Ứng dụng vi khuẩn lên men lactic trong xử lý hạt giống đậu phộng

ĐỒN THANH NIÊN CỘNG SẢN HỒ CHÍ MINH BAN CHẤP HÀNH TP HỒ CHÍ MINH CƠNG TRÌNH DỰ THI GIẢI THƢỞNG SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC EURÉKA LẦN THỨ XX NĂM 2018 TÊN CƠNG TRÌNH ỨNG DỤNG VI KHUẨN LÊN MEN LACTIC TRONG XỬ LÝ HẠT GIỐNG ĐẬU PHỘNG LĨNH VỰC NGHIÊN CỨU: Nông Lâm Ngƣ Nghiệp CHUN NGÀNH: Nơng Nghiệp Mã số cơng trình: …………………………… (Phần BTC cấp thành ghi) i TÓM TẮT CƠNG TRÌNH Vi khuẩn lên men lactic từ lâu đƣợc sử dụng loại thực phẩm lên men truyền thống Dù an tồn có nhiều ứng dụng nhƣng cơng trình nghiên cứu ứng dụng bảo quản nơng sản cịn Các chủng vi khuẩn lên men lactic lấy từ phịng thí nghiệm đƣợc xác định khiết thử nghiệm sinh lý, sinh hoá khả phân giải lân, sinh IAA, tạo biofilm Sau tiến hành khảo sát phát triển môi trƣờng khác chọn đƣợc môi trƣờng bắp cải bổ sung 12g/L glucose 15g/L peptone để nuôi cấy thay với khả kháng nấm Aspergillus sp CĐP1 tƣơng đƣơng MRS Broth, xấp xỉ 42.61% vƣợt trội đối chứng Daconil 0.5g/L 26.85% Đồng thời khả sinh IAA, phân giải lân tạo biofilm đƣợc trì mơi trƣờng Nƣớc bắp cải với sinh khối phát triển 90% MRS Broth Hạt đậu phộng đƣợc ngâm ba công thức phối trộn với tỉ lệ L5:L2N:L3 lần lƣợt là: 1:1:1 – không gia nhiệt – khơng trung hồ pH; 1:1:2 – khơng gia nhiệt – khơng trung hồ 1:2:1 – gia nhiệt 100°C phút – trung hoà pH vịng 15 phút có bổ sung 0.1% Tween 80 cho kết bảo quản hạt điều kiện in vitro 30 ngày, đối chứng Daconil bắt đầu xuất nấm mốc ngày 21, chứng tỏ tác nhân ức chế nấm mốc không phụ thuộc vào pH, ngồi trừ acid hữu cơ, hợp chất protein cịn tác nhân khác, mà hợp chất thứ cấp Bên cạnh đó, cơng thức cịn giúp gia tăng độ khoẻ mầm, tỉ lệ nảy mầm, nhiên không khác biệt ý nghĩa thống kê chiều dài thân; rễ;cây, khối lƣợng thân; rễ; so với đối chứng Daconil có khác biệt ý nghĩa thống kê Nghiên cứu cho thấy khả ứng dụng vi khuẩn lên men lactic bảo quản giúp phát triển hạt đậu phộng Từ đề xuất quy trình sản xuất chế phẩm kích thích tăng trƣởng bảo quản hạt từ ba chủng vi khuẩn lên men lactic Lactobacillus sp L5, Lactobacillus sp L2N Lactobacillus sp L3 ii MỤC LỤC MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH ẢNH vi MỞ ĐẦU .1 Đặt vấn đề Tình hình nghiên cứu 2.1 Ngoài nƣớc: .2 2.2.Trong nƣớc: 3.Mục đích nghiên cứu: 4.Mục tiêu nghiên cứu: Nội dung nghiên cứu: Phƣơng pháp nghiên cứu: 6.1.Phƣơng pháp luận: 6.2.Phƣơng pháp xử lý số liệu: .4 Kết đạt đƣợc: CHƢƠNG I: TỔNG QUAN .5 Tổng quan xử lý hạt giống: 1.1 Giới thiệu chung: .5 1.2 Các phƣơng pháp khử nhiễm độc tố: .6 1.2.1 Phƣơng pháp vật lý: 1.2.2 Phƣơng pháp hóa học: 1.2.3 Phƣơng pháp sinh học: Các vi sinh vật hỗ trợ tăng trƣởng trồng: .12 2.1 Khả phân giải lân: 12 2.1.1 VSV phân giải lân hữu .13 iii 2.1.2 VSV phân giải lân vô .14 2.2 Tạo màng sinh học biofilm 15 2.3 Khả sinh Indole-3-acetic acid (IAA) .17 Tổng quan vi khuẩn lactic 19 3.1 Đặc điểm hình thái giống Lactobacillus sp 19 3.2 Đặc điểm sinh lý 20 3.3 Đặc điểm sinh hóa 20 3.4 Nhu cầu dinh dƣỡng vi khuẩn lactic 21 3.5 Quá trình trao đổi chất .23 3.6 Các yếu tố ảnh hƣởng đến trình lên men, trình sinh trƣởng phát triển vi khuẩn lactic .28 3.7 Khả kháng nấm vi khuẩn lactic 29 3.7.1 Khả kháng nấm chủng vi khuẩn lactic 29 3.7.2 Các hợp chất kháng nấm .30 3.7.3 Các hợp chất kháng khuẩn khác 37 3.8 Ứng dụng vi khuẩn lactic 40 CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .42 2.1 Địa điểm nghiên cứu 42 2.2 Thời gian thực 42 2.3 Vật liệu nghiên cứu 42 2.3.1 Vật liệu 42 2.3.2 Hóa chất sử dụng 42 2.3.3 Thiết bị 43 2.3.4 Dụng cụ 43 2.4 Phƣơng pháp luận 44 2.4.1 Mục tiêu đồ án 44 2.4.2 Nội dung .44 iv 2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 45 2.5.1 Sơ đồ nghiên cứu 45 2.5.2 Khảo sát độ khiết vi khuẩn lactic 46 2.5.2.1 Nhuộm gram 47 2.5.2.2 Nhuộm bào tử 48 2.5.2.3 Thử nghiệm Catalase 49 2.5.2.4 Thử nghiệm khả lên men đƣờng .49 2.5.2.5 Khả di động .50 2.5.3 Khả phân giải lân 51 2.5.4 Khả sinh IAA .52 2.5.5 Khả tạo màng Biofilm 53 2.5.6 Chủng nấm mốc Aspergillus sp CĐP1 54 2.5.6.1 Khảo sát phát triển loại môi trƣờng 55 2.5.6.2 Khảo sát hình thái 55 2.5.7 Khảo sát khả đối kháng trực tiếp vi khuẩn lactic với nấm mốc Aspergillus sp CĐP1 56 2.5.8 Phƣơng pháp khảo sát mơi trƣờng lên men thích hợp cho vi khuẩn lactic 56 2.5.9 Xác định acid lactic .57 2.5.10 Xác định mật độ vi khuẩn 57 2.5.11 Phƣơng pháp khảo sát khả bảo quản hạt giống khỏi nấm mốc Aspergillus sp CĐP1 60 2.5.12 Khảo sát ảnh hƣởng dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus sp L5, L3, L2N phát triển hạt giống .68 2.5.12.1 Khảo sát ảnh hƣởng dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus sp L5, L3, L2N nảy mầm hạt 68 2.5.12.2 Ảnh hƣởng vi khuẩn Lactobacillussp L5, L3, L2N đến độ khỏe mầm đạu phộng 69 v CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 70 3.1 Khảo sát sinh lý – sinh hoá chủng vi khuẩn lactic: 70 3.1.1 Quan sát hình thái khuẩn lạc: .70 3.1.2 Nhuộm Gram: 71 3.1.3 Nhuộm bào tử: .71 3.1.4 Thử nghiệm Catalase: 72 3.1.5 Thử nghiệm tính di động: 73 3.1.6 Thử nghiệm lên men loại đƣờng .74 3.2 Khảo sát phát triển chủng nấm Aspergillus sp CĐP1 76 3.3 Khảo sát mơi trƣờng lên men thích hợp .78 3.3.1 Khảo sát khả sinh acid lactic mật độ tế bào chủng Lactobacillus spp L5, L2N, L3 79 3.3.2 Khảo sát khả tạo màng sinh học biofilm chủng Lactobacillus spp L5, L2N, L3 83 3.3.3 Đánh giá khả phân giải lân chủng Lactobacillus spp L5, L2N, L3 86 3.3.4 Đánh giá khả sinh IAA chủng Lactobacillus spp L5, L2N, L3 91 3.3.5 Đánh giá khả kháng nấm invitro chủng vi khuẩn lactic 93 3.5.6 Khảo sát khả bảo quản hạt đậu phộng 96 3.3.7 Khảo sát ảnh hƣởng dịch nuôi cấy Lactobacillus sp L5, L2N, L3 tới phát triển hạt giống 100 3.3.7.1 Ảnh hƣởng dịch nuôi cấy Lactobacillus sp L5, L2N, L3 tới khả phát triển đậu phộng ngày sau nảy mầm 100 3.3.7.2 Khảo sát khả ảnh hƣởng dịch nuôi cấy Lactobacillus sp L5, L2N, L3 tới đậu phộng 14 ngày sau nảy mầm .104 CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 110 vi 4.1 Kết luận 110 4.2 Kiến nghị 110 TÀI LIỆU THAM KHẢO 111 vii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT LAB Lactic acid bacteria/ Lactobacillales VSV Vi sinh vật VK Vi khuẩn BVTV Bảo vệ thực vật IAA Indole-3-acetic acid EPS Extracellular polymeric substance MRS de Man, Rogosa and Sharpe PDA Potato Detrose Agar ĐC Đối chứng TN Thí nghiệm NT Nghiệm thức KĐC Khơng điều chỉnh MT Môi trƣờng viii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Các chế khử nhiễm sinh học số chủng vi khuẩn 10 Bảng 1.2: Một số sản phẩm chuyển hóa LAB phƣơng thức hoạt động 27 Bảng 1.3: Một số hợp chất tiềm kháng nấm mốc nấm men 30 Bảng 1.4: Cơ chế kháng nấm số hợp chất .34 Bảng 1.5: Một số bacteriocins đƣợc sử dụng rộng rãi (M P Zacharof, 2012) 38 Bảng 1.6: Khả đối kháng sản phẩm biến dƣỡng vi khuẩn LAB 39 Bảng 2.1: Bố trí thí nghiệm bảo quản chai 67 Bảng 3.1 Khả lên men đƣờng chủng L5, L3, L2N 75 Bảng 3.3 Thống kê xếp hạng OD 550nm chủng vi khuẩn lactic .84 Bảng 3.3 Khả phân giải lân ba chủng vi khuẩn lactic ngày 90 Bảng 3.4: Hàm lƣợng IAA chủng vi khuẩn tổng hợp 92 Bảng 3.5: Tỷ lệ ức chế chủng vi khuẩn loại môi trƣờng với chủng nấm mốc theo phƣơng pháp cấy đƣờng vi khuẩn .94 Bảng 3.6: Ngày xuất tơ nấm thí nghiệm bảo quản hạt đậu phộng 98 Bảng 3.7: Thành phần nghiệm thức ngâm đậu phộng .100 Bảng 3.8: Tỷ lệ nảy mầm độ khoẻ mầm nghiệm thức đậu phộng .101 Bảng 3.9: Ảnh hƣởng dịch nuôi cấy vi khuẩn đến chiều dài sinh khối rễ, thân ngày sau nảy mầm 103 Bảng 3.10: Ảnh hƣởng dịch nuôi cấy chiều dài đậu phộng sau 14 ngày nảy mầm .104 ix DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Một số loại auxin phổ biến 18 Hình 1.2: Con đƣờng lên men Glucose .26 Hình 1.3: Cấu trúc phân tử hợp chất kháng nấm 33 Hình 2.1: Sơ đồ nghiên cứu 45 Hình 2.2: Sơ đồ khảo sát độ khiết vi khuẩn lactic 46 Hình 2.3: Sơ đồ khảo sát khả phát triển chủng nấm CĐP1 53 Hình 2.4: Sơ đồ khảo sát khả đối kháng trực tiếp vi khuẩn lactic với nấm mốc Aspergillus sp CĐP1 .55 Hình 2.5: Sơ đồ xác định mật độ vi khuẩn 58 Hình 2.6: Sơ đồ khảo sát khả bảo quản hạt giống khỏi nấm mốc Aspergillus sp CĐP1 60 Hình 2.7: Sơ đồ khảo sát ảnh hƣởng dịch nuôi cấy chủng Lactobacillus sp L5, L3, L2N phát triển hạt giống 68 Hình 3.1: Hình thái khuẩn lạc chủng Lactobacillus spp môi trƣờng MRS agar .70 Hình 3.2: Kết nhuộm gram vi khuẩn .71 Hình 3.3: Kết nhuộm bào tử vi khuẩn .72 Hình 3.4: Thử nghiệm catalase chủng vi khuẩn Lactobacillus sp L5 73 Hình 3.5: Thử nghiệm tính di động chủng Lactobacillus sp L5 chủng vi khuẩn đối chứng Bacillus subtilis .74 Hình 3.6: Khả lên men loại đƣờng vi khuẩn 75 Hình 3.7: Khả phát triển chủng nấm Aspergillus sp CĐP1 môi trƣờng MRS Agar cải tiến .77 Hình 3.8: Hình thái nấm nấm Aspergillus sp CĐP1 78 Hình 3.9: Biểu đồ thể mật độ tế bào chủng vi khuẩn lactic sp L5 .79 Hình 3.10: Biểu đồ thể mật độ tế bào chủng vi khuẩn lactic L2N .80 165 Class Level Information Class Levels Values MAU DC+ DC- TN1-NT1 TN1-NT12 TN3-NT8 Number of Observations Read 15 Number of Observations Used 15 CHIEU DAI THAN NGAY The ANOVA Procedure Dependent Variable: CHIEUDAI Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model Error 10 190.000000 3542.933333 885.733333 46.62 F MAU 885.733333 46.62 F Model 0.43537333 0.10884333 Error 10 0.32820000 0.03282000 3.32 0.0565 Corrected Total 14 0.76357333 R-Square Coeff Var Root MSE TRONGLUONG Mean 0.570179 47.84232 0.181163 0.378667 168 Source DF Anova SS MAU Mean Square F Value Pr > F 0.43537333 0.10884333 3.32 TRONG LUONG RE XU NGAY The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for TRONGLUONG Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.03282 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 0.3296 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean A N MAU 0.5900 TN1-NT12 A A 0.5800 TN3-NT8 A B A 0.2867 TN1-NT1 B B B 0.2233 DC+ 0.0565 169 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean B N MAU 0.2133 DC- D5.6 Trọng lƣợng thân đậu phộng ngày TRONG LUONG THAN NGAY 7‟ The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values MAU DC+ DC- TN1-NT1 TN1-NT12 TN3-NT8 Number of Observations Read 15 Number of Observations Used 15 TRONG LUONG THAN NGAY 7‟ The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for TRONGLUONG Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.00814 Critical Value of t 2.22814 170 Least Significant Difference 0.1641 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean A N MAU 1.09000 TN1-NT12 A B A 1.04333 TN1-NT1 B A B A 1.03667 TN3-NT8 C 0.89667 DC- B B C C 0.86000 DC+ D5.7 Chiều dài rễ đậu phộng ngày 14 CHIEU DAI RE NGAY 14 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values MAU DC+ DC- TN1-NT1 TN1-NT12 TN3-NT8 Number of Observations Read 15 171 Number of Observations Used 15 CHIEU DAI RE NGAY 14 The ANOVA Procedure Dependent Variable: CHIEUDAI Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model Error 10 304.666667 1035.733333 258.933333 8.50 0.0030 30.466667 Corrected Total 14 1340.400000 R-Square Coeff Var Root MSE CHIEUDAI Mean 0.772705 6.747753 5.519662 81.80000 Source DF Anova SS Mean Square F Value Pr > F MAU 1035.733333 258.933333 8.50 0.0030 CHIEU DAI RE NGAY 14 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for CHIEUDAI Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 172 Error Mean Square 30.46667 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 10.042 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N MAU A 89.333 TN1-NT1 A A 88.333 TN3-NT8 A A 88.000 TN1-NT12 B 72.667 DC- B B 70.667 DC+ D5.8 Chiều dài thân đậu phộng ngày 14 CHIEU DAI THAN CAY DAU PHONG NGAY 14 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values MAU DC+ DC- TN1-NT1 TN1-NT12 TN3-NT8 173 Number of Observations Read 15 Number of Observations Used 15 CHIEU DAI THAN CAY DAU PHONG NGAY 14 The ANOVA Procedure Dependent Variable: CHIEUDAI Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model Error 10 472.666667 3932.933333 983.233333 20.80 F MAU 3932.933333 983.233333 20.80 F Model 0.08602667 0.02150667 Error 10 0.06226667 0.00622667 3.45 0.0509 Corrected Total 14 0.14829333 R-Square Coeff Var Root MSE SINH KHOI Mean 0.580111 12.15235 0.078909 0.649333 Source DF Anova SS MAU Mean Square F Value Pr > F 0.08602667 0.02150667 SINH KHOI RE CAY DAU PHONG NGAY 14 The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for SINH KHOI 3.45 0.0509 176 Alpha 0.05 Error Degrees of Freedom 10 Error Mean Square 0.006227 Critical Value of t 2.22814 Least Significant Difference 0.1436 Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean A N MAU 0.72333 TN1-NT12 A B A 0.71667 TN3-NT8 B A B A 0.69000 TN1-NT1 C 0.57333 DC+ B B C C 0.54333 DC- D5.10 Sinh khối thân đậu phộng ngày 14 SINH KHOI THAN CAY DAU PHONG NGAY 14 The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values 177 Class Level Information Class Levels Values MAU DC+ DC- TN1-NT1 TN1-NT12 TN3-NT8 Number of Observations Read 15 Number of Observations Used 15 SINH KHOI THAN CAY DAU PHONG NGAY 14 The ANOVA Procedure Dependent Variable: SINH KHOI Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 0.63617333 0.15904333 Error 10 0.03480000 0.00348000 45.70 F MAU 0.63617333 0.15904333 45.70