Bài viết nghiên cứu tỷ lệ đột biến gen kháng thuốc của HBV ở đối tượng tiêm chích ma túy và gái mại dâm tại Hải Phòng. Bài viết thu thập 633 mẫu huyết thanh từ đối tượng tiêm chích ma túy (TCMT) (n = 492) và gái mại dâm (GMD) (n = 141) tại các Trung tâm Giáo dục và Lao động xã hội, Thành phố Hải Phòng.
Trang 1NGHIÊN CỨU TỶ LỆ ĐỘT BIẾN GEN KHÁNG THUỐC CỦA HBV
Ở ĐỐI TƢỢNG TIÊM CHÍCH MA TÚY VÀ GÁI MẠI DÂM TẠI HẢI PHÒNG
Nguyễn Hùng Cường*; Nguyễn Bảo Trân*; Hoàng Thị Thanh Huyền*
Azumi Ishizaki**; Hiroshi Ichimura**; Phạm Văn Thức*
TÓM TẮT
Thu thập 633 mẫu huyết thanh từ đối tượng tiêm chích ma tuý (TCMT) (n = 492) và gái mại dâm (GMD) (n = 141) tại các Trung tâm Giáo dục và Lao động xã hội, Thành phố Hải Phòng Tách chiết HBV-ADN từ mẫu huyết thanh có kết quả sàng lọc HBsAg dương tính Khuếch đại vùng gen Pol-RT của HBV nhờ phản ứng Nested PCR và sản phẩm sau PCR được giải trình tự gen trực tiếp Phân tích đột biến kháng thuốc của HBV bằng chương trình GENETYX và hướng dẫn của Standford University trên cơ sở kết quả giải trình tự vùng gen Pol-RT
Kết quả: tỷ lệ nhiễm HBV ở cả hai nhóm đối tượng TCMT và GMD tại Hải Phòng là 10,59% Trong đó, nhóm TCMT là 10,57% và nhóm GMD là 10,64% Ba genotýp/subtýp của HBV được phát hiện tại khu vực duyên hải phía Bắc; HBV subtýp B4 có tỷ lệ phân bố phân bố cao nhất (77,61%), tiếp theo là subtýp C1 (19,4%) và subtýp I1 (2,99%) Tỷ lệ đột biến gen kháng thuốc lamivudine trong
67 chủng HBV nghiên cứu là 3,84% và kháng thuốc adefovir và entercavir là 0% Một chủng HBV genotýp B xuất hiện đột biến kiểu YMDD Axít amin tại vị trí aa 204 của vùng gen Pol-RT là methionine được thay thế bằng aa isoleucin và bộ tứ aa YMDD (tyrosine-methionine-aspartate-aspartate) chuyển thành YIDD Đây là đột biến kháng đa thuốc dòng nucleoside analogue, ngoài kháng lamivudine, chủng virut này còn kháng cả 2 thuốc là telbivudine và telnofovir Một chủng HBV genotýp B xuất hiện đột biến tại vị trí aa 80 của vùng gen Pol-RT, aa leucine tại vị trí 80 được thay thế bằng aa isoleucin, chủng này chỉ kháng lamivudine đơn độc và theo cơ chế đột biến L80I Xuất hiện đột biến
tự nhiên kiểu YIDD là yếu tố cảnh báo nguy cơ điều trị thất bại với thuốc lamivudine và tenofovir
* Từ khoá: Viêm gan virut B; Đột biến gen kháng thuốc; Tiêm chích ma túy; Gái mại dâm
Study on drug resistant hepatitis B virus mutant frequency among drug intravenous user and female sex worker groups in
Haiphong, Vietnam
Summary
Plasma samples were collected from 633 subjects among two groups (drug intravenous user [IDU]: 492; female sex worker [FSW]: 141) in the Rehabilitation Center in Haiphong Plasma viral DNA was extracted from samples that were positive for hepatitis B suface antigen (HBsAg) Pol-RT regions of HBV were amplified by PCR with primers ( HB1F(18-39)/HB1R(534-557) and HB2F(414-433)/HB2R(970-989)) PCR products were sequenced directly and analized by GENTYX program, introducted by Standford University
* Đại học Y Hải Phòng
** Đại học Kanazawa, Nhật Bản
Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Hùng Cường (nhcuong@hpmu.edu.vn)
Ngày nhận bài: 21/5/2013; Ngày phản biện đánh giá bài báo:20/6/2013
Ngày bài báo được đăng: 15/7/2013
Results: HBsAg prevalence was 10.57% and 10.64% among IDU and FSW groups in Haiphong.
Three HBV genotypes/subtypes were confirmed, subtypes B4 was predominant (79.87%), followed
by subtypes C1 (18.87%) and subtypes I1 (1,26%) Two subtypes I1 strains were indentified Subtype
Trang 2I1 was identified with very rare prevalence in Vietnam Lamivudine resistant rate was 3.84% (L80I mutation: 1.92%; M204I mutation: 1.92%) and tenofovir resistant rate was 1.92% (M204I mutation) The resistant rate of adefovir and entercavir was 0% M204I mutation (YMDD =>YIDD) was cross-resistant mutation, HBV will cross-resistant with lamivudine, tebivudine and tenofovir The appearance of cross-resistant mutations can expect treatment failure with multi-drugs in future The buidinge of a national program to monitor the appearance HBV drug resistant mutations is very important
* Key words: HBV; Drug resistant mutation; Intravenous drug user; Female sex worker
ĐẶT VẤN ĐỀ
Viêm gan virut B (HBV) là vấn đề sức
khỏe được quan tâm trên toàn thế giới
Khoảng 5% dân số thế giới bị nhiễm HBV,
tương đương với 350 triệu người [8, 9]
Theo kết quả nghiên cứu của chúng tôi
tháng 9 - 2008 trên 1.077 đối tượng ở Hải
Phòng, tỷ lệ nhiễm HBV là 12,2% [1] Đa số
nhiễm HBV mạn tính, một số khá lớn là tình
trạng viêm gan B mạn tính và có nhu cầu
điều trị bệnh Thuốc điều trị HBV hiện nay
gồm: interferon alfa, peginterferon alfa, các
nucleosid [3, 4, 5] Trong đó, các chế phẩm
của interferon có giá thành rất cao và đa số
bệnh nhân không có cơ hội sử dụng Các
thuốc thuộc nhóm nucleosid analogues
gồm: lamivudine, adefovir dipivoxil, entecavir,
tenofovir và emtricitabine… hiện đang sử
dụng chủ yếu và rất có hiệu quả trong điều
trị HBV [2] Tuy nhiên, vấn đề lựa chọn
phác đồ điều trị hợp lý và có sơ sở để đảm
bảo hiệu quả của quá trình điều trị gặp
nhiều khó khăn do thông tin về kháng thuốc
của HBV tại Việt Nam được công bố không
nhiều Vì vậy, hiệu quả điều trị còn thấp và
làm cho nguy cơ kháng thuốc của HBV ngày
càng cao Mục tiêu của nghiên cứu này
nhằm: Nghiên cứu tỷ lệ đột biến gen kháng
thuốc của HBV ở đối tượng TCMT và GMD
tại Hải Phòng
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1 Đối tượng nghiên cứu
Tổng cộng 633 đối tượng, trong đó:
- Nhóm TCMT: 492 đối tượng có TCMT, đang quản lý cai nghiện ở các Trung tâm Giáo dục và Lao động xã hội Hải Phòng
- Nhóm GMD: 141 đối tượng hành nghề mại dâm, đang quản lý tại các Trung tâm
Giáo dục và Lao động xã hội Hải Phòng
2 Phương pháp nghiên cứu
* Kỹ thuật và sinh phẩm sử dụng trong nghiên cứu:
nhiễm HBV bằng kít Determin của ABBOTT (Nhật Bản) nhằm phát hiện kháng nguyên
bề mặt của virut viêm gan B (HBsAg)
- Các mẫu có kết quả HBsAg dương tính
sẽ được tách HBV-ADN, sử dụng kít Smitest EX-R&D (Genome science laboratories, Fukushima, NhËt Bản)
- Chạy PCR khuyếch đại vùng gen Pol-RT của HBV bằng sinh phẩm ampli Tag Gold, Ampplied Biosystems với các cặp primer: HB1F(18-39)/HB1R(534-557) và HB2F(414-433)/HB2R(970-989) (Fuminaka Sugauchi
và CS, 2001)
- Giải trình tự gen trực tiếp bằng kit Big Dye terminator (genetic analyzer, ABI PRISM
3130, Applied biosystems)
* Xử lý số liệu bằng các phần mềm:
- So sánh trình tự nucleotid các trình tự
sử dụng chương trình phần mềm Clustal W (Thompson, 1994) và đoạn trình tự mẫu lấy
Trang 3từ Genbank/EMBL/DDBJ
- Xác định đột biến kháng thuốc của HBV
trên cơ sở giải trình tự gen vùng Pol-RT
của HBV Đối chiếu kết quả đột biến theo
hướng dẫn liệt kê theo bảng 1 [2, 9] và kết
hợp hướng dẫn của Standford university
HBV/HBVseq/development/hbvseq.pl?actio n=showSequenceForm
Bảng 1: Vị trí đột biến kháng lamivudine, telbivudine, adeforvir, telnofovir và entercavir
Vị trí đột
biến
L80V/I;
V173L;
L180M;
M204V/I;
I169T; A181T;
M204S;
T184S;
Q215S
N236T;
N238D;
V84M;
S85A;
V214A;
Q215S
A194T;
L180M;
M204I; V214A;
Q215S
V173L; L180M; M204V;
I169T; T184G; S202I;
M250V
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
1 Tỷ lệ nhiễm HBV
Bảng 2: Tỷ lệ nhiễm HBV nhóm đối tượng TCMT và GMD ở Hải Phòng
Tû lệ nhiễm HBV tại Hải Phòng là 10,59%, không có sự khác biệt về tỷ lệ nhiễm HBV giữa nhóm TCMT và GMD (p > 0,05)
2 Phân bố kiểu genotýp của HBV
Bảng 3: Phân bố kiểu genotýp của HBV dựa trên vùng gen Pre-S1
Nhóm nghiên cứu đã tiến hành giải trình tự vùng gen Pre-S1 của 67 chủng HBV
Trên cơ sở các trình tự được giải mã này, chúng tôi truy cập vào trang Web:
Trang 4http://www.ncbi.gov.nhi.govđể tiến hành lấy các đoạn gen Pre-S1 reference của genotýp
HBV đã công bố và đối chiếu kết quả Kết quả cho thấy genotýp B4 rất phổ biến tại Hải Phòng
và chiếm 77,61%, tiếp theo là genotýp C (19,4%) Có 2 chủng (2,99%) thuộc genotýp I1
được xác định Đây là những chủng it gặp tại Việt Nam [6, 7]
3 Tỷ lệ đột biến kháng thuốc của HBV
Bảng 4: Tỷ lệ đột biến gen kháng thuốc của HBV với lamivudine
Tỷ lệ đột biến gen kháng thuốc lamivudine
trong 67 chủng HBV nghiên cứu là 3,84%
(2/67) Các đột biến kháng lamivudine đều
của genotýp B và không thấy xuất hiện đột
biến kháng lamivudine của HBV genotýp C
trong 67 chủng HBV nghiên cứu Một chủng
HBV genotýp B xuất hiện đột biến kiểu YMDD
tại vị trí aa 204 của vùng gen Pol-RT Axít
amin tại vị trí aa 204 của vùng gen Pol-RT
là methionine được thay thế bằng aa isoleucin
và bộ tứ aa YMDD
(tyrosine-methionine-aspartate-aspartate) chuyển thành YIDD
Với cơ chế đột biến M204I Đây là đột biến
kháng đa thuốc dòng nucleoside analogue, ngoài kháng lamivudine, chủng virut này
có thể kháng cả 2 thuốc là telbivudine và telnofovir Đây là 2 thuốc được sử dụng khá phổ biến trong điều trị trên thế giới, nhưng hiện chưa được sử dụng nhiều tại Việt Nam Một chủng HBV genotýp B xuất hiện đột biến tại vị trí aa 80 của vùng gen Pol-RT,
aa leucine tại vị trí 80 được thay thế bằng
aa isoleucin Như vậy, chủng này sẽ chỉ kháng lamivudine đơn độc và theo cơ chế đột biến L80I
Trang 5Bảng 5: Tỷ lệ đột biến gen kháng thuốc
của HBV với adefovir
VỊ TRÍ
ĐỘT
BIẾN
GENOTÝP
B4 (n = 52)
GENOTÝP C1 (n = 13)
GENOTÝP I1 (n = 2)
Bảng 6: Tỷ lệ đột biến gen kháng thuốc
của HBV với entercavir
VỊ TRÍ
ĐỘT
BIẾN
GENOTÝP
B4 (n = 52)
GENOTÝP C1 (n = 13)
GENOTÝP I1 (n = 2)
Bảng 7: Tỷ lệ đột biến gen kháng thuốc
của HBV với tenofovir
Tỷ lệ đột biến gen kháng thuốc adeforvir
và entercavir trong 67 chủng HBV nghiên cứu là 0% (0/67), tỷ lệ đột biến gen kháng thuốc tenofovir là 1,92% (1/67)
Sự xuất hiện đột biến tự nhiên tại vị trí
aa 204 vùng gen Pol-RT theo kiểu YIDD là một yếu tố quan trọng để cảnh báo nguy cơ bệnh nhân được điều trị trên lâm sàng sẽ thất bại với thuốc lamivudine và thậm chí
cả với telbivudine và tenofovir ngay từ lần điều trị đầu tiên Do vậy, vấn đề thầy thuốc lâm sàng chỉ định làm xét nghiệm phát hiện đột biến kháng thuốc nhằm lựa chọn thuốc điều trị hợp lý và tiên lượng hiệu quả điều trị cho người bệnh cần đặt ra sớm, điều này
sẽ tiết kiệm được thời gian, chi phí điều trị
và đảm bảo phác đồ điều trị cho bệnh nhân tối ưu nhất
KẾT LUẬN
- Tỷ lệ nhiễm HBV ở 633 đối tượng (TCMT = 492 và GMD = 141) ở Hải Phòng
là 10,59% (67/633), trong đó, đối tượng TCMT là 10,67% và GMD 10,64% Genotýp phổ biến trên nhóm đối tượng nghiên cứu này là genotýp B (B4 là 77,61%); tiếp theo
là genotýp C (C1: 19,4%) và genotýp I (I1: 2,99%)
- Tỷ lệ đột biến gen kháng thuốc lamivudine trong 67 chủng HBV được giải trình tự gen
là 3,84% (2/67), tất cả là HBV genotýp B, không thấy xuất hiện đột biến kháng thuốc của các chủng genotýp C Xuất hiện một chủng đột biến tại vị trí aa 80 của vùng Pol-RT (L80I) và một chủng có đột biến kiểu YMDD tại vị trí aa 204 của vùng Pol-RT (M204I) Với đột biến M204I, bộ tứ aa là YMDD đổi thành YIDD và chủng virut này kháng cả lamivudine, telbivudine và telnofovir Tỷ lệ đột biến gen kháng thuốc adeforvir và entercavir trong 67 chủng HBV nghiên cứu là 0%
Trang 6TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Nguyen HC, Ishizaki A, Phan TTC, Hoang
TTH, Nguyen VT, Tanimoto T, Lihana PW,
Matsushita K, Bi X, Pham VT, Ichimura H
Prevalence of HBV infection among different
HIV-risk groups in Hai Phong, Vietnam J Med
Virol 2011, 83, pp.399-404
2 Zoulim F, Locarnini S Hepatitis B virus
resistance to nucleos(t)ide analogues Gastroenterolgy
2009, Nov, 137 (5), pp.1593-608
3 Kobayashi M, Suzuki F Response to
long-term lamivudine treatment in patients infected
with hepatitis B virus genotypes A, B and C
J Med Virol 2006, 78 (10), pp.1276-1283
4 Kumar M, Satapathy S, Monga R A
randomized controlled trial of lamivudine to treat
acute hepatitis B Hepatology 2007, 45 (1),
pp.97-101
5 Wen X, Li X , Xie H Lamivudine for acute
hepatitis B infection Hepatology in AASLD practice, Guideline 2007
6 Tran Thien Tuan Huy, Hiroshi Ushijima et al
Characteristics of core promoter and Precore stop codon mutants of hepatitis B virrus in Vietnam
J of Med Virology 2007, 74, pp.228-236
7 Bui Xuan Truong, Yoshihiko Yano, Yasushi Seo et al Variations in the core
promoter/pre-core region in HBV genotype C in Japanese and Northern Vietnamese patients J of Med Virology
79, pp.1293-1304
8 Saul Krugman, M.D et al Hepatitis B
infection: Strategies for clinicians Infections in medicine New York University Medical Center
2008, pp.5-30
9 Kao JH, Chen DS Global control of hepatitis
B virus infection Lancet Infect Dis 2009, Jul, 2 (7), pp.395-403 Review