Phân tích sự methyl hóa gen SHOX2 ở bệnh ung thư phổi

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Thùy Ngân PHÂN TÍCH SỰ METHYL HÓA GEN SHOX2 Ở BỆNH UNG THƢ PHỔI LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Nguyễn Thùy Ngân PHÂN TÍCH SỰ METHYL HÓA GEN SHOX2 Ở BỆNH UNG THƢ PHỔI Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 8420101.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS VÕ THỊ THƢƠNG LAN Hà Nội – 2019 LỜI CẢM ƠN Em xin dành lời cảm ơn đặc biệt tới PGS TS Võ Thị Thương Lan, người hướng dẫn, dạy cho em không công việc mà cịn ln thấu hiểu, giúp đỡ em sống Cơ người dạy em ý chí, nghị lực, chăm chỉ, cần cù công việc, lạc quan gặp khó khăn, đức tính kiên trì, nhẫn nại, khả tư logic làm thí nghiệm Bên cạnh đó, ln tha thứ, nhẹ nhàng bảo em mắc lỗi sai Điều đặc biệt em học từ u nghề, tính kỷ luật, ln nghiêm túc có tinh thần trách nhiệm dù làm cơng việc Cơ giúp em có thêm niềm tin vào thân, cho em lời khuyên để em vững tin vào định lựa chọn Bên cạnh đó, em xin chân thành cảm ơn ThS Tạ Bích Thuận người ln động viên an ủi em lúc khó khăn Em cảm thấy thật may mắn hướng dẫn hai cô Em xin gửi lời cảm ơn đến Bệnh viện Quân Y 103 (Tp Hà Nội), bệnh viện Quân Y 175 (Tp.HCM), công ty TNHH BCE Việt Nam, Quỹ phát triển khoa học công nghệ Quốc gia – Nafosted tạo điều kiện thuận lợi cho em thực tốt đề tài Em xin chân thành cảm ơn ThS Phạm Anh Thùy Dương, NCS Ngô Thị Hà, ThS Nguyễn Thu Trang dạy nhiệt tình kỹ thuật, chia sẻ kinh nghiệm cần thiết cho em học tập làm việc Em xin cảm ơn ThS Nguyễn Quang Duy, ThS Bùi Thị Thu Anh, Cử nhân Nguyễn Minh Khôi, em Lê Đức Sơn, em Nguyễn Thị Thanh giúp đỡ em nhiều cơng việc, chia sẻ khó khăn, kỷ niệm vui buồn hai năm học Thạc sĩ phịng thí nghiệm Sinh Y Em xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô giáo Bộ môn Sinh học Tế bào, thầy cô Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên giảng dạy tạo điều kiện thuận lợi cho em học tập nghiên cứu Lời cuối em xin dành lời cảm ơn đặc biệt tới hai bên gia đình, người thân bạn bè ln tạo điều kiện, khuyến khích hỗ trợ em vật chất lẫn tinh thần để em hoàn thành tốt luận văn Em xin chân thành cảm ơn Hà Nội, ngày tháng năm 2019 Học viên BẢNG KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt Tiếng Anh Tiếng Việt 95 % CI : 95 % confidence interval 95 % khoảng tin cậy AUC : Area Under the Curve Diện tích dƣới đƣờng cong bp : Base pair Cặp bazơ ccfDNA : Circulating cell-free DNA DNA tự tuần hoàn CEA : Carcinoembryonic Antigen Kháng nguyên ung thƣ biểu mô phôi Ct : Threshold cycle Chu kỳ ngƣỡng CT : Computed Tomography Chụp cắt lớp vi tính ctDNA : Circulating tumor DNA DNA khối u tuần hoàn máu Cyfra 21-1 : Cytokeratin fragment 19.21 and 19.1 DNA : Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic DNMT : DNA methyltransferase Enzyme DNA methyltransferase dNTPs : Deoxynucleotide triphosphates Deoxynucleotide triphosphates FFPE : Formalin – Fixed, Cố định formalin, Paraffin – Embedded FRET : Fluorescence Resonance Energy Transfer GDP : Gross Domestic Product đúc paraffin Truyền lƣợng cộng hƣởng huỳnh quang Tổng sản phẩm nội địa GLOBOCAN : Global Burden of Cancer Study kp : Kilobase mcfDNA : Cell-free mitochondrial DNA DNA tự có nguồn gốc ty thể MRI : Magnetic resonance imaging Chụp cộng hƣởng từ OD : Optical density Mật độ quang học PCR : Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi polymerase PET/CT : Positron Emission Tomography/ Ghi hình cắt lớp Positron/ Chụp Computed Tomography cắt lớp vi tính ProGRP : Progastrin-releasing peptide Peptide giải phóng progestrin qMSP : Quantitative methylation-specific PCR định lƣợng đặc hiệu methyl PCR Rb : Retinoblastoma U nguyên bào võng mạc RNA : Ribonucleic acid Axit ribonucleic ROC : Receiver Operating Characteristic SHOX2 : Short stature homeobox Tm : Melting temperature Nhiệt độ nóng chảy TNM : Tumor-Node-Metastasis Khối u – Hạch – Di UTPTBN : Small cell lung cancer Ung thƣ phổi tế bào nhỏ UTPKTBN : Non-small cell lung cancer Ung thƣ phổi không tế bào nhỏ WHO : World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 2.1: Đặc điểm mẫu nghiên cứu 23 Bảng 2.2: Plasmid sử dụng nghiên cứu 23 Bảng 2.3: Trình tự cặp mồi nghiên cứu 24 Bảng 2.4: Thành phần điều kiện phản ứng PCR với cặp mồi phát 26 gen đích SHOX2 Bảng 2.5: Thành phần điều kiện phản ứng cắt plasmid 28 Bảng 2.6: Thành phần điều kiện phản ứng PCR đảo tổng hợp 29 plasmid dạng thẳng Bảng 2.7: Tỷ lệ phối trộn plasmid để tạo mẫu chuẩn 30 Bảng 2.8: Thành phần điều kiện tối ƣu phản ứng realtime PCR 31 với cặp mồi Un-SHOX2-F/R Me-SHOX2-F/R Bảng 3.1: Giá trị Ct phần trăm methyl hoá số mẫu 43 Bảng 3.2: Các thông số hiệu chẩn đoán mẫu FFPE mẫu 47 huyết tƣơng Bảng 3.3: Mối liên quan tình trạng methyl hóa SHOX2 với đặc điểm mơ bệnh học bệnh nhân ung thƣ phổi mẫu FFPE 51 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình Hình 1.1: Q trình methyl hóa cytosine hệ gen động vật có vú 11 Hình 1.2: Cấu trúc locus gen SHOX2 ngƣời 13 Hình 1.3: Đƣờng cong khuếch đại kỹ thuật realtime PCR 17 Hình 1.4: Định lƣợng tuyệt đối sử dụng đƣờng chuẩn 19 Hình 2.1: PCR đảo sử dụng cặp mồi đặc hiệu khuếch đại tồn 28 trình tự plasmid Hình 3.1: Kết điện di DNA tổng số tách từ mẫu FFPE 33 Hình 3.2: Kết điện di sản phẩm PCR phát có mặt gen 34 đích SHOX2 mẫu DNA tách từ bệnh phẩm FFPE Hình 3.3: Tín hiệu khuếch đại đoạn gen tham chiếu SHOX2 có mặt 35 mẫu ccfDNA xử lý bisulfite Hình 3.4: Kết PCR khuếch đại đoạn DNA 250 bp (A) 36 đoạn 580 bp (B) từ ccfDNA sau tách chiết Hình 3.5: Kết xử lý plasmid Un-Shox Me-Shox với enzyme 38 giới hạn ScaI Hình 3.6: Kết điện di plasmid dạng thẳng Un-Shox Me-Shox 39 đƣợc tinh sau cắt với enzyme giới hạn ScaI (A) sau thực phản ứng PCR đảo (B) Hình 3.7: Đồ thị đánh giá hiệu khuếch đại gen đích gen tham chiếu 41 Hình 3.8: Đƣờng chuẩn biểu diễn giá trị Ct nồng độ khuôn 42 khác phản ứng khuếch đại gen tham chiếu (A) gen đích (B) Hình 3.9: Đồ thị phân bố tỷ lệ methyl hoá SHOX2 (%) nhóm đối 45 chứng nhóm ung thƣ phổi Hình 3.10: Đồ thị đƣờng cong ROC 45 Hình 3.11: Đồ thị phân bố methyl hóa SHOX2 theo ∆∆Ct nhóm 46 đối chứng nhóm ung thƣ phổi với giá trị cut-off khác Hình 3.12: Kết độ nhạy độ đặc hiệu phân tích methyl hóa SHOX2 giá trị cut-off lựa chọn 47 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Ung thƣ phổi 1.2 DNA tự tuần hoàn dịch thể – ccfDNA (circulating cell-free DNA) 1.3 Methyl hóa gen SHOX2 ung thƣ phổi 10 1.3.1 Methyl hóa DNA 10 1.3.2 Gen SHOX2 12 1.3.3 Mối liên quan methyl hóa gen SHOX2 ung thư phổi 13 1.4 Realtime PCR 16 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Mẫu nghiên cứu 22 2.2 Các plasmid tái tổ hợp 23 2.3 Nguyên liệu, hóa chất 24 2.3.1 Các cặp mồi 24 2.3.2 Hóa chất 25 2.3.3 Trang thiết bị 25 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 25 2.4.1 Tách DNA từ mẫu FFPE 25 2.4.2 Tách ccfDNA từ mẫu huyết tương 25 2.4.3 Phản ứng PCR 26 2.4.4 Xử lý mẫu DNA với bisulfite 27 2.4.5 Tạo mẫu chuẩn cho kỹ thuật định lượng PCR 27 2.4.6 Định lượng PCR (Realtime PCR) 30 2.4.7 Phương pháp phân tích thống kê 31 CHƢƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Tách chiết DNA 33 3.1.1 Tách chiết DNA tổng số từ mẫu FFPE 33 3.1.2 Tách chiết ccfDNA từ mẫu huyết tương 34 3.2 Xử lý bisulfite 37 3.3 Tạo mẫu chuẩn cho phƣơng pháp định lƣợng PCR 37 3.4 Phân tích mức độ methyl hóa gen SHOX2 mẫu FFPE mẫu huyết tƣơng 41 KẾT LUẬN 53 KIẾN NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 C25 C26 C27 C28 C29 C30 C31 C32 C33 C34 C35 C36 C37 C38 C39 C40 C41 C42 C43 C44 C45 C46 C47 C48 C49 C50 C51 PT14/1620A PT14/1369A PT14/1290A PT14/1346A PT14/1409A PT14/1428 PT14/1340 PT14/1386C PT14/1378B PT14/1609A PT14/1357 PT14/1371 PT14/1392A PT14/1264A PT14/1311A PT14/1370A PT14/1437A PT14/1263 PT14/1327 PT14/1446A PT14/1307 PT14/1614A PT14/1243 PT14/1276A PT14/1471 PT14/1619A PT14/1253A Trần Khắc V Huỳnh Thị S Phạm Thị D Nguyễn Văn T Lê Thị N Trần Hoàng M Lê Nhuận Đ Phan Tiến D Dƣơng Minh C Nguyễn Văn Sáu N Trần Phƣơng U Tạ Ngọc Trung T Doãn Xuân T Hồ Đăng K Nguyễn Văn T Ngô Thị B Bùi Văn Đ Nguyễn Huy H Lê U Trần Văn T Nguyễn Duy N Nguyễn Thị Thu N Võ Minh T Trần Văn L Tăng Cảnh H Trần Minh H Nguyễn Văn T 61 38 57 44 42 56 25 28 44 48 33 41 55 49 44 38 53 67 74 42 60 30 33 47 18 28 46 Nam Nữ Nữ Nam Nữ Nam Nam Nam Nam Nam Nữ Nam Nam Nam Nam Nữ Nam Nam Nam Nam Nam Nữ Nam Nam Nam Nam Nam Viêm lao Dãn phế quản bội nhiễm Viêm lao Viêm phổi đông đặc Viêm phổi đông đặc Viêm lao Viêm lao Viêm đông đặc mạn tính Viêm lao Viêm Phổi Bóng khí phế nang bội nhiễm Bóng khí phế nang bội nhiễm Dãn phế quản bội nhiễm Dãn phế quản bội nhiễm Viêm phổi Viêm lao U Nấm Aspergillus U mỡ lành tính Viêm xơ hóa màng phổi Bóng khí phế nang bội nhiễm Viêm màng phổi mạn Kén phế quản bội nhiễm Bóng khí phế nang bội nhiễm Nấm Aspergillus phổi Viêm phổi Viêm lao Xơ hóa màng phổi Bệnh lao Bệnh khí quản, phế quản Bệnh lao Viêm phổi Viêm phổi Bệnh lao Bệnh lao Viêm phổi Bệnh lao Viêm phổi Bệnh khí quản, phế quản Bệnh khí quản, phế quản Bệnh khí quản, phế quản Bệnh khí quản, phế quản Viêm phổi Bệnh lao Các bệnh nấm Aspergillus U lành tính bệnh khác Viêm phổi Bệnh khí quản, phế quản Viêm phổi Bệnh khí quản, phế quản Bệnh khí quản, phế quản Các bệnh nấm Aspergillus Viêm phổi Bệnh lao Viêm phổi PHỤ LỤC Thông tin 20 mẫu huyết tƣơng ung thƣ phổi STT Mã mẫu SBA 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 cf-K1 cf-K2 cf-K3 cf-K4 cf-K5 cf-K6 cf-K7 cf-K8 cf-K9 cf-K10 cf-K11 cf-K12 cf-K13 cf-K14 cf-K15 cf-K16 cf-K17 cf-K18 cf-K19 cf-K20 2208 84 263 410 2020 1990 2215 2194 2222 2250 2435 466 388 2271 3210 451 Họ tên Nguyễn Văn L Nguyễn Vũ T Tạ Quang X Mai Thị N Vũ Thị H Mai Văn T Bùi Minh H Nguyễn Tiến V Đinh Thị Hƣơng G Vũ Văn T Vũ Bá H Phạm Văn Đ Trần Thế D Lƣu Thị H Nguyễn Văn T Hoàng Thị N Ngần Văn T Bùi Văn T Nguyễn Duy T Nguyễn Văn S Tuổi 70 47 59 50 58 49 68 78 68 58 59 75 50 50 45 60 59 53 74 65 Giới tính Nam Nam Nam Nữ Nữ Nam Nam Nam Nữ Nữ Nam Nam Nam Nữ Nam Nữ Nam Nam Nam Nam Typ tế bào Giai đoạn CEA SCC Cyfra 21-1 ProGRP Tuyến Khác Khác Tuyến Tuyến Khác Tuyến Tuyến Khác Khác Khác Vảy Tuyến Khác Tuyến Tuyến Tuyến Tuyến Khác Khác III III III III IV III III III III III III III III III III III IV IV IV IV 5.24 0.8 0.6 4.96 19.92 3.55 2.22 14.96 8.82 3.24 10.84 8.09 707.78 52.1 6.98 2.7 2.88 8.67 213.4 0.68 4.72 1459.72 12.55 2.23 17.1 1.58 114.69 90.26 7.07 2.97 0.7 4.8 2.1 1.6 0.3 1.06 2.2 1.7 1.3 1.6 1.1 4.7 2.1 2.1 2.2 2.04 10.91 3.24 2.18 5.42 2.45 13.94 11.33 44.4 17.32 81.12 37.68 2.1 54.63 60.04 37.8 34.78 70.62 43.14 1.3 34.97 26.31 74.66 918.69 59.7 45.42 PHỤ LỤC Thơng tin 22 mẫu huyết tƣơng ngƣời bình thƣờng STT Mã mẫu 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 cf-C1 cf-C2 cf-C3 cf-C4 cf-C5 cf-C6 cf-C7 cf-C8 cf-C9 cf-C10 cf-C11 cf-C12 cf-C13 cf-C14 cf-C15 cf-C16 cf-C17 cf-C18 cf-C19 cf-C20 cf-C21 cf-C22 Họ tên Phạm Thị B Phạm Thị Kim O Ngô Phạm C Nguyễn Thị H Vu Huy D Nguyễn Văn T Nguyễn Thị V Bùi Đức V Nguyễn Trƣờng G Doãn Tiến T Lƣơng Thị T Cao Thị T Lê Thị T Nguyễn Thị D Đặng Văn N Nguyễn Thanh T Vũ Thị L Đào Quang Đ Đặng Thanh T Hoàng Thị L Nguyễn Thị C Bui Huy Q Tuổi Giới Glucose Ure Creatinin GOT GPT 63 71 65 57 67 56 56 62 53 69 59 63 60 62 50 57 60 55 50 69 70 49 Nữ Nữ Nam Nữ Nam Nam Nữ Nam Nam Nam Nữ Nữ Nữ Nữ Nam Nam Nữ Nam Nam Nữ Nữ Nam 5.69 5.88 6.94 4.58 5.35 5.71 5.88 6.07 5.7 5.69 5.78 5.71 5.67 5.08 5.26 5.59 5.65 4.99 5.31 4.89 6.22 6.75 3.93 4.36 9.83 4.42 66.6 78.6 88.5 62.82 104.2 89.9 54.28 60.58 93 74 63 60.6 70.9 58 85.2 84 66 79.35 99.1 83.7 87 84.6 23.9 24.1 26.4 14.75 16.3 23.1 30.41 18.59 28.1 19.8 16.8 24.3 25.4 28.3 30.2 18.5 35.4 22.13 24.15 19.7 32.9 32.7 18.8 12.63 13 19.7 36.63 16.81 31.2 17.5 13.9 22.7 26 25.3 32.2 21 26.1 24.51 17 15.7 26.8 34.1 4.43 3.15 4.07 6.21 4.8 4.87 5.33 6.25 6.8 6.7 6.02 5.65 5.75 5.67 PHỤ LỤC Trình tự đoạn chèn plasmid Un-Shox Me-Shox Kết đƣờng cong nóng chảy (Melting curve) số mẫu FFPE ung thƣ phổi bệnh phổi lành tính Kết đƣờng cong nóng chảy (Melting curve) phản ứng gen tham chiếu Kết đƣờng cong nóng chảy (Melting curve) phản ứng gen đích SHOX2 PHỤ LỤC Quy trình tách DNA từ mẫu FFPE sử dụng kit QIAamp® DNA FFPE (Qiagen) DNA từ mẫu FFPE ung thƣ phổi đƣợc tách chiết kit QIAamp® DNA FFPE (Qiagen) Quy trình tách chiết gồm bƣớc nhƣ sau: - Loại bỏ paraffin: Thêm ml xylen vào ống eppendorf chứa mô FFPE cắt lát nhƣ chuẩn bị phần nguyên liệu, ủ 56 oC, 15 phút, vortex 20 giây Ly tâm 13000 vòng/phút phút, bỏ dịch Thực bƣớc lần - Loại bỏ xylen: Thêm ml ethanol 100%, vortex 20 giây Ly tâm 13000 vòng/phút phút, bỏ dịch Thực bƣớc lần - Mở nắp, để khô cặn nhiệt độ phịng - Thêm 180 µl Buffer ATL, 20 µl proteinase K 20 mg/ml, trộn - Ủ 56 oC 2,5 giờ, sau ủ 37 oC qua đêm (14 giờ) - Ủ 90 oC - Ly tâm ngắn, để nguội nhiệt độ phịng - Thêm µl RNase 100 mg/ml , ủ 10 phút nhiệt độ phòng - Thêm 200 µl Buffer AL, 200 µl ethanol (96-100%), trộn - Chuyển dịch lên cột, ly tâm 8000 vòng/phút phút, thay ống thu - Thêm 500 µl Buffer AW1, ly tâm 8000 vòng/phút phút, thay ống thu - Thêm 500 µl Buffer AW2, ly tâm 8000 vịng/phút phút, thay ống thu - Ly tâm 13000 vòng/phút phút, thay ống thu ống eppendorf - Thêm 50-100 µl Buffer ATE, ủ nhiệt độ phịng phút, ly tâm 13000 vòng/phút phút, thu phân đoạn đẩy lần (E1) Lặp lại bƣớc lần để thu phân đoạn đẩy lần (E2) Các bƣớc ly tâm đƣợc thực nhiệt độ phòng (15-25 oC) PHỤ LỤC Quy trình tách ccfDNA từ mẫu huyết tƣơng sử dụng kit QIAamp Circulating Nucleic Acid (Qiagen) DNA từ mẫu huyết tƣơng ung thƣ phổi đƣợc tách chiết kit QIAamp Circulating Nucleic Acid (Qiagen) theo hƣớng dẫn nhà sản xuất Quy trình gồm bƣớc nhƣ sau: Tất bƣớc ly tâm đƣợc thực nhiệt độ phịng Các bƣớc hút chân khơng đƣợc thực với lực hút khuyến cáo khoảng 800-900 mbar Tùy vào thể tích huyết tƣơng mà thể tích đệm đƣa vào khác nhau, dựa theo hƣớng dẫn nhà sản xuất - Nâng thể tích mẫu đến thể tích quy định PBS 1X, pH 7.4 - Thêm Proteinase K vào ống phacol 50 ml - Tiếp tục thêm huyết tƣơng vào ống - Thêm Buffer ACL (chứa µg carrier RNA đƣợc chuẩn bị) Đóng nắp mix vortex khoảng 30 giây - Ủ 60 oC, 30 phút - Thêm Buffer ACB vào ống Đóng nắp mix vortex khoảng 15 – 30 giây - Ủ hỗn hợp ống khoảng phút đá - Lắp ống extender 20 ml vào cột  Đƣa toàn dung dịch lên cột  Hút chân không để dịch chảy qua màng  Bỏ ống extender - Thêm 600 µl Buffer ACW1 lên cột, khơng đóng nắp cột  Hút chân khơng - Thêm 750 µl Buffer ACW2 lên cột, khơng đóng nắp cột  Hút chân khơng - Thêm 750 µl Ethanol (96-100 %) lên cột, khơng đóng nắp cột  Hút chân khơng - Đặt cột vào ống collection tube ml  Ly tâm tốc độ tối đa, phút - Đặt cột vào ống collection tube ml mới, mở nắp ủ 56 oC, 10 phút để làm khô màng - Đặt cột vào ống 1.5 ml (đƣợc cung cấp kit) Thêm 50 µl Buffer AVE vào trung tâm màng  Ủ nhiệt độ phòng 10 phút - Ly tâm tốc độ tối đa, phút  ccfDNA sau tách bảo quản – oC đƣợc 24h, -15 đến -30 oC đƣợc > 24h PHỤ LỤC Quy trình xử lý bisulfite mẫu FFPE, mẫu ccfDNA sử dụng kit EpiTect Bisulfite (Qiagen) Trong nghiên cứu này, tiến hành xử lý DNA tổng số ccfDNA với bisulfite sử dụng kit EpiTect Bisulfite (Qiagen) Các bƣớc quy trình nhƣ sau: Biến đối bisulfite - Bổ sung 800 µl nƣớc vào ống Bisulfite Mix Vortex tan hoàn toàn - Chuẩn bị thành phần phản ứng ống PCR 200 µl nhƣ Bảng Bảng: Thành phần phản ứng xử lý bisulfite Mẫu FFPE Thành phần Mẫu huyết tƣơng Thể tích (µl) Thành phần ≤ 20 (500 ng) DNA Thể tích (µl) DNA 40 Bisulfite Mix 85 Bisulfite Mix 85 DNA Protect Buffer 35 DNA Protect Buffer 15 Tổng 140 Tổng 140 - Trộn thành phần, ly tâm ngắn - Cài đặt chu trình nhiệt: 95o 5’ 60o 25’ (95o 5’ 60o 85’)x2 60o 90’ 20o∞ Tinh DNA sau biến đổi bisulfite Tất bƣớc ly tâm thực 12000 vòng/phút, phút, nhiệt độ phòng (15 – 25 oC) Quy trình tinh gồm bƣớc: - Ly tâm ngắn mẫu sau xử lý chuyển vào ống eppendorf 1.5 ml mới, - Thêm Buffer BL (với mẫu ccfDNA bổ sung thêm carrier vào buffer BL đến nồng độ cuối 10 µg/ml) Vortex cho - Với mẫu ccfDNA: Thêm 250 µl ethanol 100% Mix vortex ~15s Ly tâm ngắn - Chuyển dịch lên cột, ly tâm, bỏ dịch - Thêm 500 µl Buffer BW, ly tâm, bỏ dịch - Thêm 500 µl Buffer BD, ủ 15 phút nhiệt độ phòng, ly tâm, bỏ dịch - Thêm 500 µl Buffer BW, ly tâm, bỏ dịch Lặp lại bƣớc lần - Chuyển cột sang ống thu mới, ly tâm, bỏ dịch - Để khô màng phút 56 oC - Thêm 25 µl Buffer EB, ủ phút nhiệt độ phòng, ly tâm thu phân đoạn đẩy lần - Thêm 20 µl Buffer EB, ủ phút nhiệt độ phòng, ly tâm thu phân đoạn đẩy lần Mẫu sau xử lý đƣợc chia nhỏ bảo quản -20 oC PHỤ LỤC Quy trình tinh plasmid dạng thẳng sử dụng kit PureLink® Quick Gel Extraction and PCR Purification Combo Kit- Invitrogen Sản phẩm PCR mở vịng plasmid đƣợc điện di tồn gel agarose 2% Quy trình tinh sản phẩm PCR từ gel agarose kit gồm bƣớc nhƣ sau: - Cắt băng DNA từ gel agarose đƣa vào ống eppendorf 1,5 ml cân khối lƣợng miếng gel (chú ý khối lƣợng gel ≤ 0.4 g) - Thêm 3V Gel Solubilization Gel (L3) tƣơng ứng với khối lƣợng miếng gel Thêm 150 µl isopropanol cho 100 mg gel Vortex - Đặt ống vào bể ổn nhiệt 50oC khoảng 15 phút, sau phút invert vài lần cho gel tàn hoàn toàn - Sau gel tan hoàn toàn, ủ ống thêm phút - Thêm 1V isopropanol tƣơng ứng với thể tích gel Mix kỹ - Đƣa toàn dung dịch lên cột - Ly tâm ống 12000 vòng/phút, phút, RT Bỏ dịch - Thêm 500 µl Wash Buffer (W1) Ly tâm 12000 vịng/phút, phút, RT, bỏ dịch - Ly tâm ống 12000 vòng/phút, phút, RT, bỏ dịch - Ly tâm ống 12000 vòng/phút, phút, RT - Chuyển cột sang ống eppendorf 1.5 ml Thêm 30 µl Elution buffer vào cột ly tâm 13000 vòng/phút phút để thu lấy phần dịch Bảo quản mẫu -20 oC PHỤ LỤC 10 Kết realtime PCR 75 mẫu FFPE ung thƣ phổi 50 mẫu bệnh phổi lành tính Mẫu ung thƣ phổi Mẫu bệnh phổi lành tính Mẫu ΔΔCt (100 % methyl hóa) Methyl hóa (%) Mẫu ΔΔCt (100 % methyl hóa) Methyl hóa (%) K1 12,00 0,02 C1 0,02 12,28 K2 0,83 56,42 C2 7,52 0,54 K3 4,27 18,32 C3 9,07 0,19 K4 5,19 5,19 C4 1,99 25,26 K5 11,84 0,03 C5 12,00 0,03 K6 0,00 100,00 C6 2,85 13,88 K7 6,41 1,17 C7 4,64 4,01 K8 2,98 12,67 C8 8,58 0,26 K9 4,68 3,90 C9 11,85 0,03 K10 6,83 0,88 C10 4,39 4,77 K11 12,26 0,02 C11 11,51 0,03 K12 4,74 3,73 C12 5,27 2,59 K13 3,80 7,19 C13 6,19 1,37 K14 5,00 3,13 C14 6,75 0,93 K15 11,81 0,03 C15 11,99 0,02 K16 8,58 0,26 C16 12,03 0,02 K17 12,13 0,02 C17 11,51 0,03 K18 0,91 53,25 C18 11,51 0,03 K19 5,85 1,73 C19 11,51 0,03 K20 11,93 0,03 C20 11,85 0,03 K21 7,42 0,58 C21 11,82 0,03 K22 11,84 0,03 C22 11,97 0,02 K23 7,14 0,71 C23 12,00 0,03 K24 12,00 0,03 C24 11,85 0,03 K25 12,00 0,03 C25 6,38 1,20 K26 3,42 9,32 C26 6,29 1,28 K27 2,19 21,97 C27 12,00 0,03 K28 0,15 90,42 C28 12,03 0,02 K29 4,15 5,64 C29 11,93 0,03 K30 5,20 2,71 C30 12,05 0,02 K31 1,25 41,93 C31 12,00 0,02 K32 7,18 0,69 C32 5,67 1,96 K33 3,38 9,59 C33 12,00 0,02 K34 11,91 0,03 C34 12,00 0,03 K35 11,91 0,03 C35 12,00 0,03 K36 1,84 27,90 C36 12,00 0,03 K37 4,58 4,18 C37 12,09 0,02 K38 2,01 24,87 C38 7,22 0,67 K39 1,66 31,65 C39 6,74 0,93 K40 0,33 79,74 C40 6,15 1,41 K41 4,53 4,32 C41 6,91 0,83 K42 0,38 76,76 C42 12,00 0,03 K43 1,29 40,80 C43 11,77 0,03 K44 8,34 0,31 C44 12,24 0,02 K45 11,51 0,03 C45 12,09 0,02 K46 3,48 8,99 C46 6,56 1,06 K47 2,68 15,58 C47 11,93 0,03 K48 11,51 0,03 C48 11,91 0,03 K49 0,74 59,95 C49 11,91 0,03 K50 1,33 39,74 C50 12,00 0,03 K51 5,30 2,53 K52 5,74 1,88 K53 0,00 100,00 K54 2,01 24,87 K55 12,00 0,02 K56 3,54 8,57 K57 1,94 26,08 K58 3,36 9,73 K59 3,07 11,90 K60 0,76 59,21 K61 12,26 0,02 K62 12,00 0,02 K63 1,30 40,74 K64 2,12 23,01 K65 2,05 24,23 K66 2,80 14,36 K67 8,83 0,22 K68 1,38 38,47 K69 2,29 20,43 K70 0,00 100,00 K71 12,07 0,02 K72 11,84 0,03 K73 12,00 0,02 K74 11,84 0,03 K75 3,31 10,09 PHỤ LỤC 11 Kết realtime PCR mẫu 20 ccfDNA ung thƣ phổi 22 mẫu ccfDNA ngƣời bình thƣờng Mẫu ung thƣ phổi Mẫu ngƣời bình thƣờng Mẫu ΔΔCt (100 % methyl hóa) Methyl hóa (%) Mẫu ΔΔCt (100 % methyl hóa) Methyl hóa (%) cf-K1 0,96 51,27 cf-C1 12,00 0,02 cf-K2 6,03 1,53 cf-C2 11,24 0,04 cf-K3 7,24 0,66 cf-C3 12,80 0,01 cf-K4 1,82 28,29 cf-C4 12,29 0,02 cf-K5 5,45 2,28 cf-C5 2,03 24,57 cf-K6 7,04 0,76 cf-C6 12,00 0,02 cf-K7 12,00 0,02 cf-C7 12,00 0,02 cf-K8 7,16 0,7 cf-C8 12,29 0,02 cf-K9 3,16 11,19 cf-C9 8,97 0,2 cf-K10 5,47 2,25 cf-C10 12,00 0,02 cf-K11 2,63 16,18 cf-C11 8,13 0,36 cf-K12 0,27 83,1 cf-C12 12,00 0,02 cf-K13 8,33 0,31 cf-C13 12,29 0,02 cf-K14 4,22 5,36 cf-C14 9,60 0,13 cf-K15 4,80 3,59 cf-C15 11,42 0,04 cf-K16 2,76 14,79 cf-C16 12,00 0,03 cf-K17 5,76 1,85 cf-C17 12,00 0,03 cf-K18 0,00 100 cf-C18 12,00 0,03 cf-K19 0,96 51,56 cf-C19 12,00 0,03 cf-K20 1,48 35,87 cf-C20 9,09 0,18 cf-C21 12,00 0,03 cf-C22 2,79 14,45 PHỤ LỤC 12 Mối liên quan tình trạng methyl hóa SHOX2 với đặc điểm lâm sàng bệnh nhân ung thƣ phổi mẫu huyết tƣơng Bảng: Mối liên quan tình trạng methyl hóa SHOX2 với đặc điểm lâm sàng bệnh nhân ung thƣ phổi mẫu huyết tƣơng Me +/Me -: methyl hóa dƣơng tính/ âm tính, đƣợc định với giá trị cutoff 14,62 % methyl Giá trị p có ý nghĩa (< 0.05) đƣợc in đậm SHOX2 Đặc điểm lâm sàng Me + Me - ≤ 50 (n=6) > 50 (n=14) 7 Nam (n=14) Nữ (n=6) UTPKTBN (n=11) Khác (n=9) III (n=15) 10 IV (n=5) ≤ ng/ml (n=7) > ng/ml (n=9) ≤ ng/ml (n=12) > ng/ml (n=7) ≤ 3.3 ng/ml (n=6) 3 > 3.3 ng/ml (n=13) ≤ 100 pg/ml (n=17) 12 > 100 pg/ml (n=2) Giá trị p (Fisher’s exact test) Tuổi 0,3246 Giới tính > 0,9999 Phân nhóm mơ bệnh học 0,6699 Giai đoạn (UICC) > 0,9999 CEA > 0,9999 SCC-Ag 0,3261 CYFRA 21-1 > 0,9999 ProGRP 0,1228 ... 1.3 Methyl hóa gen SHOX2 ung thƣ phổi 10 1.3.1 Methyl hóa DNA 10 1.3.2 Gen SHOX2 12 1.3.3 Mối liên quan methyl hóa gen SHOX2 ung thư phổi 13 1.4 Realtime... này, thực đề tài ? ?Phân tích methyl hóa gen SHOX2 bệnh ung thƣ phổi? ?? với mục tiêu phát định lƣợng mức độ methyl hóa gen SHOX2 bệnh ung thƣ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Ung thƣ phổi Theo thống... promoter số gen bệnh ung thƣ phổi giúp phát triển phƣơng pháp điều trị cá thể dựa biến đổi methyl hóa Điển hình methyl hóa q mức gen SHOX2, RASSF1A,… bệnh nhân ung thƣ phổi đƣợc quan tâm nhƣ thị phân