Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CƠNG NGHỆ TP HCM KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP TÌM HIỂU QUY TRÌNH SẢN XUẤT ENZYME BROMELAIN TỪ VỎ DỨA Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực MSSV: 0811110006 : PHAN THỊ NGỌC CHÂU Lớp: 08CSH2 TP Hồ Chí Minh, 2011 Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan rằng, khóa luận tốt nghiệp “Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme Bromelain từ vỏ dứa” cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu sử dụng khóa luận la trung thực có nguồn gốc cụ thể, rõ ràng Nội dung khóa luận thực sở lý thuyết, kiến thức co tham khảo thêm số tài liệu, sách báo tập chí theo danh mục khóa luận Sinh viên thực Phan Thị Ngọc Châu SVTH: Phan Thị Ngọc Châu i Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa MỤC LỤC CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu dề tài .2 1.2.1 Mục tiêu tổng quát 1.2.2 Mục tiêu cụ thể CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu sơ luợc enzyme 2.2 Enzyme protease .4 2.2.1.Giới thiệu sơ lược enzyme protease .5 2.2.1.1 Protease động vật .5 2.2.1.2 Protease thực vật 2.2.1.3 Protease vi sinh vật 2.2.2 Ứng dụng enzyme protease 2.3 Enzyme bromelain thu nhận từ vỏ dứa 11 2.3.1 Giới thiệu enzyme bromelain 11 2.3.2 Tính chất vật lí enzyme bromelain 11 2.3.3 Tính chất hố học enzyme bromelain 12 2.3.3.1 Cấu tạo hoá học 12 2.3.3.2 Cấu trúc không gian bromelain 12 2.3.4 Hoạt tính enzyme bromelain 13 2.3.4.1 Cơ chế tác động 13 2.3.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme Bromelain 14 2.3.5 Ứng dụng enzyme Bromelain 15 2.3.5.1 Trong công nghiệp thực phẩm 15 2.3.6 Tình hình nghiên cứu ngồi nước enzyme bromelain 16 2.3.6.1 Tình hình nghiên cứu enzyme bromelain nước 16 2.3.6.2 Tình hình nghiên cứu enzyme bromelain nước .17 SVTH: Phan Thị Ngọc Châu ii Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .18 3.1 Vật liệu hóa chất .18 3.1.1 Nguyên liệu 18 3.1.2 Hóa chất 18 3.1.3 Thiết bị 18 3.2 Quy trính tách chiết Enzyme Bromelain .19 3.2.1 Thuyết minh quy trình 20 3.2.2 khảo sát tác nhân tủa enzyme cồn 960, muối Ammonium sulfate (NH4)2SO4 aceton (CH3COCH3) .20 3.2.2.1 Nguyên tắc 20 3.2.2.2 Tủa enzyme cồn 960 20 3.2.2.3 Tủa enzyme muối Ammonium sulfate (NH4)2SO4 21 3.2.2.4 Tủa enzyme aceton (CH3COCH3) 21 3.2.3 Phương pháp xác định hàm lượng protein hoạt tính bromelain từ dịch chiết enzyme 22 3.2.3.1 Xác định hàm lượng protein phương pháp Bradford 22 3.3 Enzyme cố định .28 3.3.1 Định nghĩa enzyme cố định 28 3.3.2 Tính chất ưu nhược điểm enzyme cố định 29 3.2.2.1 Ưu điểm 29 3.3.2.2 Nhược điểm 29 3.3.3 Một số phương pháp cố định enzyme 30 3.3.3.1 Phương pháp liên kết enzyme với vật liệu cố định (carrier binding) 30 3.3.3.2 Phương pháp hấp thụ vật lí (physical adsorption) 30 3.3.3.4 Phương pháp khâu mạch (cross – linking) .32 3.3.4 Cố định enzyme bromelain chất Natrialginate phương pháp nhốt 33 3.3.4.1 Đặc điểm, tính chất Natrialginate 33 SVTH: Phan Thị Ngọc Châu iii Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa 3.3.4.2 Tạo dung dịch Natrialginate 3% 33 3.3.4.3 Tiến hành cố định 33 3.3.4.4 Phương pháp xác định hiệu suất cố định protein hiệu suất cố định hoạt tính enzyme cố định .33 3.3.5 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng yếu tố lý hóa đến hoạt tính enzyme bromelain cố định Natrialginate 34 3.3.5.1 Khảo sát ảnh hưởng pH .34 3.3.5.2 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ 34 3.3.5.3 Khảo sát độ bền nhiệt .35 3.3.5.4 Khảo sát số lần tái sử dụng bromelain cố định Natrialginate 35 3.3.6 Tinh enzyme bromelain sắc ký lọc gel 35 3.3.6.1 Nguyên tắc .36 3.3.6.2 Thiết bị hóa chất 36 3.3.6.3 Các bước tiến hành 36 3.3.6.4 Tính hiệu suất hoạt tính enzyme Bromelain độ tinh enzyme sau tinh sắc ký lọc gel 38 3.3.7 Xác định trọng lượng phân tử enzyme Bromelain phương pháp điện di gel polyacrylamid (SDS – PAGE) 39 3.3.7.1 Nguyên tắc .39 3.3.7.2 Thiết bị hóa chất 39 3.3.7.3 Phương pháp 41 3.3.7.4 Xác định trọng lượng phân tử enzyme Bromelain 43 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 4.1 Kết luận 44 4.2 Kiến nghị .44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 SVTH: Phan Thị Ngọc Châu iv Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Tính chất vật lý enzyme bromelain 11 Bảng 2.2 Ảnh hưởng trạng thái điều kiện bảo quản 15 Bảng 3.1 Tỷ lệ cồn 96o dịch enzyme từ vỏ dứa 20 Bảng 3.2 Nồng độ tủa muối (NH4)2SO4 dịch enzyme từ vỏ dứa 21 Bảng 3.3 Tỉ lệ tủa aceton dịch enzyme từ vỏ dứa 22 Bảng 3.4 Bảng số liệu dựng đường chuẩn albumin 24 Bảng 3.5 Bảng số liệu dựng đường chuẩn tyrosine 26 SVTH: Phan Thị Ngọc Châu v Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1 Cấu trúc gian enzyme protease Hình 2.2 Nguồn enzyme protease từ thực vật Hình 2.3 Vi khuẩn Clostridium Hình 2.4 Vi khuẩn Bacillus Hình 2.5 Nấm mốc Hình 2.6 Xạ khuẩn Hình 3.1 Thiết bị lọc gel áp suất thấp 35 Hình 3.2 Loại muối trước chạy sắc ký .38 SVTH: Phan Thị Ngọc Châu vi Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Hầu phản ứng hóa học thể sống cần phải có vai trị xúc tác enzyme – chất xúc tác sinh học Chính vậy, nghiên cứu enzyme thu hút quan tâm nhiều nhà khoa học lĩnh vực liên quan khác nhằm tìm cơng dụng khác enzyme Nghiên cứu công nghệ enzyme tiến hành nhiều tác sử dụng phủ tạng lò mổ để sản xuất pancrease, pepsin, tripsin, sử dụng mầm mạ để sản xuất amylase Đã có thử nghiệm công nghệ sản xuất amino acid từ nhộng tằm protease, bột protein thịt enzyme bromelain từ vỏ dứa… Nghiên cứu enzyme cịn có ý nghĩa thực tiễn quan trọng, số bệnh, đặc biệt bệnh mang tính di truyền, thiếu hay hẳn số enzyme mơ, điều kiện khơng bình thường xuất hoạt tính dư thừa số enzyme đặc hiệu Do xác định hoạt tính số enzyme huyết tương, hồng cầu mô quan trọng việc chẩn đốn bệnh Enzyme trở thành cơng cụ thực tế quan trọng y học mà cơng nghệ hóa học, chế biến thực phẩm…Đối với nước ta nguồn enzyme từ thực vật có triển vọng lớn nguồn nghiên liệu phong phú ( dứa, đu đủ,… ) Trong trình chế biến dứa đóng hộp sử dụng phần dứa, phần lại phụ phẩm Nếu tận dụng nguồn phế phẩm vừa giảm thiểu chất hữu gây nhiễm mơi trường vừa sản xuất sản phẩm enzyme bromelain có từ dứa Enzyme bromelain có ba hoạt tính khác nhau: peptidase, amidase, esterase phân hủy chất tự nhiên lẫn chất tổng hợp, chúng có giá trị kinh tế cao Từ lợi ích enzyme bromelain mang lại, chấp nhận Khoa Môi Trường Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Kỹ Thuật Cơng Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh, chúng tơi xin tiến hành thực khóa luận “Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa” SVTH: Phan Thị Ngọc Châu Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa 1.2 Mục tiêu dề tài 1.2.1 Mục tiêu tổng quát Quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa Cố định enzyme bromelain Natrialginate 1.2.2 Mục tiêu cụ thể Thu nhận dịch enzyme bromelain từ vỏ dứa Khảo sát tác nhân tủa enzyme cồn 960, muối Ammonium sulfate ((NH4)2SO4 ) aceton ( CH3COCH3 ) Cố định enzyme bromelain Natrialginate Tinh enzyme bromelain Xác định trọng lượng phân tử enzyme bromelain phương pháp điện di SVTH: Phan Thị Ngọc Châu Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN 2.1 Giới thiệu sơ luợc enzyme Enzyme chất xúc tác hệ thống sinh học Chúng có khả xúc tác đặc biệt, thường mạnh nhiều so với chất xúc tác tổng hợp Tác dụng xúc tác chúng mang tính đặc hiệu chất, làm tăng đáng kể tốc độ phản ứng hóa học xảy môi trường nước điều kiện nhiệt độ pH thích hợp Enzyme chìa khóa để hiểu biết q trình hoạt động sống tế bào Hoạt động trật tự có tính tổ chức cao, chúng xúc tác hàng trăm phản ứng theo trật tự xác định đường trao đổi chất mà nhờ chất dinh dưỡng bị phân hủy, lượng hóa học lưu biến đổi, đại phân tử sinh học tạo từ chất tiền thân đơn giản Một số enzyme tham gia trình trao đổi chất enzyme điều hòa, chịu trách nhiệm tín hiệu trao đổi chất khác cách thay đổi hoạt tính xúc tác chúng cách thích hợp Thơng qua hoạt động enzyme điều hòa hệ thống enzyme phối hợp chặt chẽ với để tạo mối quan hệ hài hòa hoạt tính trao đổi chất cần thiết cho việc trì sống Enzyme có thể sinh vật, khơng làm nhiệm vụ xúc tác cho phản ứng hóa học định thể sinh vật mà xúc tác cho phản ứng ngồi tế bào Vì có nguồn gốc từ sinh vật enzyme thường gọi chất xúc tác sinh học ( biocatalisateur ) nhằm phân biệt với chất xúc tác hóa học khác.Chính nhờ có mặt enzyme mà nhiều phản ứng hóa học khó xảy điều kiện thường ngồi thể (do cần nhiệt độ, áp suất cao, acid mạnh hay kiềm mạnh…) thể xảy nhanh chóng, liên tục nhịp nhàng với nhiều phản ứng liên hợp khác điều kiện êm dịu, nhẹ nhàng (370C, áp suất thường, không kiềm mạnh hay acid mạnh…) Đặc tính quan trọng enzyme tính đặc hiệu Tính đặc hiệu khả xúc tác chọn lọc, xúc tác chuyển hóa hay số chất định theo kiểu phản ứng định: đặc hiệu cảm ứng đặc hiệu chất SVTH: Phan Thị Ngọc Châu Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa 3.3.4 Cố định enzyme bromelain chất Natrialginate phương pháp nhốt 3.3.4.1 Đặc điểm, tính chất Natrialginate Là chuỗi polymer mạch thẳng không phân nhánh, dẫn xuất alginic kết hợp với cation kim loại Na2+, cấu trúc alginate gồm hai acid hợp thành: acid α-L-guluronic (gọi tắt G) acid β-D-manuronic (gọi tắt M) qua liên kết 1-4 glycosit Natrialginate có nguồn gốc từ loại tảo nâu Natrialginate có tính chất sau: - Khả tạo độ nhớt - Khả tạo gel - Khả tạo màng 3.3.4.2 Tạo dung dịch Natrialginate 3% Cân 1.5g Natrialginate hòa tan 50ml dung dịch đệm phosphate 0.1 M pH=7 Khuấy đến tất Natrialginate hịa tan hồn toàn 3.3.4.3 Tiến hành cố định Cân 1,5g enzyme bromelain hòa tan dung dịch Natrialginate 3% Dùng ống Xilanh có đầu kim tiêm (0,3mm), hút dung dịch enzyme hòa tan này, nhỏ từ độ cao 20cm vào 200ml dung dịch 0.02 M CaCl2 với khuấy lien tục dung dịch với máy khuấy từ để tạo gel Quá trình tạo gel xảy 2h, nhiệt độ phòng Sau cố định, dung giấy lọc, lọc enzyme cố định Kết thu hạt enzyme bromelain nhốt khuôn gel Dịch lọc thu đem xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford 3.3.4.4 Phương pháp xác định hiệu suất cố định protein hiệu suất cố định hoạt tính enzyme cố định ™ Phương pháp xác định hiệu suất cố định protein enzyme cố định Hiệu suất cố định protein xác định theo công thức sau: H= SVTH: Phan Thị Ngọc Châu (C0 V0 − Cf Vf ) * 100 C0 V0 33 Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa Trong đó: C0: Nồng độ protein ban đầu (µg/ml) V0: Thể tích ban đầu dung dịch enzyme (ml) Cf: Nồng độ protein tổng phần nước lọc (µg/ml) Vf: Tổng thể tích phần nước lọc (ml) H: Hiệu suất cố định protein (%) ™ Phương pháp xác định hiệu suất cố định hoạt tính enzyme cố định Hiệu suất cố định hoạt tính enzyme xác định theo công thức sau: η= (E0 V0 − Ef Vf ) * 100 E0 V0 Trong đó: E0: Hoạt tính enzyme trước cố định (U/ml) V0: Thể tích dùng để cố định (ml) Cf: Hoạt tính enzyme sau cố định (U/ml) Vf: Thể tích enzyme cịn lại sau cố định (ml) η: Hiệu suất cố định hoạt tính (%) 3.3.5 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng yếu tố lý hóa đến hoạt tính enzyme bromelain cố định Natrialginate 3.3.5.1 Khảo sát ảnh hưởng pH Khảo sát hoạt tính bromelain giá trị pH : 6, 7, 8, 9, 10 điều kiện nhiệt độ 370 phương pháp Amano Tuy nhiên, thay ml dung dịch enzyme thí nghiệm g enzyme cố định Tính kết vẽ đổ thị biểu diễn để tìm giá trị pH cho hoạt động bromelain mạnh pH tối ưu cho hoạt động enzyme cố định 3.3.5.2 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ Khảo sát hoạt tính bromelain giá trị nhiệt độ : 30, 40, 50, 60, 70, 80 điều kiện pH phương pháp Amano Tuy nhiên, thay ml dung dịch enzyme thí nghiệm g enzyme cố định SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 34 Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa Tính kết vẽ đồ thị biễu diễn để tìm giá trị nhiệt độ cho hoạt động bromelain mạnh nhiệt độ tối ưu cho hoạt động enzyme cố định 3.3.5.3 Khảo sát độ bền nhiệt Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính enzyme bromelain phương pháp Amano cách giữ nguyên hàm lượng chất, pH=7 Thay cho ml dung dịch enzyme thí nghiệm g enzyme cố định Tuy nhiên ủ enzyme casein nhiệt độ 370C khoảng thời gian 60 phút, 80 phút, 100 phút, 120 phút, 140 phút, 160 phút, 180 phút Các bước tiến hành tương tự Tính kết vẽ đồ thị biễu diễn để xem ảnh hưởng thời gian lên hoạt động phân giải enzyme bromelain cố định Natrialginate 3.3.5.4 Khảo sát số lần tái sử dụng bromelain cố định Natrialginate Sau xác định nhiệt độ pH tối ưu, ta tiến hành khảo sát số lần tái sử dụng bromelain cố định Natrialginate thơng qua việc xác định hoạt tính bromelain cố định phương pháp Amano Kết thúc thí nghiệm xác định hoạt tính lần 1, rửa lại nước cất thu lại hạt enzyme cố định Lặp lại thí nghiệm hoạt tính enzyme cố định giảm xuống 50% so với hoạt tính bromelain cố định lần 3.3.6 Tinh enzyme bromelain sắc ký lọc gel Hình 3.1 Thiết bị lọc gel áp suất thấp ( Bio – Rad ) SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 35 Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa 3.3.6.1 Nguyên tắc Kỹ thuật sắc ký lọc gel dùng để tách phân tử có kích thước, trọng lượng phân tử khác cách cho chúng qua cột gel Những phân tử có kích thước đủ nhỏ để lọt vào bên lỗ gel bị trì hỗn di chuyển chậm qua cột, phân tử lớn di chuyển bên hạt gel nên di chuyển nhanh giải hấp ( ) khỏi cột sớm phân tử nhỏ 3.3.6.2 Thiết bị hóa chất ™ Thiết bị dụng cụ: Phễu đổ gel Bình hút chân khơng Cột sắc ký Bio-Rad, kích thước 30 x 1.5 cm; thể tích: 53 ml (thể tích = chiều cao cột x (đường kính/2)2 x 3.14 (π) = 30 x (1.5/2)2 x 3.14) Bình đựng dung dich đệm Ống nghiệm 50 Vòi hút chân khơng để khử bọt khí cho dung dịch ™ Hóa chất Gel “ Bio- Gel P-100 ”, có đặc tính: dạng hạt mịn, kích thước hạt 45-90 µm; khả ngậm nước: 12 ml/1 g gel khô; phạm vi phân tách: 5.000-100.000 daltons Đệm phosphate 0.1 M pH 7: khử bọt trước dùng 3.3.6.3 Các bước tiến hành ™ Chuẩn bị gel Cân 5g gel“ Bio- Gel P-100 ” khô Cho bột gel từ từ vào dung dịch đệm phosphate 0.1 M pH đựng cốc Dùng dung dịch đệm phosphate 0.1 M pH nhiều gấp hai lần so với thể tích lớp gel cần cho cột Cụ thể dùng 53 x = 106 ml dung dịch đệm Đối với gel từ Bio-Gel P-30 đến Bio-Gel P-100 cần 12 để nhiệt độ 200C để hydrate hóa bắt đầu 1000C Sau thể huyền phù đồng SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 36 Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa hạt gel hình thành, khơng cần phải khuấy, để ổn định suốt q trình hydrate hóa Sau q trình hydrate hóa xảy hồn tồn, gạn lớp bề mặt Chuyển dung dịch vào bình hút chân khơng có gắn với vịi hút chân khơng Khử khí dung dịch khoảng từ đến 10 phút, lắc nhẹ (xoay) bình Khơng dùng đũa khuấy làm hư gel Thêm dung dịch đệm để khử khí với thể tích gấp hai lần thể tích lớp (106 ml) lắc nhẹ Để gel ổn định 90 – 95 % số hạt ổn định Gạn loại lớp bề mặt cách hút để loại hạt mặt Gắn phễu đổ gel vào cột, đóng lỗ cột cho dung dịch đệm làm đầy 20 % thể tích cột Rót dung dich gel vào cột thành dòng di chuyển nhẹ Tránh làm bắn gel, đảm bảo việc nhồi cột tránh bị bọt khí Khi lớp hình thành cột từ – cm, mở khóa đầu cột cột nạp đầy gel (packed) Khi cột nạp đầy gel, mở khóa đầu cột (outlet) gắn flow adaptor Mở khóa đầu cột, cho dung dịch đệm với thể tích gấp hai lần thể tích lớp chảy qua cột lúc khiển tốc độ chảy Đóng đầu cột, điều chỉnh flow adaptor xuống đến lớp gel Nạp mẫu vào bề mặt lớp cách bơm tiêm mẫu vào lớp gel qua flow adaptor ™ Chuẩn bị mẫu Mẫu chạy sắc ký gồm ba mẫu dịch enzyme bromelain từ vỏ ( sau tủa cồn 960, muối Ammonium sulfate aceton hòa tan với đệm phosphate 0.1 M pH ) với tỉ lệ nồng độ tối ưu chạy sắc ký lọc gel Mẫu chạy sắc ký phải ( không bị nhiễm bẩn khơng có hạt rắn ), hịa tan hồn tồn dung dịch đệm Lọc mẫu qua milipore ( màng lọc 0.45 micrometre ) làm tăng độ bền thời gian sử dụng cột SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 37 Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa Đối với mẫu dịch tủa với muối (NH4)2SO4 ta cần loại muối trước chạy sắc ký phương pháp sắc ký loại muối Hình 3.2 Loại muối trước chạy sắc ký ™ Thu xác định mẫu tách Dịch khỏi cột đo độ hấp thụ bước sóng 280 nm detector hệ sắc ký thể độ hấp thu dạng sắc ký đồ phần mềm LP Data View máy tính Dịch thu tự động máy thu mẫu (collector), phân đoạn ml Dựa sắc ký đồ, tiến hành gom phân đoạn thuộc peak Các peak đem phân tích hàm lượng protein theo phương pháp Bradford hoạt tính protease theo phương pháp Amano sau tinh 3.3.6.4 Tính hiệu suất hoạt tính enzyme bromelain độ tinh enzyme sau tinh sắc ký lọc gel Hiệu suất hoạt tính enzyme = Trong đó: ΗΤ2 x 100% ΗΤ1 HT1: Hoạt tính enzyme Bromelain trước tinh (U/g) HT2: Hoạt tính enzyme Bromelain sau tinh (U/g) HTR enzyme bromelain sau tinh = Độ tinh enzyme = SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 38 ΗΤR enzyme HTR enzyme1 HTenzyme2 HLproteinsautinhsach Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa Trong đó: HTR enzyme 1: Hoạt tính riêng enzyme trước tinh (U/mg) HTR enzyme 2: Hoạt tính riêng enzyme sau tinh (U/mg) 3.3.7 Xác định trọng lượng phân tử enzyme bromelain phương pháp điện di gel polyacrylamid (SDS – PAGE) 3.3.7.1 Nguyên tắc SDS – PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-polyacrylamide Gel Electrophoresis) kỹ thuật điện di gel polyacrylamide có diện SDS, tác nhân làm biến tính âm tính hóa phân tử protein Trong kỹ thuật protein xử lý với chất tẩy SDS tác nhân khử cầu nối disulfite mercaptoethanol dithiotheitol ( DTT ) Với tác nhân protein từ cấu trúc bậc 2,3,4 biến đổi thành chuỗi polypeptide ( bậc 1) tất protein tích điện âm Nhờ đó, di chuyển gel phân tử protein phụ thuộc vào kích thước, phân tử có kích thước lớn di chuyển chậm phân tử có kích thước nhỏ qua lỗ gel có kích thước định Dưới tác dụng điện trường phân tử tích điện âm di chuyển cực âm điện trường Để xác định phân tử lượng protein, người ta thường so sánh với thang phân tử lượng chuẩn, hỗn hợp protein có trọng lượng phân tử khác biết 3.3.7.2 Thiết bị hóa chất ™ Thiết bị dụng cụ: Bộ điện di đứng (vertical electrophoresis) Bộ nguồn chạy điện di (electrophoresis power supply) Bio-Rad Pipetteman loại: 1000 µl, 200 µl, 10 µl Đầu típ loại Giấy lọc Găng tay Phao để eppendorf Eppendorf SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 39 Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa pH kế ™ Hóa chất: N, N, N’, N’- tetramethylennediamide (C6H16N2-TEMED) Dung dịch Acrylamide /Bisacryamide 40 % (29:1) (3.3 % C) β – Mercaptoethanol (HSCH2CH2OH) Thang protein chuẩn SDS-PAGE (Bio-Rad), gồm protein chuẩn có kích thước xác định sau: − Phosphoriylase b 97.400 daltons − Bonvine serum albumin 66.200 daltons − Ovalbumin 45.000 daltons − Carbonic anhydrase 31.000 daltons − Soybean trypsin inhibitor 21.500 daltons − Lysozyme 14.400 daltons Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Ammoniumpersulfate [(NH4)2S2O8] [APS] Coomasie brilliant blue G-250 dạng viên (Bio-Rad) Cồn tuyệt đối (99.50) Methanol (CH3OH) Tris (hydroxymethyl) aminomethane Acid acetic Bromophenol blue Glycerol (C3H8O3) Glycine (C2H5O2N) Acid clohydric (HCl) Sodium dodecyl sulfate (SDS) 10 %: cân 10g SDS, cho 100 ml nước cất vào khuấy tan hết Dung dịch đệm gel phân tách (separating gel buffer) Tris-Cl 1.5M, pH 8.8 0.4% SDS: cân 36.3 g Tris pha 100 ml nước cất, thêm dần HCl 6N khuấy SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 40 Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa dung dịch pH kế 8.8 Hút ml dung dịch SDS 10% cho vào Thêm nước cất cho đủ 200 ml, lắc giữ 40C Dung dịch đệm gel gom ( stacking gel buffer ) Tris-Cl 0.5M, pH 6.8 - 0.4% SDS: cân 6.05 g Tris pha 100 ml nước cất, thêm dần HCl 6N khuấy dung dịch pH kế 6.8 Hút ml dung dịch SDS 10% cho vào Thêm nước cất cho đủ 100 ml, lắc giữ 40C Ammoniumpersulfate 10 % ( pha trước dùng ): cân 0.1 g cho vào eppendorf 1000 µl, thêm ml nước cất, lắc đều, để nhiệt độ phòng Dung dịch đệm điện di Tris – G lycine pH 8.3: pha dung dịch mẹ 10X chứa 30 g Tris, 144 g Glycine, 10 g SDS hoà tan 1000 ml nước cất Dung dịch nạp mẫu 2X ( 2X treatment buffer ) có thành phần sau: 2.5 ml dung dịch đệm Tris-Cl 0.5M, pH 6.8; 4ml 10% SDS; 2ml Glycerol; 2mg Bromophenol Blue; 0.2 ml mercaptoethanol; thêm nước đủ 10 ml Dung dịch nhuộm gel: chuẩn bị 250ml dung dịch nhuộm gel chứa: 0.625 g Comasie Blue G 250, 112.5 ml ethanol tuyệt đối, 112.5 ml nước cất 25 ml acid acetic, lắc đều, giữ chai màu tối Dung dịch giải nhuộm: 30 ml methanol, 10 ml acid acetic, 60 ml nước cất 3.3.7.3 Phương pháp ™ Đổ gel ¾ Gel phân tách (Separating gel) Cho thành phần sau theo thứ tự vào becher 50 ml sạch: 40% Acrylamide/Bis (29:1) 2.5 ml Tris – HCl 1.5 M pH 8.8 - 0.4 % SDS 2.5 ml Nước cất 4.445 ml TEMED µl Ammoniumpersulfate 10% 50 µl Tổng thể tích 10 µl Sau cho Ammoniumpersulfate 10 % vào, lắc nhẹ ống Falcon vài lần (tránh tạo bọt khí), dùng pipetteman bơm dung dịch gel vào khuôn, đổ gel cho mức SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 41 Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa dung dịch gel cao cm (tránh tạo bọt khí khn gel) Sau nhẹ nhàng đặt lớp nước cất lên lớp mặt gel để mặt gel phẳng Chờ gel đông (khoảng 20 – 30 phút) ¾ Gel gom (Stacking gel) Cho thảnh phần sau theo thứ tự vào becher 50 ml khác: 40% Acrylamide/0.8% Bis 0.5 ml Tris – HCl 0.5 M pH 6.8 - 0.4 % SDS ml Nước cất 2.476 ml TEMED µl Ammoniumpersulfate 10% 20 µl Tổng thể tích ml Sau gel phân tách trùng ngưng hoàn toàn, đỗ bên Tiến hành đỗ lớp gel gom cách dùng pipetteman bơm dung dịch gel gom vào khuôn Đồng thời đưa lược vào khn để tạo giếng mẫu (tránh tạo bọt khí khuôn gel) Sau gel trùng ngưng, tháo lược, lắp đĩa gel vào phận điện di, cho dung dịch điện di vào buồng điện di ™ Chuẩn bị mẫu chạy điện di ¾ Xử lí mẫu Hút 30 µl dung dịch nạp mẫu (2X treatment buffer) 30 µl dung dịch mẫu protein vào eppendorf sạch, đậy nắp búng nhẹ cho đều, đun sôi cách thuỷ – 10 phút Ly tâm 10.000 vòng/phút – giây Chú ý nồng độ protein mẫu vừa đủ cho hàm lượng protein giếng khơng vượt q 20 – 40 µg hàm lượng protein/băng khơng vượt q 0.1 µg Đối với thang chuẩn protein (Bio-Rad) hút µl vào eppendorf ml chứa µl nước cất 10 µl dung dịch nạp mẫu ¾ Tiến hành chạy điện di Dùng pipetteman 10 µl nạp mẫu vào giếng (20 µl /giếng) Tiến hành chạy diện di ổn định dòng: 100 v SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 42 Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa Sau điện di nhuộm gel với dung dịch nhuộm chuẩn bị trước (2 – giờ) Sau cho tiến hành giải nhuộm cách ngâm gel dung dịch giải nhuộm gel trở nên suốt không màu Sau nhuộm xong, protein phát nhờ vạch màu xanh lam gel suốt 3.3.7.4 Xác định trọng lượng phân tử enzyme Bromelain Đo khoảng cách di chuyển băng protein từ gel phân tách tới băng protein khoảng cách di chuyển từ gel phân tách tới vạch màu cuối Tính giá trị Rf Khoảng cách di chuyển protein Rf = Khoảng cách di chuyển vạch màu Brommophenol blue Vẽ biểu đồ g giá trị trọng lượng phân tử protein chuẩn giá trị Rf chúng Trọng lượng phân tử vạch protein chưa biết trọng lượng phân tử xác định thơng qua giá trị Rf chúng, thông qua phương pháp ngoại suy từ đồ thị SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 43 Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Trong trình “ tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa ”, thấy enzyme bromelain mang lại nhiều lợi ích cho sống người như: + Khắc phục khuyết điểm tự nhiên nguyên liệu + Nâng cao giá trị thương phẩm ngun liệu + Là cơng cụ q trình chuyển hóa dây chuyền chế biến thực phẩm Tham gia vào giai đoạn chuyển hóa chính, giai đoạn hồn thành sản phẩm Ngồi enzyme bromelain cịn nhiều enzyme mức độ tinh khác sử dụng công nghệ sản xuất nhiều sản phẩm hữu ích phục vụ người Cụ thể enzyme sử dụng lĩnh vựa sau: + Thủy phân tinh bột sản xuất đường + Trong công nghiệp rượu bia + Trong công nghiệp chế biến tinh bột sản xuất bánh kẹo + Sản xuất nước hoa rượu nho + Công nghiệp sữa + Trong chế biến thịt thủy phân protein + Trong sản xuất da, chất tẩy rửa dệt may + Trong công nghiệp chế biến dầu mỡ sinh học + Làm chất bổ sung thức ăn chăn nuôi thủy phân vách tế bào vi sinh vật + Ứng dụng y học làm biosensor 4.2 Kiến nghị Với điều kỳ diệu mà loại enzyme mang lại, mong thời gian tới nhà khoa học tập trung vào nghiên cứu ứng dụng enzyme mức độ tinh tế hơn, nhằm tạo sản phẩm có tính đặc thù sinh học cao hơn, có giá trị hơn, ý đến việc tìm tạo enzyme có tính chất mới, có phổ hoạt động rộng rộng đa dạng Trong tương lai, enzyme có tính SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 44 Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa chất gần giống xúc tác hóa học Do thay xúc tác hóa học số trường hợp, cho phép tạo sản phẩm có giá trị sử dụng đặc biệt Xu phù hợp với xu chung thiết lập sản xuất sinh thái bền vững, hòa hợp với tự nhiên, thể nội dung sau: + Sử dụng enzyme sản xuất đồng phân quang học có hoạt tính đặc hiệu dùng điều trị bệnh, cho mục đích tương tự + Sử dụng enzyme sản xuất thuốc kháng sinh hệ + Sử dụng enzyme sản xuất giấy khép kín nhằm giảm phế thải lượng tiêu thụ + Gắn đặc hiệu gốc đường vào peptide, protein hay thuốc chữa bệnh + Sử dụng enzyme công nghệ xử lý môi trường SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 45 Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Phạm Thị Trân Châu, Phan Tiến Hòa, Nguyễn Thị Bảo, 1987 Thành phần số hoạt tính chế phẩm Bromelain chồi Dứa tây ( Ananas comosusL – Group Quee) Tập chí sinh học, trang – Ths Phan Văn Dân, Ths Đào Thị Thu Hiền Tài liệu thực tập Công Nghệ Enzyme Protein Viện Sinh Học Nhiệt Đới Lưu hành nội Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Lân Dũng, 1982 Enzyme vi sinh vật, nhà xuất khoa học kỹ thuật Nguyễn Đức Lượng,2004 Công nghệ enzyme, nhà xuất ĐH Quốc Gia TPHCM Lê Thanh Mai, 1997 Nghiên cứu Bromelain đường ứng dụng chúng, luận văn phó tiến sĩ sinh học Trường ĐH Khoa Học Tự Nhiên Trần Xuân Ngạch, 2008 Công nghệ enzyme, nhà xuất ĐH Đà Nẵng GS.TS Mai Xuân Lương Công nghệ enzyme Nhà xuất Trường ĐH Đà Lạt PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng, 2010 Giáo trình Công nghệ enzyme Trường ĐH Kỹ Thuât Công Nghệ TPHCM SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 46 Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI Anthony J and Cichoke D.C, 1998 Bromelain Keat Puslising, Inc New Cannan, Connecticut 10 Afolso A.R.,Roberto A.E.,1994 Circular dichroism of stem bromelain : a third spectral class with the family of cysteine proteinases Biochem J (1994) 300 : 107110 11 Chandler D.S and Mynott T.L, 1998 Bromelain protects piglet from diarrhea caused by oral challege with K88 positive enterotoxigenic Eschrichia Coli Gut ,pp: 196-202 TÀI LIỆU WED 12 http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/gioi-thieu-enzyme-bromelain.347536.html 13 http://www.ebook.edu.vn/?page=1.18&view=5572 14.http://www.docsachonline.vn/index.php?option=com_w365_document&view=alert&ki nd=login&Itemid=28 15 http://baigiang.violet.vn/present/show/entry_id/4368881 16 http://vi.wikipedia.org/wiki/D%E1%BB%A9a SVTH: Phan Thị Ngọc Châu 47 .. .Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan rằng, khóa luận tốt nghiệp ? ?Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme Bromelain từ vỏ dứa? ?? cơng trình nghiên... sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa? ?? SVTH: Phan Thị Ngọc Châu Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa 1.2 Mục tiêu dề tài 1.2.1 Mục tiêu tổng quát Quy trình sản xuất enzyme bromelain. .. 10 Tìm hiểu quy trình sản xuất enzyme bromelain từ vỏ dứa 2.3 Enzyme bromelain thu nhận từ vỏ dứa 2.3.1 Giới thiệu enzyme bromelain Bromelain enzyme có nhiều dứa, phát từ kỉ 19 nghiên cứu từ