,5 ịiỉ Ỉ0 |iM DRPR02L; 0,5 fil SSIII Taq platinum HiFi), RNA template: 2,5 |il Chu tr nh nhiệt: 55oC/30 phút; 94oC/2 phút; (94oC /ỉ5 giây; 55oC/30 giây; 680 C /I phút), lặp 40 chu kỳ; 680 C phút; 4oC/dừng phản ứng ~>Bước 2: Nested PCR Cặp mồi DRPR01M (5’­ AGAGCCAACAGCCCCACCAG­3’) DRPR06 (5’­ ACTTTTGGGCCATCCATTCC­3’) M X (10,2 III ĐW; 2,0 ill 10X buffer; 2,0 111 mMdNTP2; 2,8 ịi\ 25 mMMgC12; 0,4 ụì 10 mM DRPR01M; 0,4 ịiì 10 mM DRPR06; 0,2 IÌ ampli Taq gold), sản phẩm one­ step RT­PCR: 2,0 |il Chu tr nh nhiệt: 95oC/10 phút; (95oC/30 giây; 55oC/30 giây; 72oC /l phút) ỉặp 40 chu kỳ; 72oC/10 phút; 4oC/dừng phản ứng + Khuếch đại vùng gen pol­ RT ­>Bước 1: One­step RT­PCR Cặp mồi DRRT1L (5’~ ATGATGGGGGAATTGGAGGTTT­3’) RT Oue(5 aTaTacTccaTgcacaggggTTTT-3 ) M IX (12,5 2x reaction; 8,5 ụ ỉ DW; 0,5 ịiỉ 10 fiM DRRT1L; 0,5 ụ ì RTo; 0,5 ịiỉ Taq HiFi), RNA template: 2,5 ụ l Chu tr nh nhiệt: 55oC/30 phút; 94oC/2 phát; (94oC/15 giây; 55oC/30 giây; 680 C /I phứt) ỉặp 40 chu kỳ; 680 C phút; 4oC/đửng phản ứng ­> Bước 2: Nested PCR 499 Cặp mồi DRRT7L(5’­ GACCTACACCTGCAACATAATTGG­3’) DRRT6L (5’­ T AATCCCTGCATA AATCTGACTTGC­3 ’) M IX (3,5 ụ l DW; 12,5 |il KOD 2x buffer; 5,0 ịi\ mMdNTP; 0,75 ịú lOmM DRRT7L; 0,75 ịiì 10 mM DRRT6L; 0,5 |il KDD Fix), sản phẩm one­ step RT­PCR: 2,0 Jil Chu trinh nhiệt: 4oC /lpht t; (98oC/10 giây; 55oC/30 giây; 68oC/90 giây) lặp 35 chu kỳ; 4oC/d mg nhản r ““ “ ứne ““ e ' , * Giải tr nh tr nh tự gen sản phẩm nested PCR H I.K T Q U Ả ­ Tỷ lệ nhiễm H IV ­l theo nhóm đối tượng Hải Phòng: Bằng test sàng lọc HIV antibody, pbát 173/492 đối tượng tiêm chích ma túy, 34/141 đối tượng gái mại dâm cho kết dương tính Theo đó, tỷ lệ nhiễm HTV­l đối tượng 35,2% nhóm tiêm chích ma tứy 24,1% nhóm gái mại dâm Tỷ lệ so sánh vói nghiên cứu trước Hải Phịng khơng có khác biệt đáng kể (Bảng í) Theo chúng tơi, kết phản ánh hiệu dự án phịng chống I irv cho đối tượng tiêm chích ma túy gái mại dâm Thành phố Hải Phòng [6] Với nhiều chương tr nh đ vào hoạt động giai đoạn tích cực hoạt động dùng methadone thay chất gây nghiện quận Lê Chân, hoạt động tuyên truyền phồng chống lây nhiễm m v tụ điểm nóng hành nghề mại đâm (các khu nhà nghi, khách sạn, hay tụ điểm karaoke) có hiệu tích cực phịng chống lây nhiễm HIV Bảng Đặc điểm đối tượng nghiên cứu tỷ lệ nhiễm HIV­1 sế lượng Tuểỉ trung b nh Tiêm chích ma túy 492 Gái mại dâm 141 Nhóm đếi tirợng Dương tính HIV antibody test (%) Nghiên cứu Nghiên cứu trước 38,7 35,2% (173/492) 35,9 28,9 24,1% (34/141) 23,ỉ% * T ỷ lệ đột biến kháng thuốc HIV: Trong 207 đối tượng nghiên cửu có kết dương tính với test HIV antibody (tiêm chích ma túy 173 gái mại dâm 34), thực giải tr nh tự gen thành công 159 mẫu + Kết đột biến kháng thuốc ức chế protease (Protease Inhibitor­PI) Kết cho thấy khơng có mẫu có đột biển kháng thuốc lại thuốc ức chế loại PI Điều phù hợp với t nh trạng hạn chế dùng thuốc PI ốc chế virut HIV Việt Nam nhiều nước thể giới, giá loại thuốc cao nên tỷ iệ đột biến kháng loại thuốc mức độ thấp * Két đột biến kháng thuốc ức chế enzym mã ngược: Reverse­transcriptase Inhibitor (RTI) Nghiên cứu t m mẫu có đột biến kháng thuốc ĩoại RTI Trong đó, mẫu mang đột biến kháng thuốc điểm G190E, mẫu mang đột biến điềm K101E­ ià loại kháng thuốc nhóm NNRTĨ, mẫu mang đột biến kháng thuốc điểm K219E­ Là loại đột biến kháng thuốc nhóm NRTI Theo IAS (International AIDS Society­ ƯSA November 2011 list [73 , đột biến K219E điểm đột biến kháng mạnh với thuốc ức chế nhóm NRTI stavudine v zidovudine, K 10IE kháng lại rilpivirine Theo HFV database cùa Trường Đại học Stanford ­ Hoa Kỳ th đột biến điểm G190E kháng mạnh với efavirenz, nevirapin kháng mức độ thấp với 500 etravirine rilpivirine Trong mẫu có đột biến kháng thuốc này, mẫu thuộc nhóm tiêm chích ma túy, mẫu thuộc nhóm gái mại dâm (Bảng 3.2) T ỷ lệ đột biến kháng thuốc đối tượng tiêm chích ma túy gái mại dâm Hải Phòng 2,5% với RTI % với PI Như vậy, tỷ lệ đột biến kháng thuốc HIV chung Hải Phòng đối tượng 2,5% Bảng Đặc điểm đối tượng mang đột biến kháng thuốc Đột biến RTI M ẫu huyết Đổi tưọng Năm sinh Đột biến PI HPA­155 Tiêm chích ma túy 1971 Khơng K101E HPA­162 Tiêm chích ma túy 1971 Khơng G190E HPA­347 Tiêm chích ma túy 1976 Khơng HPC­122 Gái mại dâm 1975 Khơng NRTI NNRTI K219E G190E Ngồi điểm đột biến trên, nghiên cứu cịn phát điểm đột biến phụ điểm đột biến tiềm ẩn vùng gen protease vùng RT Bảng Đặc điểm đối tượng mang đột biến phụ đột biến tiềm ẩn Đột biến PI Đột biển RTI Mầu huyết Đổi tuọng Năm sinh HPA­227 Tiêm chích ma túy 1980 L10V HPA­360 Tiêm chích ma túy 1970 VỈ1I HPC­68 Gái mại đâm 1980 L10I HPC­89 Gái mại dâm 1979 L10I HPA­08 Tiêm chích ma túy 1971 V179E HPA­Ì75 Tiêm chích ma túy 1981 V179D HPA­271 Tiêm chích ma túy Ỉ976 K70T HPA­295 Tiêm chích ma túy 1979 T69N HPA­339 Tiêm chích ma tứy 1968 V179D HPA­392 Tiêm chích ma túy 1976 V179D NRTI NNRTI V179D IV K É T LUẬN T ỷ lệ nhiễm HIV đối tượng tiêm chích ma íúy gái mại đâm Hải Phòng theo nghiên cứu chúng tồi 35,2% 24,1% Qua nghiên cứu 159 mẫu huyết dương tính giải tr nh tự gen kỹ thuật sinh học phân tử, xác định tỷ lệ đột biến kháng thuốc HIV đối tượng Hải Phòng 2,5% 501 T À I L IỆ U TH A M K H ẢO Lindan c, Lieu T, Giang L, et al Rising HIV infection rates in Ho Chi Minh City herald emerging AIDS epidemic in Vietnam AIDS 1997, 11 (Sup pi 1), S5­13 Nguyên T, Hoang T, Pham K, van Ameijiden E, Deville w, and Wolffers I HTV monitoring in Vietnam: System, methodology, and results of sentinel surveillance J Acqui Immune Defic Syndr 1999, 21 (4), 338­346 The Socialist Republic of Viet Nam Declaration of Commitment on HIV and AIDS adopted at 26th United Nations General Asembly Special Sesion in June 2001 (ƯNGASS), 2010 Ishizaki A, Cuong N, Thuc p et al Profile of HIV type infection and genotypic resistance mutations to antiretroviral drugs in Hai Phong Vietnam AIDS Res Hum Retroviruses 2009, 25 (2), pp.175­182 Phan TTC, Ishizaki A, Phung DC, Bi X, Oka s and Ichimura H Characterization of HIV type genotypes and drug resistance mutations among đrag­naỉve HIV type­1 infected patients in Northern Vietnam AIDS Res Hum Retroviruses 2010,2 (2), pp.233­235, World Health Organization/ Western Pacific Regional Office and partner Good practice in Asia: Targeted HIV prevention for injecting drag users and sex workers Vietnam’s first large­scale national harm reduction initiative, 2010 http://www.who.mt/hiv/pub/idu/wpro vietnam/en/index.html Johnson VA, Calvez V, Gunthard HF, et al 2011 update of the drug resistance mutations in HIV­1 Top Antivir Med 2011,19 (4), PP.ỈS6­Ỉ64 NGHIÊN CỨU BIỆT HÓA TẾ BÀO GĨC TRUNG MƠ MÀNG DÂY RĨN NGƯỜI THÀNH TỂ BÀO DẠNG TẠO XƯƠNG TÓM TẲT TS Đ M inh Trung* Tế bào gốc (TBG) tế bào chưa có chức'năng chun biệt, có khả biệt hố thành nhiều loại tể bào khác để thay cho tế bào bị già chết tự nhiên hay chấn thương v nhiều nguyên nhân khác Ghép TBG từ tuỷ xương tự thân dùng lâm sàng để điều trị gãy xương lâu liền khớp giả Tuy nhiên, nguôn TBG tùy xương cịn khó khăn số lượng tế bào quy tr nh Èhu thập tế bào tương đối phức tạp Nhằm tăng hiệu điều trị tái tạo xuơng, TBG cần tẫng sinh số lượng biệt hóa ỉn viíro thành lượng lớn tế bào tạo xương trưởc cấy ghép vào xương gãy V vậy, tiến hành nuôi cấy tăng sính biệt hóa in vitro TBG trung mơ màng dây rốn người thành tế bào dạng tạo xương làm tiền đề cho nghiên cứu ứng dụng loại TBG đặc biệt vào điều trị tương lai Đổi tượng phương pháp nghiên cứu: Dây rốn 10 trẻ sơ sinh mẹ đẻ ià áản phụ > ỉ tuổi, có tiền sử khỏe mạnh, có kết âm tính với xét nghiệm sàng lọc bệnh nhiễm trùng (bao gồm virus HIV, virus viêm gan B, virus viêm gan c, virus CMV vi khuẳn giang raai), trẻ sinh độ tuổi thai > 37 tuần, sinh raột khơng có tai biến q tr nh sỉnh đẻ Nuôi cấy tăng sinh TBG trung mơ từ màng dây rốn người: Biệt hóa in vitro TBG trung mơ thành TBDTX: Kiểm tra tích tụ canxi quanh té bào sau biệt hóa nhuộm alizarin red, khả ch tụ canxi TBDTX biệt hóa từ TBG trung mơ màng dây rốn, xác định hoạt tính alkaline phosphates (ALP) Tách chiết ARN tiến hành phàn ứng RT­PCR để xác định dâu ấn sinh học tế bào dạng tạo xương biệt hóa từ TBG trung mô màng rốn * Học viện Quân y 502 ... 19 80 L10I HPC­89 Gái mại dâm 19 79 L10I HPA­08 Tiêm chích ma túy 19 71 V179E HPA­Ì75 Tiêm chích ma túy 19 81 V179D HPA­2 71 Tiêm chích ma túy Ỉ976 K70T HPA­295 Tiêm chích ma túy 19 79 T69N HPA­339 Tiêm. .. đối tượng mang đột biến kháng thuốc Đột biến RTI M ẫu huyết Đổi tưọng Năm sinh Đột biến PI HPA? ?15 5 Tiêm chích ma túy 19 71 Khơng K101E HPA? ?16 2 Tiêm chích ma túy 19 71 Khơng G190E HPA­347 Tiêm chích. .. nhóm gái mại dâm (Bảng 3.2) T ỷ lệ đột biến kháng thuốc đối tượng tiêm chích ma túy gái mại dâm Hải Phòng 2,5% với RTI % với PI Như vậy, tỷ lệ đột biến kháng thuốc HIV chung Hải Phòng đối tượng