Ứng dụng kỹ thuật phân tử lai huỳnh quang FISH nhằm xác định nhanh một số loại tảo độc hại biển việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Lưu Xuân Hòa ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TỬ LAI HUỲNH QUANG (FISH) NHẰM XÁC ĐỊNH NHANH MỘT SỐ LOÀI TẢO ĐỘC HẠI BIỂN VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2011 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Lưu Xuân Hòa ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TỬ LAI HUỲNH QUANG (FISH) NHẰM XÁC ĐỊNH NHANH MỘT SỐ LOÀI TẢO ĐỘC HẠI BIỂN VIỆT NAM Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60 42 70 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS ĐINH ĐOÀN LONG Hà Nội – Năm 2011 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG I TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 Khái quát kỹ thuật lai huỳnh quang chỗ (FISH) 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu, ứng dụng kỹ thuật FISH 1.1.2 Trình tự đích đầu dị phép lai huỳnh quang chỗ 1.1.3 Các loại tín hiệu đánh dấu huỳnh quang 1.1.4 Tình hình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật FISH vi tảo biển độc hại 13 1.2 Tình hình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật FISH Việt Nam 17 1.3 Các bước quy trình lai huỳnh quang chỗ - FISH 18 1.4 Đặc điểm sinh thái số loài vi tảo biển độc hại nghiên cứu 19 CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Địa điểm thu mẫu đối tượng nghiên cứu 21 2.2 Phương pháp thu lưu giữ mẫu 21 2.3 Phương pháp phân loại hình thái 23 2.4 Phương pháp kiểm tra phân loại ADN thiết kế đầu dò 23 2.4.1 Phương pháp chuẩn bị ADN khuôn 23 2.4.2 Phương pháp Singel cell PCR 23 2.4.3 Phương pháp kiểm tra phân loại ADN 24 2.4.4 Phương pháp thiết kế đầu dò đặc hiệu 25 2.5 Phương pháp lai huỳnh quang chỗ 25 CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Kết phân lập phân loại chủng vi tảo độc hại hình thái 27 3.1.1 Loài Alexandrium affine 27 3.1.2 Loài A pseudogonyaulax 28 3.2 Ảnh hưởng độ mặn tới nuôi sinh khối vi tảo tạo nguyên liệu 29 3.3 Kết giải trình tự phân loại ADN mẫu nghiên cứu 31 3.4 Thiết kế đầu dò lai huỳnh quang chỗ 35 3.5 Tối ưu nhiệt độ lai thử nghiệm đầu dò 37 KẾT LUẬN 43 KIẾN NGHỊ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 PHỤ LỤC 54 iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TT Chữ viết tắt Nội dung tiếng Anh Nội dung tiếng Việt ADN Deoxyribonucleic acid Axít deoxyribonucleic ARN Ribonucleic acid Axít ribonucleic Bp Base pair Cặp bazơ FISH Fluorescent in situ hybridization Phép lai huỳnh quang chỗ FITC Fluorescein isothiocyanate Chất phát tín hiệu huỳnh quang ISH In situ hybridization Phép lai chỗ ITS Internal transcribed spacer Vùng đệm phiên mã LSU Large subunit Tiểu phần lớn PCR Polymerase chain reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp 10 PSP Paralytic shellfish poisoning Chất độc gây liệt rADN Ribosomal deoxyribonucleic Trình tự ADN mã hóa acid ribosome 11 12 rARN Ribosomal ribonucleic acid ARN ribosome 13 SSU Small subunit Tiểu phần nhỏ iv DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1: Một số chất huỳnh quang dùng phổ biến kỹ 10 thuật FISH Bảng 1.2: Trình tự đầu dị cho số loài Alexandrium 16 Bảng 3.1: Một số điều kiện thích hợp cho nhân ni sinh khối tảo A 31 affine A pseudogonyaulax phịng thí nghiệm v DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Các cách gắn nhãn tín hiệu vào đầu dị 12 Hình 1.2 Các bước kỹ thuật lai huỳnh quang chỗ FISH 19 Hình 2.1 Sơ đồ phản ứng PCR nhân vùng D1-D2 rADN 23 Hình 3.1 Một số đặc điểm hình thái A affine 27 Hình 3.2 Một số đặc điểm hình thái A pseudogonyaulax 28 Hình 3.3 Ảnh hưởng độ mặn tới sinh trưởng tảo A affine 30 Hình 3.4 Ảnh hưởng độ mặn tới sinh trưởng tảo A 30 pseudogonyaulax Hình 3.5 Kết điện di sản phẩm PCR lần 32 Hình 3.6 Cây phát sinh chủng loại số lồi thuộc chi Alexandrium 34 Hình 3.7 So sánh khác biệt trình tự nucleotit A affine với lồi 36 Alexandrium Hình 3.8 So sánh khác biệt trình tự nucleotit A pseudogonyaulax 37 với lồi Alexandrium Hình 3.9 Tế bào A affine ánh sáng thường (trái) phát huỳnh 38 quang ánh sáng kích thích (phải) với điều kiện lai 43°C Hình 3.10 Tế bào A pseudogonyaulax ánh sáng thường (trái) 38 phát huỳnh quang ánh sáng kích thích (phải) với điều kiện lai 43°C Hình 3.11 Lai đầu dò A affine với mẫu tự nhiên 40 Hình 3.12 Lai đầu dị A pseudogonyaulax với mẫu tự nhiên 40 vi MỞ ĐẦU Trong nghiên cứu phân loại sinh vật phù du biển nói chung vi tảo biển độc hại nói riêng, nhiều nhóm lồi sinh vật khó hồn tồn khơng thể phân loại đến lồi phương pháp so sánh hình thái Sự giống nhiều đặc điểm hình thái bên ngồi khó nhận biết đặc điểm khác chúng dễ dẫn đến nhầm lẫn nghiên cứu phân loại Cùng với số lượng loài lớn có nhiều đặc điểm hình thái giống nhau, cơng tác nghiên cứu phân loại vi tảo biển nhiều trường hợp gặp nhiều khó khăn, tốn thời gian Những điều gây cản trở công tác nghiên cứu hệ sinh thái biển, đánh giá quản lý nguồn lợi sinh vật biển nói chung nghiên cứu chun sâu nhóm lồi nói riêng Kế thừa đặc tính ưu việt kỹ thuật di lai axit nucleic tảng kỹ thuật lai chỗ (in situ hybridization - ISH), kỹ thuật lai huỳnh quang chỗ (fluorescence in situ hydridization - FISH) phát triển Kể từ đời, trở thành cơng cụ mạnh nhiều nghiên cứu sinh học, không lĩnh vực sinh học phân tử tế bào, mà nghiên cứu sinh thái học, môi trường, chẩn đốn nghiên cứu phát sinh lồi Kỹ thuật FISH đời khắc phục nhiều trở ngại nghiên cứu phân loại sinh vật Các trở ngại, vấn đề khó khăn phân loại hình thái, nhược điểm thời gian phân tích kéo dài, u cầu địi hỏi lượng mẫu lớn hay yêu cầu môi trường nuôi cấy đặc chủng để sàng lọc lồi… khắc phục kỹ thuật FISH Bên cạnh đó, kỹ thuật này, nhà nghiên cứu không phân tích định tính mà cịn định lượng xác số lượng tế bào sinh vật, không gian phân bố hay mối tương quan với môi trường vi sinh vật Kỹ thuật FISH đặc biệt hữu ích nghiên cứu phân loại sinh vật phù du mơi trường biển nói chung lồi tảo độc hại nói riêng Nhằm bước ứng dụng kỹ thuật FISH để giải khó khăn phân loại lồi vi tảo độc hại biển, chúng tơi tiến hành đề tài “Ứng dụng kỹ thuật phân tử lai huỳnh quang (FISH) nhằm xác định nhanh số loài tảo độc hại biển Việt Nam” Kết mong đợi đề tài giúp cho việc nghiên cứu đánh giá, quan trắc biến động loài vi tảo độc hại, cảnh báo tượng ô nhiễm môi trường biển (như thủy triều đỏ) trở nên thuận tiện, nhanh chóng hiệu CHƯƠNG TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 1.1 Khái quát kỹ thuật lai huỳnh quang chỗ (FISH) 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu, ứng dụng kỹ thuật FISH Kỹ thuật FISH đời vào năm 1980 Tuy nhiên, trước đó, nghiên cứu tế bào, nhà nghiên cứu thường sử dụng phương pháp nhuộm mơ đơn giản Trong đó, chất màu nhuộm tự nhiên tổng hợp sử dụng để nhuộm cấu trúc chất tích lũy tế bào Nhưng, nhược điểm lớn chất thường khơng đặc hiệu chúng có lực với đặc tính chung phần tử protein, axit nucleic, lipit, cacbonhydrate Chính điều cản trở cho nghiên cứu chuyên sâu Sau đó, thuốc nhuộm đặc hiệu thành phần tế bào hay phức hợp phân tử lớn hemosiderin, amyloid, elastin tìm thấy, phát triển áp dụng việc nhuộm đặc hiệu số thành phần cấu trúc cấp độ phân tử tế bào Dù có nhiều cải thiện tính đặc hiệu, chất nhuộm không áp dụng phổ biến cho tất đại phân tử sinh học quan tâm Khả phát giống khác đại phân tử đặc biệt ban đầu dựa phản ứng kháng nguyên kháng thể Vào năm 1940, việc liên kết kháng thể với fluorochome không làm đặc hiệu liên kết thụ thể chúng phát Trên sở này, kỹ thuật sử dụng tín hiệu huỳnh quang phụ thuộc kháng thể nhằm phát phân tử axit nucleic lai Rudkin Stollar phát triển năm 1977 [58] Tuy vậy, trước đó, kỹ thuật lai chỗ ISH (in situ hybridization), tiền thân kỹ thuật FISH, đời nhóm nhà khoa học Pardue, Gall John [54] Trong phương pháp này, thử nghiệm tiến hành với việc nhận biết trình tự ADN đích có nỗn bào chủng vi khuẩn Xenopus đoạn đầu dị có chất ADN ARN-28S đánh dấu đồng vị phóng xạ Sau chúng ghi nhận kỹ thuật phóng xạ tự ghi Kỹ thuật ISH giúp nhà khoa học đưa đoạn ngắn ADN xâm nhập vào tế bào mà không làm chết, làm thay đổi hình thái tế bào hay tính tồn vẹn phận bên tế bào Trên sở đó, số cải tiến kỹ thuật tiếp nối việc ứng dụng chất thị (reporter) dựa sở enzym [33] hay sử dụng hệ thống đầu dị vàng quan sát kính hiển vi điện tử [55] Sau đời, ISH không ngừng cải tiến nhằm nghiên cứu tiến hóa nhiễm sắc thể, phân tích nhiễm sắc thể khối u, tế bào ung thư bạch cầu nghiên cứu di truyền học tế bào loài Tuy nhiên, số nhược điểm dễ nhận thấy phương pháp ISH bộc lộ Đầu tiên, nhiều vật liệu phóng xạ tự nhiên sử dụng cho đầu dò bền Do đồng vị phân rã theo thời gian nên hoạt động đầu dò dễ bị thay đổi Thứ hai, thơng thường độ nhạy phóng xạ tự ghi cao mức độ phân giải lại bị hạn chế Thứ ba, để tạo tín hiệu đo film chụp X quang mẫu cần phải có thời gian phơi nhiễm dài Điều làm chậm tiến trình thí nghiệm, phân tích kết quả, gia tăng nguy phơi nhiễm với người sử dụng Ngoài ra, kỹ thuật địi hỏi sử dụng ngun liệu đồng vị phóng xạ nên đầu dị phóng xạ có giá thành cao; mặt khác địi hỏi chúng phải vận chuyển, thao tác, lưu trữ loại bỏ theo quy trình nghiêm ngặt, phức tạp Vì lý đó, dù có nhiều ưu điểm trội hạn chế yêu cầu nhà nghiên cứu cần phải tìm biện pháp hiệu Có lẽ mà kỹ thuật ISH (với đầu dò mang đồng vị phóng xạ) sau nhanh chóng thay kỹ thuật có nhiều ưu điểm mang tên kỹ thuật lai chỗ sử dụng đầu dị axit nucleic có gắn tín hiệu huỳnh quang (Fluorescence in situ hybridization - FISH) Với kỹ thuật FISH, trở ngại thời gian thí nghiệm, độ phân giải tính an tồn giải triệt để, mở đường cho phát đồng thời nhiều mục tiêu, phân tích định lượng cho hình ảnh tế bào sống động Những nghiên cứu thử nghiệm ứng dụng tín hiệu huỳnh quang phương pháp lai chỗ năm 1980 Trong nghiên cứu, nhà khoa học tiến hành gắn phân tử ARN trực tiếp với tín hiệu huỳnh quang đầu 3’ thử nghiệm dùng đầu dị cho trình tự ADN đặc hiệu Kết cho thấy so với đầu dị phóng xạ, đầu dị huỳnh quang sử dụng an tồn hơn, gây hại mơi trường sức khỏe người, đồng thời kết thu xác [18] Ở nghiên cứu khác, đầu dị gắn biotin tín hiệu streptavidin kết hợp huỳnh quang dùng cho việc phát trình tự ADN đích đặc trưng nhiễm sắc thể [46] trình tự mARN [60] Năm 1989, DeLong tiến hành thử nghiệm sử dụng đầu dò oligonucleotit (17 - 34 nucleotit) đánh dấu huỳnh quang để dị tìm vi khuẩn E.coli dựa vào trình tự đích đoạn ARN 16s [24] Nhiều nghiên cứu rằng, việc sử dụng nhiều đầu dò khác cho phép xác định loại tế bào khác nhóm chí với việc phân tích cường độ huỳnh quang cho thấy giai đoạn tốc độ phát triển tế bào vi sinh vật [19, 24] Với khả ứng dụng rộng rãi kỹ thuật FISH, ngày nhiều nghiên cứu tiến hành lĩnh vực khoa học Sự phát triển ngày cao nhiều kỹ thuật phân tích cho thấy số lượng lồi có tự nhiên, nhóm vi khuẩn, có số vượt xa so với số lượng loài phát mơ tả trước Do đó, đa dạng thành phần lồi vi sinh vật thời gian trước bị đánh giá thấp Các phương pháp cổ điển trước khơng thể mơ tả xác đầy đủ nhiều loài vi sinh vật Rất nhiều loài sau phát phương pháp đại xác hơn, phương pháp FISH FISH có khả đưa hình ảnh chi tiết môi trường vi sinh mà không cần phải qua bước làm hay khuếch đại Chính mà sử dụng rộng rãi lĩnh vực nghiên cứu khác môi trường Phương pháp ứng dụng nhiều nghiên cứu đa dạng sinh học quần thể vi sinh vật nhiều điều kiện địa lý khác tự nhiên, Llobet (1998) sử dụng kỹ thuật lai huỳnh quang chỗ công cụ để nghiên cứu hệ vi sinh vật có trầm tích biển Kết cho thấy, gần 45% số tế bào vi khuẩn có thuộc nhóm ngành biết với nhóm Cytophaga-Flavobacterium có hầu hết lớp trầm tích [45] Hay nghiên cứu phân bố vi khuẩn kỹ thuật FISH đại dương [31], Chu Văn Thuộc (2002), “Nghiên cứu thành phần loài, phân bố thăm dị khả gây hại số lồi tảo độc hại (harmful algae) thuộc ngành tảo giáp (Dinophyta) vùng cửa sông, ven biển miền Bắc Việt Nam”, Luận án tiến sĩ ngành sinh học, Viện nghiên cứu hải sản Tiếng Anh Abé, T H (1967a), “The armoured Dinoflagellata: II Prorocentridae and Dinophysidae (A)”, Publ Seto Mar Biol., 14(5), pp 369 - 389 Abé, T H (1967b), “The armoured Dinoflagellata: II Prorocentridae and Dinophysidae (B), Dinophysis and its allied genera”, Publ Seto Mar Biol., 15(1), pp 37 - 78 10 Adachi M., Sako Y., Ishida Y (1996), “Analysis of Alexandrium (Dinophyceae) species using sequences of the 5,8S ribosomal DNA and internal transcribed spacer regions” J Phycol, 32, pp 424–432 11 Alfreider A., Pernthaler J., Amann R., Sattler B., Glöckner F O., Wille A., and Psenner R (1996), “Community analysis of the bacterial assemblages in the winter cover and pelagic layers of a high mountain lake by in situ hybridization”, Appl Environ Microbiol, 62, pp: 2138 - 2144 12 Amann R., Fuchs B M., Beherens S (2001), “The identification of microorganisms by fluorescence in situ hybridization”, Curr Opin Biotechnol., 12, pp 231 – 236 13 Andersen, G (2005), “Traditional Microalgae Isolation Techniques, Algal cuturing techniques”, Phycologycal society of America, 578p 14 Anderson, P (1996), “Design and implementation of some harmful agal monitoring system”, IOC Technical Series, 44, UNESCO 46 15 Anderson, D.M (1995), “Identification of harmful algal species using molecular probes, an emerging technology”, Harmful Marine Algal Blooms, Lavoiser Science Publishers, pp 3–13 16 Balech, I (1995), “The genus Alexandrium Halim (Dinoflagellata)”, Trans Am Microscop Soc., 113, pp 216 - 220 17 Baoyu Z., Guofu C., Guangce W., Douding L (2010), “Identification of two Skeletonema costatum-like diatoms by fluorescence in situ hybridization” Chinese Journal of Oceanology and Limnology, 28(2), pp 310 - 314 18 Benedetta B., Danilo E., Monica G., Erasmo N (2006), “Application of FISH technology for microbiological analysis: current state and prospects”, Appl Microbiol Biotechnol., 73, pp 485 – 494 19 Bouvier T., Del G (2003), “Factors influencing the detection of bacterial cells using fluorescence in situ hybridization (FISH)”, FEMS Microbiol Ecol., 44, pp – 15 20 Cho E S., Hur H J., Byun H S., Lee S G., Rhodes L L., Jeong C S and Park J G (2002), “Monthly monitoring of domoic acid producer Pseudonitzschia multiseries (Hasle) Hasle using species-specific DNA probes and WGA lectins and abundance of Pseudo-nitzschia species (Bacillariophyceae) from Chinhae Bay”, Korea Bot Mar., 45, pp 364 - 372 21 Choi, B K (1994), “Diversity of cultivable and uncultivable oral spirochetes from a patient with severe destructive periodontitis” Infect Immun., 62, pp 1889 – 1895 22 Choong J K., Yoshihiko S (2005), “Molecular identification of toxic Alexandrium tamiyavanichii (Dinophyceae) using two DNA probes”, Harmful Algae, 4, pp 984 - 991 47 23 Deere, D (1998), “Evaluation of fluorochromes for flow cytometric detection of Cryptosporidium parvum oocysts labelled by fluorescence in situ hybridization”, Lett Appl Microbiol., 27, pp 352 – 356 24 DeLong, E F (1989), “Phylogenetic stains: ribosomal RNA-based probes for the identification of single microbial cells”, Science, 243, pp 1360 – 1363 25 DeLong E F., Taylor L T., Marsh T L and Preston C M (1999), “Visualization and enumeration of mMarine planktonic archaea and bacteria by using polyribonucleotide probes and fluorescent in situ hybridization”, Applied and Environmental Microbiology, 65, pp 5554 - 5563 26 Felske, A (1998), “In situ detection of an uncultured predominant Bacillus in dutch grassland soils”, Appl Environ Microbiol., 64, pp 4588 – 4590 27 Fuchs B M., Syutsubo K., Ludwig W., Amann R (2000), “In situ accessibility of Escherichia coli 23S rRNA to fluorescently labeled oligonucleotide probes”, Appl Environ Microbiol., 67, pp 961 – 968 28 Gersdorf H (1993a), “Identification of bacteroides forsythus in subgingival plaque from patients with advanced periodontitis”, J Clin Microbiol., 31, pp 941 – 946 29 Gersdorf, H (1993b), “Fluorescence in situ hybridization for direct visualization of Gram-negative an aerobes in subgingival plaque samples”, FEMS Immunol Med Microbiol., 6, pp 109 – 114 30 Glockner, F O (1996), “An in situ hybridization protocol for detection and identification of planctonic bacteria”, Syst Appl Microbiol., 19, pp 403 – 406 31 Glöckner F O., Fuchs B M and Amann R (1999), “Bacterioplankton compositions of lakes and oceans: a first comparison based on fluorescence in situ hybridization”, Appl Environ Microbiol., 65, pp 3721 - 3726 48 32 Hallegraeff G M., Anderson D M., Cembella A D., Enevoldsen H O (1995), “Manual on harmful marine microalgae, IOC Manual and Guides”, UNESCO, 33, 794p 33 Hogardt M., (2000), “Specific and rapid detection by fluorescent in situ hybridization of bacteria in clinical samples obtained from cystic fibrosis patients”, J Clin Microbiol., 38, pp 818 – 825 34 Hogardt M., (2000), “Specific and rapid detection by fluorescent in situ hybridization of bacteria in clinical samples obtained from cystic fibrosis patients”, J Clin Microbiol 38, pp 818 – 825 35 Hougaard D M., Hansen H and Larsson L I (1997), “Non-radioactive in situ hybridization for mRNA with emphasis on the use of oligodeoxynucleotide probes”, Histochem Cell Biol., 108, pp 335 - 344 36 Inacio J., Beherens S., Fuchs B M., Fonseca A., Spencer M I., Amann R (2003), “In situ accessibility of Saccharomyces cerevisiae 26S rRNA to Cy3labeled oligonucleotide probes comprising the D1 and D2 domains”, Appl Environ Microbiol., 69, pp 2899 – 2905 37 Jansen, G J (2000), “Rapid identification of bacteria in blood cultures by using fluorescently labeled oligonucleotide probes”, J Clin Microbiol., 38, pp 814 – 817 38 Jeffrey M L and Robert H S (2003), “Fluorescence in situ hybridization: past, present and future”, Journal of Cell Science, 116, pp 2833 – 2838 39 Johannes Z., Wolfgang L., Karl H S (2001), “DNA polynucleotide probes generated from representatives of the genus acinetobacter and their application in fluorescence in situ hybridization of environmental samples”, System Appl Microbiol., 24, pp 238 – 244 40 Kagiyama, N (1993), “A novel fluorescent method for in situ hybridization”, Acta Histochem Cytochem., 26, pp 441 – 445 49 41 Kempf, V A (2000), “Fluorescent in situ hybridization allows rapid identification of microorganisms in blood cultures”, J Clin Microbiol., 38, pp 830 – 838 42 Kenzaka, T (1998), “rRNA targeted fluorescent in situ hybridization analysis of bacterial community structure in river water”, Microbiology, 144, pp 2085 – 2093 43 Kim C J., Kim C H., Sako Y (2005), “Development of molecular identification method for genus Alexandrium (Dinophyceae) using wholecell FISH”, Marine Biotechnology, 7, pp 215 – 222 44 Langendijk P S, Schut F., Jansen G J., Raangs G C., Kamphuis G R., Wilkinson M H F., Welling G W (1995), “Quantitative fluorescence in situ hybridization of Bifidobacterium spp with genus-specific 16S rRNAtargeted probes and its application in faecal samples”, Appl Environ Microbiol., 61, pp 3069 – 3075 45 Larsen J and Nguyen N L (2004), “Potentially toxic microalgae of Vietnamese waters”, Opera Botanica, 140, 216p 46 Llobet B., Rosselló M., and Amann R (1998), “Microbial community composition of wadden sea sediments as revealed by fluorescence in situ hybridization”, Appl Environ Microbiol., 64, pp 2691 - 2696 47 Manuelidis L., Langer P R and Ward D C (1982), “High-resolution mapping of satellite DNA using biotin-labeled DNA probes”, J Cell Biol., 95, pp 619 - 625 48 Michael H., Ralph W., Georg H., Jutta F., Andrea W., Alexander R., Eberhard S., Siegfried J., Christoph C (2003), “COMBO-FISH: specific labeling of nondenatured chromatin targets by computer-selected DNA oligonucleotide probe combinations”, BioTechniques, 35(3), pp 564 – 577 50 49 Miller P E., Scholin C A (2000), “On detection of Pseudo-nitzschia (Bacillariophyceae) species using whole cell hybridization: sample fixation and stability”, J Phycol., 36, pp 238 – 250 50 Miller P E., Scholin C Pseudonitzschia A (1996), (Bacillariophyceae) “Identification of using species-specific cultured LSU rRNAtargeted fluorescent probes”, J Phycol., 32, pp 646 – 655 51 Miller P E., Scholin C A (1998), “Identification and enumeration of cultured and wild Pseudo-nitzschia (Bacillariophyceae) using speciesspecific LSU rRNA-targeted fluorescent probes and filter-based whole cell hybridization”, J Phycol., 34, pp 371 – 382 52 Moter, A (1998), “Molecular epidemiology of oral treponemes associated with periodontal disease”, J Clin Microbiol., 36, pp 1399 – 1403 53 Niels B R., Henrik F., Timothy G F., Finn A., Bo T (1996), “Distribution of bacterial populations in a stratified fjord (Mariager Fjord, Denmark) quantified by in situ hybridization and related to chemical gradients in the water column”, Appl Environ Microbiol., 62, pp 1391 – 1404 54 Pardue, M L (1969), “Molecular hybridization of radioactive DNA to the DNA of cytological preparations”, Proc Natl Acad Sci., 64, pp 600 –604 55 Pernthaler J., Glöckner F O., Schönhuber W., and “Fluorescence in situ hybridization (FISH) Amann R (2001), with rRNA-targeted oligonucleotide probes”, Methods in Microbiology: Marine Microbiology, 30, pp 207 – 210 56 Puvion D., and Puvion E., (1996), “Non-isotopic electron microscope in situ hybridization for studying the functional sub-compartmentalization of the cell nucleus”, Histochem Cell Biol., 106, pp 59 - 78 57 Richmon, A (2004), “Handbook of Microalgal culture: Biotechnology and Applied Phycology”, Blackwell Science, 577p 51 58 Rudkin G T., and Stollar B D (1977), “High resolution detection of DNARNA hybrids in situ by indirect immunofluorescence”, Nature, 265, pp 472473 59 Scholin C., Miller P E., Buck K., Chavez F., Harris P., Haydock P., Howard J (1997), “Detection and quantification of Pseudo-nitzschia australis in cultured and natural populations using LSU rRNA-targeted probes”, Limnol Oceanogr 42(5), pp 1265 –1272 60 Shoko H T., Sako Y (2005), “Rapid detection of natural cells of Alexandrium tamarense and A catenella (Dinophyceae) by fluorescence in situ hybridization”, Harmful Algae, 4, pp 319 – 328 61 Singer R H., and Ward D C (1982), “Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with a biotinated nucleotide analog”, Proc Natl Acad Sci., 79, pp 7331 - 7335 62 Sebatián C R., and Ryan C O’ (2001), “Single-cell sequencing of dinoflagellate (Dinophyceae) nuclear ribosomal genes”, Molecular Ecology Resources, 1(4), pp 329-331 63 Tanabe S H., Sako Y (2006), “Development and application of fluorescence in situ hybridization (FISH) method for simple and rapid identification of the toxic dinoflagellates Alexandrium tamarense and Alexandrium catenella in cultured and natural seawater”, Fishersies science, 72(1), pp 77 - 82 64 Trebesius K., Amann R., Ludwig W., Mühlegger K., and Schleifer K (1994),“ Identification of whole fixed bacterial cells with nonradioactive 23S rRNA-targeted polynucleotide probes”, Appl Environ Microbiol 60, pp 3228 - 3235 65 Wagner M., Schmid S J., Trebesius K., Bubert A., Goebel W., and Schleifer K (1998), “In situ detection of a virulence factor mRNA and 16s rRNA in Listeria monocytogenes”, FEMS Microbiology Letters, 160, pp 159 - 168 52 66 Werner M., Rudolf A., Wolfgang L., Marc V., and Karl H S (1996), “Application of a suite of 16s rRNA-specific oligonucleotide probes designed to investigate bacteria of the phylum cytophaga-flavobacterbacteroides in the natural environment”, Microbiology, 142, pp 1097 – 1106 67 Yamaguchi, N (1996) “Detection of specific bacterial cells with 2-hydroxy3-naphthoic acid-29-phenylanilide phosphate and Fast Red TR in situ hybridization”, Appl Environ Microbiol., 62, pp 275–278 68 Ylmaz L S., Hatice E O., Noguera D R (2005), “Making all parts of the 16S rRNA of Escherichia coli accessible in situ to single DNA oligonucleotides”, Appl Environ Microbiol., 72, pp 733 – 744 69 Zarda, B (1991), “Identification of single bacterial cells using digoxigeninlabelled, rRNA-targeted oligonucleotides”, J Gen Microbiol., 137, pp 2823 – 2830 53 PHỤ LỤC Phụ lục Thành phần dung dịch sử dụng cho phép lai huỳnh quang chỗ Dung dịch PBS Thành phần NaCl (684mM) KCl (14mM) Na2H2PO4.12H2O (405mM) KH2PO4 (7,5mM) pH 7,5 Đệm lai SSC 5X NaCl (83mM) Sodium Citrate (83mM) pH 7,0 54 Phụ lục Kết so sánh trình tự đoạn L3 nhân vùng D1 – D2 mẫu A affine thu từ vùng biển Cát Bà với chủng AFF37 loài Alexandrium affine vùng biển Nhật Bản (Số hiệu Genbank: AB088227): gb|AB088227| Alexandrium affine strain AFF37 large subunit ribosomal RNA gene, partial sequence Length=711 Score = 1201 bits (650), Expect = 0.0 Identities = 650/650 (100%), Gaps = 0/650 (0%) Strand=Plus/Plus Query Sbjct 14 Query 61 Sbjct 74 Query 121 Sbjct 134 Query 181 Sbjct 194 Query 241 Sbjct 254 Query 301 Sbjct 314 Query 361 Sbjct 374 Query 421 Sbjct 434 Query 481 Sbjct 494 Query 541 Sbjct 554 Query 601 Sbjct 614 AAGCATATAAGTAAGTGGTGGAAATTAAACCAAATGGGATTCCTTAAGTAATTGCGAATG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AAGCATATAAGTAAGTGGTGGAAATTAAACCAAATGGGATTCCTTAAGTAATTGCGAATG 60 AACAAGGACATGCTTAGCTTGACAATTGGAGCCTCTGGCTTCGACTTGTATTTTTGAAAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AACAAGGACATGCTTAGCTTGACAATTGGAGCCTCTGGCTTCGACTTGTATTTTTGAAAT 120 GTATTACCAACAGAGGTGCAGGTGTCAGCCTATTGAAAGAAAGCGTCAATGAGGGTGAGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTATTACCAACAGAGGTGCAGGTGTCAGCCTATTGAAAGAAAGCGTCAATGAGGGTGAGA 180 ATCCTGTTTGTCATGTGCAATCCTCTGTGCACGGTGTATGTTTGCTGAGTCACACTCCTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATCCTGTTTGTCATGTGCAATCCTCTGTGCACGGTGTATGTTTGCTGAGTCACACTCCTT 240 GGCATTGGAATGCAAAGTGGGTGGTAAGTTTCATGTAAAGGTAAATATAGGATTGAGACT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GGCATTGGAATGCAAAGTGGGTGGTAAGTTTCATGTAAAGGTAAATATAGGATTGAGACT 300 GATAGCACACAAGTACCATGAGGGAAATATGAAAAGGACTTTGAAAAGAGAATTAAATGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GATAGCACACAAGTACCATGAGGGAAATATGAAAAGGACTTTGAAAAGAGAATTAAATGA 360 GTTTGTATTTGCTGAACAGAAAATAAACAGATTTGATGTTGCTTGGTGAGATTGTGGTGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTTTGTATTTGCTGAACAGAAAATAAACAGATTTGATGTTGCTTGGTGAGATTGTGGTGC 420 TTGCTTGACAATAGGTTTTGATTGTGGGTGTGATGATTCTTGCTTTGCTTGCCAGTTTCT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TTGCTTGACAATAGGTTTTGATTGTGGGTGTGATGATTCTTGCTTTGCTTGCCAGTTTCT 480 ATTTGTACATTTGATTACCCTTGCACATGAATGGTAATTTTCCTGCGGGGTTTGGATTGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATTTGTACATTTGATTACCCTTGCACATGAATGGTAATTTTCCTGCGGGGTTTGGATTGC 540 ATGTGTTTGTGATGATTTGTGTTTTGATACATGTGTCTGGTGCTTTTGTAATTGCTCATT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATGTGTTTGTGATGATTTGTGTTTTGATACATGTGTCTGGTGCTTTTGTAATTGCTCATT 600 TCTTGAAGCTGGGCCTACCCTACTAGAGCTTACAAGCCCTGGCACACAAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TCTTGAAGCTGGGCCTACCCTACTAGAGCTTACAAGCCCTGGCACACAAT 55 650 663 73 133 193 253 313 373 433 493 553 613 Phụ lục Kết so sánh trình tự đoạn L4 nhân vùng D1 – D2 mẫu A pseudogonyaulax thu từ vùng biển Cát Bà với chủng AFF37 loài Alexandrium affine vùng biển Nhật Bản (Số hiệu Genbank: AB565486): dbj|AB565486.1| partial sequence Length=701 Alexandrium pseudogoniaulax gene for large subunit rRNA, Score = 1293 bits (651), Expect = 0.0 Identities = 651/651 (100%), Gaps = 0/651 (0%) Strand=Plus/Plus Query Sbjct Query 61 Sbjct 62 Query 121 Sbjct 122 Query 181 Sbjct 182 Query 241 Sbjct 242 Query 301 Sbjct 302 Query 361 Sbjct 362 Query 421 Sbjct 422 Query 481 Sbjct 482 Query 541 Sbjct 542 Query 601 Sbjct 602 CCCGCTGAATTTAAGCATATAAGTAAGCGGTGGAAAATGAACCAAATGGGATTCCTTTAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CCCGCTGAATTTAAGCATATAAGTAAGCGGTGGAAAATGAACCAAATGGGATTCCTTTAG 60 TAATTGCGAATGAACAAGGATGTGCTCAGCTTGACAAATGGAGTTTTTGAGCTTTGAATT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TAATTGCGAATGAACAAGGATGTGCTCAGCTTGACAAATGGAGTTTTTGAGCTTTGAATT 120 GTAATTTTGCAATGCATCACCAGCGGAGGTACAGTTGCAAGCCTTTTGAAAGACAGCGCC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTAATTTTGCAATGCATCACCAGCGGAGGTACAGTTGCAAGCCTTTTGAAAGACAGCGCC 180 ATTGAGGGTGAAATTCCTTTTTGTCTTCTGCAACCTTTGTGCACGGTATGTATTTGGTGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATTGAGGGTGAAATTCCTTTTTGTCTTCTGCAACCTTTGTGCACGGTATGTATTTGGTGA 240 ATCACATTCCTCGGCATTGGAATGCAAATTGGGTGGTAAATTTCACGCAAGGGAAAATAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATCACATTCCTCGGCATTGGAATGCAAATTGGGTGGTAAATTTCACGCAAGGGAAAATAT 300 ATTATTGAGTCTGATAATGAACAAGTACCATGAGGGAAATATGCAAAGGACTTTGAAAAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ATTATTGAGTCTGATAATGAACAAGTACCATGAGGGAAATATGCAAAGGACTTTGAAAAG 360 AAAATTAAAAGAGCTTGCATTTGCTAAACAGAAAACTAGCAGAAGTGCTTTATCTTGGTA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AAAATTAAAAGAGCTTGCATTTGCTAAACAGAAAACTAGCAGAAGTGCTTTATCTTGGTA 420 AGATTGCTGCGCATGGGTTTACTGTGTAAATTGTATGAGCATTGGTTCTTACTTTGTGTG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGATTGCTGCGCATGGGTTTACTGTGTAAATTGTATGAGCATTGGTTCTTACTTTGTGTG 480 TCAATTCCATTGTCAATTTTAATATCTTTGCTCATGAATTGTGAAATGCTTGCGGGTGTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TCAATTCCATTGTCAATTTTAATATCTTTGCTCATGAATTGTGAAATGCTTGCGGGTGTT 540 AGATTGCATGTGCATTCATTAATTTGGACTTGGTGCAGTGCTTGGCAACAGCTTGCATGT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGATTGCATGTGCATTCATTAATTTGGACTTGGTGCAGTGCTTGGCAACAGCTTGCATGT 600 AGAGTGTGCGTGCAATGTACAATTGCGATTGTCAGCTGTTGCCAACCACTT ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| AGAGTGTGCGTGCAATGTACAATTGCGATTGTCAGCTGTTGCCAACCACTT 56 651 652 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 Phụ lục So sánh trình tự vùng D1- D2 số loài tảo độc thuộc chi Alexandrium với trình tự A affine 57 Phụ lục So sánh trình tự vùng D1- D2 số lồi tảo độc thuộc chi Alexandrium với trình tự A peudogonyaulax 58 Phụ lục Kết thử nghiệm đầu dò A affine nhiệt độ lai khác Tế bào A.afine ánh sáng thường (trái) ánh sáng huỳnh quang (phải) (A, B: 37°C; C, D: 40°C; E, F: 43°C; G, H: 46°C; I, J: 49°C; K, L: 52°C) A B C D E F G H I J K L 59 Phụ lục Kết thử nghiệm đầu dò A pseudonyaulax nhiệt độ lai khác Tế bào A pseudonyaulax ánh sáng thường (trái) ánh sáng huỳnh quang (phải) (A, B: 37°C; C, D: 40°C; E, F: 43°C; G, H: 46°C; I, J: 49°C; K, L: 52°C) A B C D E F G H I J K L 60 ... biển nói chung lồi tảo độc hại nói riêng Nhằm bước ứng dụng kỹ thuật FISH để giải khó khăn phân loại lồi vi tảo độc hại biển, chúng tơi tiến hành đề tài ? ?Ứng dụng kỹ thuật phân tử lai huỳnh quang. .. NHIÊN - Lưu Xuân Hòa ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TỬ LAI HUỲNH QUANG (FISH) NHẰM XÁC ĐỊNH NHANH MỘT SỐ LOÀI TẢO ĐỘC HẠI BIỂN VIỆT NAM Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60 42 70 LUẬN VĂN THẠC... huỳnh quang 1.1.4 Tình hình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật FISH vi tảo biển độc hại 13 1.2 Tình hình nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật FISH Việt Nam 17 1.3 Các bước quy trình lai huỳnh quang