Nghiên cứu trích ly ginsenoside từ củ tam thất bắc bằng phương pháp có hỗ trợ enzyme và thử nghiệm hoạt tính sinh học của cao trích

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA -o0o - NGUYỄN TRẦN XUÂN PHƯƠNG NGHIÊN CỨU TRÍCH LY GINSENOSIDE TỪ CỦ TAM THẤT BẮC BẰNG PHƢƠNG PHÁP CÓ HỖ TRỢ ENZYME VÀ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CAO TRÍCH (Enzyme-assisted extraction of ginsenosides from Panax notoginseng (Burk.) F.H Chen and examination of the extract biological activities) Chuyên ngành: KỸ THUẬT HÓA HỌC Mã số: 60520301 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, THÁNG 01 NĂM 2019 Cơng trình hoàn thành tại: Trƣờng Đại Học Bách Khoa, ĐHQG-HCM Cán hướng dẫn khoa học: TS Hoàng Minh Nam……………………………… TS Nguyễn Hữu Hiếu…………………………… Cán chấm nhận xét 1: TS Huỳnh Ngọc Oanh …………………………… …… Cán chấm nhận xét 2: TS Nguyễn Quốc Thắng………………………………… Luận văn thạc sĩ bảo vệ Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG-HCM Tp HCM, ngày 22 tháng 01 năm 2019 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: GS TS Đống Thị Anh Đào – Chủ tịch TS Huỳnh Ngọc Oanh – Ủy viên phản biện TS Nguyễn Quốc Thắng – Ủy viên phản biện PGS TS Phan Thị Phượng Trang - Ủy viên TS Huỳnh Khánh Duy – Thư kí Xác nhận Chủ tịch Hội đồng đánh giá Luận văn Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau luận văn sửa chữa (nếu có) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƢỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC GS TS ĐỐNG THỊ ANH ĐÀO GS TS PHAN THANH SƠN NAM i ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: NGUYỄN TRẦN XUÂN PHƢƠNG MSHV: 1770453 Ngày, tháng, năm sinh: 12/05/1995 Nơi sinh: Đồng Tháp Chuyên ngành: Kỹ thuật Hóa học Mã số: 60520301 I TÊN ĐỀ TÀI: Tên tiếng Việt: “Nghiên cứu trích ly ginsenoside từ củ tam thất bắc phương pháp có hỗ trợ enzyme thử nghiệm hoạt tính sinh học cao trích” Tên tiếng Anh: “Enzyme-assisted extraction of ginsenosides from Panax notoginseng (Burk.) F.H Chen and examination of the extract biological activities” II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: 2.1 Tổng quan: tam thất bắc loại ginsenoside, tình hình nghiên cứu ngồi nước, ứng dụng cao trích củ tam thất bắc, phương pháp trích ly, phương pháp định lượng ginsenoside, phương pháp thử hoạt tính sinh học cao trích 2.2 Thực nghiệm  Trích ly ginsenoside từ củ tam thất bắc  Khảo sát ảnh hưởng điều kiện trích ly:  Khảo sát yếu tố: pH, nhiệt độ, thời gian thủy phân;  Khảo sát đồng thời ba yếu tố quy hoạch thực nghiệm tâm xoay bậc hai với mơ hình Box-Wilson, xử lý số liệu phần mềm Design Expert 11.0;  Thử nghiệm hoạt tính sinh học cao trích: kháng tiểu đường kháng ung thư 2.3 Kết bàn luận 2.4 Kết luận ii III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 15/07/2018 IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 15/01/2019 V CÁN BỘ HƢỚNG DẪN: TS HOÀNG MINH NAM, TS NGUYỄN HỮU HIẾU Tp HCM, ngày … tháng… năm 2019 CÁN BỘ HƢỚNG DẪN CÁN BỘ HƢỚNG DẪN TS HOÀNG MINH NAM TS NGUYỄN HỮU HIẾU PTN Trọng điểm ĐHQG-HCM – Cơng nghệ Hóa học Dầu khí (CEPP) TS NGUYỄN HỮU HIẾU TRƢỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC GS TS PHAN THANH SƠN NAM iii LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, tác giả xin gửi lời cảm ơn đến gia đình tạo điều kiện thuận lợi, ủng hộ tinh thần hỗ trợ tác giả q trình thực hồn thành luận văn Tác giả xin gửi lời cảm ơn đến Thầy Cơ khoa Kỹ thuật Hóa học, Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG-HCM nhiệt tình giúp đỡ tác giả tạo điều kiện thuận lợi cho tác giả q trình học tập hồn thành luận văn Tác giả xin gửi lời cảm ơn đến TS Hoàng Minh Nam TS Nguyễn Hữu Hiếu tận tình hướng dẫn tác giả hoàn thành luận văn Tác giả xin gửi lời cảm ơn đến tập thể anh chị bạn bè Phịng thí nghiệm Trọng điểm ĐHQG-HCM – Cơng nghệ hóa học Dầu khí (CEPP) tạo điều kiện thuận lợi để tác giả hoàn thành luận văn Cuối cùng, tác giả xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo quý anh chị Cục Thú Y – Trung tâm Kiểm tra Vệ sinh Thú Y Trung Ương II tạo điều kiện thuận lợi hỗ trợ tác giả trình thực luận văn Tác giả Nguyễn Trần Xuân Phƣơng iv TÓM TẮT Trong luận văn này, hai hoạt chất ginsenoside Rb1 Rg3 trích ly từ củ tam thất bắc phương pháp có hỗ trợ viscozyme L Đây phức hợp nhiều cacbohydrase khác cellulase, arabanase, xylanase hemicellulase Khi bổ sung viscozyme L vào q trình trích ly phức hợp enzyme phân cắt thành phần cấu tạo nên thành tế bào pectin, cellulose, hemicellulose,… Do đó, làm phá vỡ cấu trúc thành tế bào – quan bảo vệ bên ngồi tế bào khơng bị nước trì tính tồn vẹn tế bào, làm giải phóng hoạt chất vào dung mơi trích ly Ảnh hưởng yếu tố đến hoạt động enzyme pH, nhiệt độ thời gian thủy phân khảo sát để tìm khoảng biến thiên phù hợp Sau đó, dựa khoảng giá trị tìm được, tiến hành khảo sát ảnh hưởng đồng thời yếu tố quy hoạch thực nghiệm theo phương pháp tâm xoay bậc hai với mơ hình Box – Wilson xử lý số liệu phần mềm Design Expert 11.0 để tìm điều kiện trích ly phù hợp cho hàm lượng ginsenoside Rb1 Rg3 cao trích cao Hàm lượng Rb1 Rg3 cao trích xác định phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao (High-performance Liquid Chromatography – HPLC) Đồng thời, mẫu đối chứng không bổ sung viscozyme L tiến hành để so sánh hàm lượng ginsenoside với mẫu trích ly điều kiện phù hợp tìm Cao trích có hàm lượng Rb1 Rg3 cao ứng với điều kiện phù hợp thử nghiệm hoạt tính sinh học: kháng tiểu đường phương pháp ức chế enzyme α-glucosidase kháng ung thư ba dòng tế bào phổi Lu, gan Hep-G2 vú MCF-7 phương pháp tetrazolium (MTT assay) v ABTRACT In this essay, two ginsenosides Rb1 and Rg3 were extracted from Panax notoginseng (Burk.) F.H Chen by enzyme-assisted method, which was viscozyme L This was a complex of different carbohydrases such as cellulase, arabanase, xylanase and hemicellulase When viscozyme L was added to the extraction process, the complex of these enzymes could break down the cell walls such as pectin, cellulose and hemicellulose Therefore, ginsenosides were dissolved into solvent extraction The effect of three independent variables in terms of pH, temperature and hydrolysis time was investigated to find a range of suitable conditions, which could help viscozyme L to activate well Then, the Box and Wilson design was applied to survey the simultaneous effect of these factors, using Design Expert 11.0 software for the experimental design and regression analysis of the experimental data The target of this research was the highest of concentration ginsenoside Rb1 and Rg3 obtained in the extract The concentration of Rb1 and Rg3 in the extract were determined by high-performance liquid chromatography (HPLC) At the same time, the control sample was extracted similarly in that process, but viscozyme L was not added in the sample The extract with the highest of concentration ginsenoside Rb1 and Rg3 was tested for biological activities concluding antidiabetic using α-glucosidase inhibitor and anticancer on three cell lines such as Human lung carcinoma (Lu), Hepatocellular carcinoma (Hep-G2), and Human breast carcinoma (MCF-7) using the tetrazolium assay (MTT assay) vi LỜI CAM ĐOAN Tác giả xin cam đoan luận văn cơng trình nghiên cứu cá nhân tác giả thực hướng dẫn TS Hoàng Minh Nam TS Nguyễn Hữu Hiếu, Phịng thí nghiệm Trọng điểm ĐHQG-HCM – Cơng nghệ Hóa học Dầu khí (CEPP), Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG-HCM Số liệu, kết nghiên cứu kết luận luận văn hoàn toàn trung thực Tp Hồ Chí Minh, tháng 01 năm 2019 Tác giả Nguyễn Trần Xuân Phƣơng vii MỤC LỤC NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ ii LỜI CẢM ƠN iv TÓM TẮT v ABTRACT vi LỜI CAM ĐOAN vii MỤC LỤC viii DANH MỤC HÌNH x DANH MỤC BẢNG xii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xiii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT (tiếp theo) xiv ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tam thất bắc loại ginsenoside 1.1.1 Danh pháp phân loại khoa học 1.1.2 Mô tả thực vật 1.1.3 Khu vực phân bố, kỹ thuật trồng thu hoạch 1.1.4 Thành phần hóa học củ TTB 1.2 Tình hình nghiên cứu nƣớc 1.2.1 Ngoài nước 1.2.2 Trong nước 10 1.3 Ứng dụng cao trích củ TTB 11 1.3.1 Kháng tiểu đường 11 1.3.2 Kháng ung thư 14 1.4 Phƣơng pháp trích ly 20 1.4.1 Phương pháp cổ điển 20 1.4.2 Phương pháp đại 20 1.5 Tính cấp thiết, mục tiêu, nội dung phƣơng pháp nghiên cứu 23 1.5.1 Tính cấp thiết 23 1.5.2 Mục tiêu 24 viii 1.5.3 Nội dung 24 1.5.4 Phương pháp nghiên cứu 24 CHƢƠNG THỰC NGHIỆM 32 2.1 Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị – dụng cụ địa điểm thực 32 2.1.1 Nguyên liệu 32 2.1.2 Hóa chất 32 2.1.3 Thiết bị – dụng cụ 34 2.1.4 Địa điểm thực 35 2.2 Thí nghiệm 36 2.2.1 Quy trình trích ly ginsenoside từ củ TTB 36 2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng điều kiện trích ly 37 2.2.3 Phân tích hàm lượng ginsenoside 38 2.2.4 Thử nghiệm hoạt tính sinh học cao trích 40 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 41 3.1 Điều kiện trích ly 41 3.1.1 Ảnh hưởng yếu tố 41 3.1.2 Áp dụng quy hoạch thực nghiệm tìm điều kiện trích ly phù hợp 44 3.2 Hoạt tính sinh học cao trích 59 3.2.2 Hoạt tính kháng tiểu đường 59 3.2.3 Hoạt tính kháng ung thư 61 CHƢƠNG KẾT LUẬN 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC CÔNG TRÌNH CƠNG BỐ PHẦN LÝ LỊCH TRÍCH NGANG ix Nguyen Thi Hong Ngoc, Nguyen Thi Thuy Dung, Ho Nhu Quynh, Dang Thi Khanh Linh, Tran Quoc Hoa, Nguyen Tran Xuan Phuong, Hoang Minh Nam Nguyen Huu Hieu; “Ultrasonic-assisted extraction of polysaccharide from Ganoderma lucidum and application in thixogel-based skin care cosmetic”; Vietnam Journal of Chemistry, vol 56 (3E12), pp 278-284, 2018 PHẦN LÝ LỊCH TRÍCH NGANG Họ tên: NGUYỄN TRẦN XUÂN PHƢƠNG Ngày, tháng, năm sinh: 12/05/1995 Nơi sinh: Đồng Tháp Địa liên lạc: 521/1, Hồng Văn Thụ, Phường 4, Quận Tân Bình, Tp.HCM Số điện thoại: 0939 755 118 Email: ntxp.dhho9a@gmail.com QUÁ TRÌNH ĐÀO TẠO  9/2013-11/2017: Kỹ thuật phân tích, Khoa Cơng nghệ Hóa học, Trường Đại học Cơng nghiệp Tp.HCM  9/2017-nay: Khoa Kỹ thuật Hóa học, Trường Đại học Bách khoa, ĐHQG- HCM Q TRÌNH CƠNG TÁC  5/2017-7/2018: Phịng thí nghiệm Trọng điểm ĐHQG-HCM – Cơng nghệ Hóa học Dầu khí (CEPP), Trường Đại học Bách khoa, ĐHQG-HCM  8/2018-nay: Phịng Hóa chất Chất tồn dư, Cục Thú Y – Trung tâm Kiểm tra Vệ sinh Thú Y Trung Ương II ... ginsenoside từ củ tam thất bắc phƣơng pháp có hỗ trợ enzyme thử nghiệm hoạt tính sinh học cao trích? ?? chọn nghiên cứu 1.5.2 Mục tiêu  Đưa quy trình trích ly ginsenoside (Rb1 Rg3) từ củ TTB phương pháp có. .. âm, trích ly lưu chất siêu tới hạn, đặc biệt phương pháp kết hợp hóa học sinh học phương pháp trích ly có hỗ trợ enzyme Phương pháp trích ly có hỗ trợ enzyme (Enzyme- Assisted Extraction – EAE) Enzyme. .. thất bắc trồng Việt Nam chưa phổ biến Vì vậy, đề tài luận văn ? ?Nghiên cứu trích ly ginsenoside từ củ tam thất bắc phƣơng pháp có hỗ trợ enzyme thử nghiệm hoạt tính sinh học cao trích? ?? chọn nghiên