Nghiên cứu tỷ lệ đột biến gen kháng thuốc của HBV ở đối tượng tiêm chích ma túy và gái mại dâm tại Hải Phòng

Bài viết nghiên cứu tỷ lệ đột biến gen kháng thuốc của HBV ở đối tượng tiêm chích ma túy và gái mại dâm tại Hải Phòng. Bài viết thu thập 633 mẫu huyết thanh từ đối tượng tiêm chích ma túy (TCMT) (n = 492) và gái mại dâm (GMD) (n = 141) tại các Trung tâm Giáo dục và Lao động xã hội, Thành phố Hải Phòng.

TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 NGHIÊN CỨU TỶ LỆ ĐỘT BIẾN GEN KHÁNG THUỐC CỦA HBV Ở ĐỐI TƢỢNG TIÊM CHÍCH MA TÚY VÀ GÁI MẠI DÂM TẠI HẢI PHÒNG Nguyễn Hùng Cường*; Nguyễn Bảo Trân*; Hoàng Thị Thanh Huyền* Azumi Ishizaki**; Hiroshi Ichimura**; Phạm Văn Thức* TÓM TẮT Thu thập 633 mẫu huyết từ đối tượng tiêm chích ma tuý (TCMT) (n = 492) gái mại dâm (GMD) (n = 141) Trung tâm Giáo dục Lao động xã hội, Thành phố Hải Phòng Tách chiết HBV-ADN từ mẫu huyết có kết sàng lọc HBsAg dương tính Khuếch đại vùng gen Pol-RT HBV nhờ phản ứng Nested PCR sản phẩm sau PCR giải trình tự gen trực tiếp Phân tích đột biến kháng thuốc HBV chương trình GENETYX hướng dẫn Standford University sở kết giải trình tự vùng gen Pol-RT Kết quả: tỷ lệ nhiễm HBV hai nhóm đối tượng TCMT GMD Hải Phòng 10,59% Trong đó, nhóm TCMT 10,57% nhóm GMD 10,64% Ba genotýp/subtýp HBV phát khu vực duyên hải phía Bắc; HBV subtýp B4 có tỷ lệ phân bố phân bố cao (77,61%), subtýp C1 (19,4%) subtýp I1 (2,99%) Tỷ lệ đột biến gen kháng thuốc lamivudine 67 chủng HBV nghiên cứu 3,84% kháng thuốc adefovir entercavir 0% Một chủng HBV genotýp B xuất đột biến kiểu YMDD Axít amin vị trí aa 204 vùng gen Pol-RT methionine thay aa isoleucin tứ aa YMDD (tyrosine-methionine-aspartate-aspartate) chuyển thành YIDD Đây đột biến kháng đa thuốc dòng nucleoside analogue, ngồi kháng lamivudine, chủng virut kháng thuốc telbivudine telnofovir Một chủng HBV genotýp B xuất đột biến vị trí aa 80 vùng gen Pol-RT, aa leucine vị trí 80 thay aa isoleucin, chủng kháng lamivudine đơn độc theo chế đột biến L80I Xuất đột biến tự nhiên kiểu YIDD yếu tố cảnh báo nguy điều trị thất bại với thuốc lamivudine tenofovir * Từ khoá: Viêm gan virut B; Đột biến gen kháng thuốc; Tiêm chích ma túy; Gái mại dâm Study on drug resistant hepatitis B virus mutant frequency among drug intravenous user and female sex worker groups in Haiphong, Vietnam Summary Plasma samples were collected from 633 subjects among two groups (drug intravenous user [IDU]: 492; female sex worker [FSW]: 141) in the Rehabilitation Center in Haiphong Plasma viral DNA was extracted from samples that were positive for hepatitis B suface antigen (HBsAg) Pol-RT regions of HBV were amplified by PCR with primers (HB1F(18-39)/HB1R(534-557) and HB2F(414433)/HB2R(970-989)) PCR products were sequenced directly and analized by GENTYX program, introducted by Standford University * Đại học Y Hải Phòng ** Đại học Kanazawa, Nhật Bản Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Hùng Cường (nhcuong@hpmu.edu.vn) Ngày nhận bài: 21/5/2013; Ngày phản biện đánh giá báo:20/6/2013 Ngày báo đăng: 15/7/2013 Results: HBsAg prevalence was 10.57% and 10.64% among IDU and FSW groups in Haiphong Three HBV genotypes/subtypes were confirmed, subtypes B4 was predominant (79.87%), followed by subtypes C1 (18.87%) and subtypes I1 (1,26%) Two subtypes I1 strains were indentified Subtype 57 TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 I1 was identified with very rare prevalence in Vietnam Lamivudine resistant rate was 3.84% (L80I mutation: 1.92%; M204I mutation: 1.92%) and tenofovir resistant rate was 1.92% (M204I mutation) The resistant rate of adefovir and entercavir was 0% M204I mutation (YMDD =>YIDD) was crossresistant mutation, HBV will resistant with lamivudine, tebivudine and tenofovir The appearance of cross-resistant mutations can expect treatment failure with multi-drugs in future The buidinge of a national program to monitor the appearance HBV drug resistant mutations is very important * Key words: HBV; Drug resistant mutation; Intravenous drug user; Female sex worker ĐẶT VẤN ĐỀ Viêm gan virut B (HBV) vấn đề sức khỏe quan tâm toàn giới Khoảng 5% dân số giới bị nhiễm HBV, tương đương với 350 triệu người [8, 9] Theo kết nghiên cứu tháng - 2008 1.077 đối tượng Hải Phòng, tỷ lệ nhiễm HBV 12,2% [1] Đa số nhiễm HBV mạn tính, số lớn tình trạng viêm gan B mạn tính có nhu cầu điều trị bệnh Thuốc điều trị HBV gồm: interferon alfa, peginterferon alfa, nucleosid [3, 4, 5] Trong đó, chế phẩm interferon có giá thành cao đa số bệnh nhân khơng có hội sử dụng Các thuốc thuộc nhóm nucleosid analogues gồm: lamivudine, adefovir dipivoxil, entecavir, tenofovir emtricitabine… sử dụng chủ yếu có hiệu điều trị HBV [2] Tuy nhiên, vấn đề lựa chọn phác đồ điều trị hợp lý có sơ sở để đảm bảo hiệu q trình điều trị gặp nhiều khó khăn thông tin kháng thuốc HBV Việt Nam cơng bố khơng nhiều Vì vậy, hiệu điều trị thấp làm cho nguy kháng thuốc HBV ngày cao Mục tiêu nghiên cứu nhằm: Nghiên cứu tỷ lệ đột biến gen kháng thuốc HBV đối tượng TCMT GMD Hải Phòng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu Tổng cộng 633 đối tượng, đó: - Nhóm TCMT: 492 đối tượng có TCMT, quản lý cai nghiện Trung tâm Giáo dục Lao động xã hội Hải Phòng - Nhóm GMD: 141 đối tượng hành nghề mại dâm, quản lý Trung tâm Giáo dục Lao động xã hội Hải Phòng Phƣơng pháp nghiên cứu * Kỹ thuật sinh phẩm sử dụng nghiên cứu: - Các mẫu huyết sàng lọc nhiễm HBV kít Determin ABBOTT (Nhật Bản) nhằm phát kháng nguyên bề mặt virut viêm gan B (HBsAg) - Các mẫu có kết HBsAg dương tính tách HBV-ADN, sử dụng kít Smitest EX-R&D (Genome science laboratories, Fukushima, NhËt Bản) - Chạy PCR khuyếch đại vùng gen Pol-RT HBV sinh phẩm ampli Tag Gold, Ampplied Biosystems với cặp primer: HB1F(18-39)/HB1R(534-557) HB2F(414433)/HB2R(970-989) (Fuminaka Sugauchi CS, 2001) - Giải trình tự gen trực tiếp kit Big Dye terminator (genetic analyzer, ABI PRISM 3130, Applied biosystems) * Xử lý số liệu phần mềm: - So sánh trình tự nucleotid trình tự sử dụng chương trình phần mềm Clustal W (Thompson, 1994) đoạn trình tự mẫu lấy 58 TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 hợp hướng dẫn Standford university địa Web: http://hivdb.stanford.edu/ HBV/HBVseq/development/hbvseq.pl?actio n=showSequenceForm từ Genbank/EMBL/DDBJ - Xác định đột biến kháng thuốc HBV sở giải trình tự gen vùng Pol-RT HBV Đối chiếu kết đột biến theo hướng dẫn liệt kê theo bảng [2, 9] kết Bảng 1: Vị trí đột biến kháng lamivudine, telbivudine, adeforvir, telnofovir entercavir Vị trí đột biến Lamivudine Telbivudine Adeforvir L80V/I; V173L; L180M; M204V/I; M204I A181V/T; N236T; N238D; V84M; S85A; V214A; Q215S I169T; A181T; M204S; T184S; Q215S Telnofovir Entercavir A194T; V173L; L180M; M204V; I169T; T184G; S202I; M250V L180M; M204I; V214A; Q215S KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Tỷ lệ nhiễm HBV Bảng 2: Tỷ lệ nhiễm HBV nhóm đối tượng TCMT GMD Hải Phòng NHĨM HBsAg (+) TUỔI TRUNG BÌNH n n % TCMT 492 38,72 52 10,57 GMD 141 28,88 15 10,64 Tổng 633 67 10,59 Tû lệ nhiễm HBV Hải Phòng 10,59%, khơng có khác biệt tỷ lệ nhiễm HBV nhóm TCMT GMD (p > 0,05) Phân bố kiểu genotýp HBV Bảng 3: Phân bố kiểu genotýp HBV dựa vùng gen Pre-S1 NHÓM n GENOTÝP B4 GENOTÝP C1 GENOTÝP I1 n % n % n % TCMT 52 41 78,85 10 19,23 1,92 GMD 15 11 73,33 20 6,67 Tổng 67 52 77,61 13 19,40 2,99 Nhóm nghiên cứu tiến hành giải trình tự vùng gen Pre-S1 67 chủng HBV Trên sở trình tự giải mã này, truy cập vào trang Web: 60 TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 http://www.ncbi.gov.nhi.gov để tiến hành lấy đoạn gen Pre-S1 reference genotýp HBV công bố đối chiếu kết Kết cho thấy genotýp B4 phổ biến Hải Phòng chiếm 77,61%, genotýp C (19,4%) Có chủng (2,99%) thuộc genotýp I1 xác định Đây chủng it gặp Việt Nam [6, 7] Tỷ lệ đột biến kháng thuốc HBV Bảng 4: Tỷ lệ đột biến gen kháng thuốc HBV với lamivudine VỊ TRÍ ĐỘT BIẾN GENOTÝP B4 (n = 52) n L80V L80I I169T % GENOTÝP C1 (n = 13) n % GENOTÝP I1 (n = 2) n 0 0 0 V173L 0 L180M 0 A181T 0 T184S 0 M204V 0 M204I 0 M204S 0 Q215S 0 Tổng 1,92 1,92 3,84 Tỷ lệ đột biến gen kháng thuốc lamivudine 67 chủng HBV nghiên cứu 3,84% (2/67) Các đột biến kháng lamivudine genotýp B không thấy xuất đột biến kháng lamivudine HBV genotýp C 67 chủng HBV nghiên cứu Một chủng HBV genotýp B xuất đột biến kiểu YMDD vị trí aa 204 vùng gen Pol-RT Axít amin vị trí aa 204 vùng gen Pol-RT methionine thay aa isoleucin tứ aa YMDD (tyrosine-methionineaspartate-aspartate) chuyển thành YIDD Với chế đột biến M204I Đây đột biến % kháng đa thuốc dòng nucleoside analogue, ngồi kháng lamivudine, chủng virut kháng thuốc telbivudine telnofovir Đây thuốc sử dụng phổ biến điều trị giới, chưa sử dụng nhiều Việt Nam Một chủng HBV genotýp B xuất đột biến vị trí aa 80 vùng gen Pol-RT, aa leucine vị trí 80 thay aa isoleucin Như vậy, chủng kháng lamivudine đơn độc theo chế đột biến L80I 61 TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 Bảng 5: Tỷ lệ đột biến gen kháng thuốc HBV với adefovir VỊ TRÍ ĐỘT BIẾN GENOTÝP B4 (n = 52) n % GENOTÝP C1 (n = 13) n % GENOTÝP I1 (n = 2) n V84M 0 S85A 0 A181V 0 A181T 0 V214A 0 Q215S 0 N236T 0 N238D 0 Tổng 0 % Bảng 6: Tỷ lệ đột biến gen kháng thuốc HBV với entercavir VỊ TRÍ ĐỘT BIẾN GENOTÝP B4 (n = 52) n % GENOTÝP C1 (n = 13) n % GENOTÝP I1 (n = 2) n I169T 0 V173L 0 L180M 0 T184G 0 S202I 0 M204V 0 M250V 0 Tổng 0 n % C1 (n = 13) n % L180M 0 A194T 0 M204I 0 V214A 0 Q215S 0 Tổng 0 1,92 1,92 KẾT LUẬN - Tỷ lệ nhiễm HBV 633 đối tượng (TCMT = 492 GMD = 141) Hải Phòng 10,59% (67/633), đó, đối tượng TCMT 10,67% GMD 10,64% Genotýp phổ biến nhóm đối tượng nghiên cứu genotýp B (B4 77,61%); genotýp C (C1: 19,4%) genotýp I (I1: 2,99%) I1 (n = 2) n Sự xuất đột biến tự nhiên vị trí aa 204 vùng gen Pol-RT theo kiểu YIDD yếu tố quan trọng để cảnh báo nguy bệnh nhân điều trị lâm sàng thất bại với thuốc lamivudine chí với telbivudine tenofovir từ lần điều trị Do vậy, vấn đề thầy thuốc lâm sàng định làm xét nghiệm phát đột biến kháng thuốc nhằm lựa chọn thuốc điều trị hợp lý tiên lượng hiệu điều trị cho người bệnh cần đặt sớm, điều tiết kiệm thời gian, chi phí điều trị đảm bảo phác đồ điều trị cho bệnh nhân tối ưu % Bảng 7: Tỷ lệ đột biến gen kháng thuốc HBV với tenofovir B4 (n = 52) Tỷ lệ đột biến gen kháng thuốc adeforvir entercavir 67 chủng HBV nghiên cứu 0% (0/67), tỷ lệ đột biến gen kháng thuốc tenofovir 1,92% (1/67) % - Tỷ lệ đột biến gen kháng thuốc lamivudine 67 chủng HBV giải trình tự gen 3,84% (2/67), tất HBV genotýp B, không thấy xuất đột biến kháng thuốc chủng genotýp C Xuất chủng đột biến vị trí aa 80 vùng Pol-RT (L80I) chủng có đột biến kiểu YMDD vị trí aa 204 vùng Pol-RT (M204I) Với đột biến M204I, tứ aa YMDD đổi thành YIDD chủng virut kháng lamivudine, telbivudine telnofovir Tỷ lệ đột biến gen kháng thuốc adeforvir entercavir 67 chủng HBV nghiên cứu 0% 62 TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyen HC, Ishizaki A, Phan TTC, Hoang TTH, Nguyen VT, Tanimoto T, Lihana PW, Matsushita K, Bi X, Pham VT, Ichimura H Prevalence of HBV infection among different HIV-risk groups in Hai Phong, Vietnam J Med Virol 2011, 83, pp.399-404 Zoulim F, Locarnini S Hepatitis B virus resistance to nucleos(t)ide analogues Gastroenterolgy 2009, Nov, 137 (5), pp.1593-608 Kobayashi M, Suzuki F Response to longterm lamivudine treatment in patients infected with hepatitis B virus genotypes A, B and C J Med Virol 2006, 78 (10), pp.1276-1283 Kumar M, Satapathy S, Monga R A randomized controlled trial of lamivudine to treat acute hepatitis B Hepatology 2007, 45 (1), pp.97-101 Wen X, Li X, Xie H Lamivudine for acute hepatitis B infection Hepatology in AASLD practice, Guideline 2007 Tran Thien Tuan Huy, Hiroshi Ushijima et al Characteristics of core promoter and Precore stop codon mutants of hepatitis B virrus in Vietnam J of Med Virology 2007, 74, pp.228-236 Bui Xuan Truong, Yoshihiko Yano, Yasushi Seo et al Variations in the core promoter/precore region in HBV genotype C in Japanese and Northern Vietnamese patients J of Med Virology 79, pp.1293-1304 Saul Krugman, M.D et al Hepatitis B infection: Strategies for clinicians Infections in medicine New York University Medical Center 2008, pp.5-30 Kao JH, Chen DS Global control of hepatitis B virus infection Lancet Infect Dis 2009, Jul, (7), pp.395-403 Review 63 TẠP CHÍ Y – DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ - 2013 64 ... cho nguy kháng thuốc HBV ngày cao Mục tiêu nghiên cứu nhằm: Nghiên cứu tỷ lệ đột biến gen kháng thuốc HBV đối tượng TCMT GMD Hải Phòng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu Tổng... % Bảng 7: Tỷ lệ đột biến gen kháng thuốc HBV với tenofovir B4 (n = 52) Tỷ lệ đột biến gen kháng thuốc adeforvir entercavir 67 chủng HBV nghiên cứu 0% (0/67), tỷ lệ đột biến gen kháng thuốc tenofovir... đột biến gen kháng thuốc lamivudine 67 chủng HBV nghiên cứu 3,84% (2/67) Các đột biến kháng lamivudine genotýp B không thấy xuất đột biến kháng lamivudine HBV genotýp C 67 chủng HBV nghiên cứu