Nhân giống lan hồ điệp phalaenopsis SP bằng kỹ thuật nuôi cấy ngập chìm tạm thời tis temporary immersion system

Khóa Luận Tốt Nghiệp GVHD: Th.S Trịnh Thị Lan Anh LỜI MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Hiện Lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp.) nói chung với loại Lan khác nói riêng xem trồng đem lại nhiều hiệu kinh tế cao; có nhiều nhà vườn mạnh dạn đầu tư chuyển đổi cấu trồng từ lúa, hoa màu sang trồng Lan đạt hiệu kinh tế cao gấp - lần so với trồng khác Lan Hồ Điệp loài Lan quý ưa chuộng đóng vai trị quan trọng ngành công nghiệp hoa cắt cành cảnh giới Chúng không đẹp màu sắc, kiểu dáng mà mang vẻ đẹp sang trọng trang nhã Tuy nhiên, số lượng sản xuất Lan chưa đáp ứng nhu cầu ngày tăng thị trường Nguyên nhân Lan Hồ Điệp loài sinh trưởng chậm lồi Lan khó nhân giống, thường cho hệ số nhân thấp điều kiện vườn ươm Để có số lượng lớn giống chất lượng tốt cung cấp cho thị trường sản xuất cịn gặp nhiều khó khăn Hiện có số trường Đại Học, Viện nghiên cứu có hướng phát triển kỹ thuật như: Bioreactor, Nuôi cấy quang tự dưỡng… chưa áp dụng rộng rãi Trong năm gần đây, phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Lan Hồ Điệp nhằm tạo giống bệnh quan tâm Tuy nhiên phương pháp thực khó thành cơng đỉnh sinh trưởng q nhỏ nên tái sinh chết qua lần khử trùng Lan Hồ Điệp loại Lan đơn thân, thân ngắn cho đỉnh sinh trưởng nên để có nguồn mẫu in vitro cần phải có nhiều mẫu ban đầu làm tăng chi phí q trình ni cấy Vì vậy, nhà ni cấy mơ nước SVTH: Ưng Thị Mỹ Tiên MSSV: 0811110086 Khóa Luận Tốt Nghiệp GVHD: Th.S Trịnh Thị Lan Anh giới thường dùng phát hoa làm vật liệu nuôi cấy, phát hoa Lan Hồ Điệp có chứa mắt ngủ tạo thành chồi Do đó, phương pháp ni cấy phát hoa in vitro để tạo chồi xem đặc trưng Lan Hồ Điệp hệ số nhân giống từ phương pháp thấp Gần đây, hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời nhiều nước giới triển khai ứng dụng nhân giống nhiều loại trồng Hệ thống có tác dụng làm tăng cường sức sống chồi tăng khả tạo phôi soma, phôi tạo không bị biến dị; loại bỏ tượng thủy tinh thể nuôi cấy lỏng Thực vật nhân giống hệ thống ngập chìm có khả thích nghi tốt giai đoạn hóa ngồi vườn ươm so với thực vật nuôi cấy hệ thống bán rắn hay lỏng Việc ứng dụng hệ thống ngập chìm tạm thời nhân giống hoa kiểng đặc biệt Lan Hồ Điệp Việt Nam ứng dụng thời gian gần Với mục đích khảo sát khả ứng dụng hệ thống nâng cao số lượng chất lượng giống Lan Hồ Điệp so sánh với hệ thống ni cấy thơng thường Th.S Cung Hồng Phi Phượng cộng ứng dụng thành công hệ thống góp phần mở khả sản xuất với số lượng lớn giống có chất lượng tốt đáp ứng nhu cầu thị trường Việt Nam Để bước áp dụng công nghệ sản xuất Lan giống nước ta, đẩy nhanh tiến độ sản xuất giống theo qui mơ cơng nghiệp, góp phần khắc phục thiếu hụt giống thị trường Qua đề tài "NHÂN GIỐNG LAN HỒ ĐIỆP PHALAENOPSIS SP BẰNG KỸ THUẬT NI CẤY NGẬP CHÌM TẠM THỜI (TIS – Temporary Immersion System)" với mong muốn tìm hiểu rõ kỹ thuật ni cấy ưu SVTH: Ưng Thị Mỹ Tiên MSSV: 0811110086 Khóa Luận Tốt Nghiệp GVHD: Th.S Trịnh Thị Lan Anh điểm nhân giống Lan Hồ Điệp nuôi cấy ngập chìm so với phương pháp ni cấy khác.  Mục đích nghiên cứu Xác định nồng độ chất ĐHSTTV tối ưu cho biệt hóa PLB từ mẫu lá, đồng thời tìm mơi trường thích hợp cho rễ chồi Lan Hồ Điệp nhằm thiết lập nhân nhanh giống Lan Hồ Điệp Phalaenopsis sp kỹ thuật ni cấy ngập chìm tạm thời TIS (Temporary Immersion System) Đối tượng phạm vi nghiên cứu Đề tài nghiên cứu nồng độ khoáng đa lượng môi trường MS ảnh hưởng nồng độ loại đường lên nhân nhanh PLB Lan Hồ Điệp Qua khảo sát việc nhân nhanh PLB hệ thống ni cấy ngập chìm tạm thời Plantima Đài Loan đối tượng Phalaenopsis Dtps Taida Salu Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài nghiên cứu Ý nghĩa khoa học: Hệ thống ni cấy ngập chìm tạm thời TIS thuộc dạng bioreator đơn giản Nhiều nghiên cứu giới xác định việc áp dụng công nghệ TIS vi nhân giống trồng mang lại hiệu kinh tế cao, chất lượng giống tốt, nâng cao hệ số nhân chồi gấp - 20 lần so với phương pháp nhân truyền thống, rút ngắn thời gian nuôi cấy phịng, góp phần làm giảm giá thành sản phẩm giống Ý nghĩa thực tiễn: Áp dụng hệ thống TIS vi nhân giống hoa Lan nước ta cơng nghệ mới, mở triển vọng cho việc sản xuất giống theo qui mô công nghiệp, đáp ứng đủ lượng trồng với chất lượng cao cho sản xuất nước cho xuất SVTH: Ưng Thị Mỹ Tiên MSSV: 0811110086 Khóa Luận Tốt Nghiệp GVHD: Th.S Trịnh Thị Lan Anh Cây Lan giống sản xuất hệ thống TIS nước giúp người nông dân chủ động sản xuất, hạn chế nhập giống từ nước ngồi, góp phần ngăn chặn dịch bệnh lây lan từ nước qua đường giống Phương pháp nghiên cứu Sử dụng phương pháp nuôi cấy PLB hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời, nghiên cứu giống Lan Hồ Điệp chủ yếu giống (Dtps Taida Salu) giống (Dtps Taida Firebird) Thí nghiệm bố trí kiểu đầy đủ ngẫu nhiên hồn tồn SVTH: Ưng Thị Mỹ Tiên MSSV: 0811110086 Khóa Luận Tốt Nghiệp GVHD: Th.S Trònh Thò Lan Anh CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu sơ lược kỹ thuật nuôi cấy in vitro 1.1.1 Lịch sử thành tựu đạt nuôi cấy in vitro Năm 1838, hai nhà sinh vật học người Đức, Schleiden Schwanm đưa thuyết tế bào nêu rõ thể sinh vật có phức tạp tới đâu có cấu tạo đơn vị nhỏ tế bào Năm 1902, Haberlandt thực nuôi cấy tế bào thực vật từ số mầm như: Errythronium, Orrnithogalum… Năm 1922, Kotte Robins lập lại thí nghiệm Haberlandt đỉnh sinh trưởng rễ hịa thảo, mơi trường lỏng có muối khống glucose Tuy nhiên sinh trưởng kéo dài thời gian ngắn Năm 1934, White Gautheret nuôi cấy thành công rễ cà chua mơi trường muối khống dịch chiết nấm men Cùng thời điểm Nobecourt Gautheret trì sinh trưởng mô sẹo cà rốt Năm 1951, Skoog Miller phát hợp chất điều khiển nhân chồi Năm 1955, chất kích thích phân bào Skoog đặt tên kinetin gộp với chất kích thích phân bào tự nhiên gọi cytokinin Năm 1956, Morel, học trị Gautheret, áp dụng thành cơng ni cấy mơ vào Lan (Cymbidium) tạo protocorm Năm 1960 – 1964, Morel cho nhân giống vơ tính Lan ni cấy đỉnh sinh trưởng Từ kết đó, Lan xem ni cấy mơ thương mại hóa SVTH: Ưng Thị Mỹ Tiên MSSV: 0811110086 Khóa Luận Tốt Nghiệp GVHD: Th.S Trònh Thò Lan Anh Đến nay, hầu hết giống Lan nhân giống nhanh phương pháp nuôi cấy mô như: Dendrobium, Cattleya, Phalaenopsis, Ngọc Điểm Lan Hài tiếng Việt Nam 1.1.2 Các bước nhân giống in vitro Nhân giống vơ tính trồng in vitro gồm giai đoạn sau: - Chọn lựa khử trùng mẫu cấy - Tạo thể nhân giống in vitro - Nhân giống in vitro - Tái sinh in vitro hoàn chỉnh - Chuyển in vitro vườn ươm 1.1.3 Các kỹ thuật nuôi cấy in vitro 1.1.3.1 Nuôi cấy nốt đơn thân Sử dụng mẫu cấy chồi chồi bên có mang đoạn thân ngắn Chồi kích thích tăng trưởng, rễ tạo nguyên vẹn, nhiều chồi hình thành Tiếp tục cấy chuyền mơi trường dinh dưỡng thích hợp đến đủ số lượng chồi cần thiết để chúng cảm ứng rễ trở thành hoàn chỉnh chuyển trồng đất 1.1.3.2 Nuôi cấy chồi bên Về nguyên tắc, phương pháp giống phương pháp nuôi cấy nốt đơn thân Nhưng khác phương pháp ni cấy nốt đơn thân có kéo dài chồi, thân thường không cần đến cytokinin để phát triển Còn phương pháp nhân chồi bên, chồi cô lập môi trường dinh dưỡng chồi bên từ nách phát triển tác dụng cytokinin nồng độ cao Vai trò cytokinin lúc hạn chế ưu tính chồi bên phát triển 1.1.3.3 Ni cấy đỉnh sinh trưởng Chồi rửa khử trùng cồn, hypochlorite SVTH: Ưng Thị Mỹ Tiên MSSV: 0811110086 Khóa Luận Tốt Nghiệp GVHD: Th.S Trịnh Thị Lan Anh calcium Sau dùng dao mổ tách rời đỉnh sinh trưởng (gồm vùng mô phân sinh phần ngọn) khỏi cấy môi trường tái sinh hoàn chỉnh Với phương pháp này, tạo bệnh, virus 1.1.3.4 Nuôi cấy mô sẹo Tạo mô sẹo tiến hành lần vào năm 1920, mô sẹo khối tế bào khơng có tổ chức, hình thành từ mơ quan phân hố điều kiện đặc biệt (vết thương, xử lý hoá chất, tia phóng xạ, ) Các tế bào mơ sẹo phải chịu phản phân hoá trước lần phân chia (Halperin, 1969) Mô sẹo tăng trưởng nhanh môi trường có chất auxin mơi trường khơng có chất kích thích mơ sẹo tái sinh thành hồn chỉnh Cụm mơ sẹo tái sinh lúc nhiều chồi nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, khả bị biến dị tế bào soma lại cao 1.1.3.5 Nuôi cấy huyền phù tế bào Huyền phù tế bào tạo từ mảnh mô sẹo nuôi cấy môi trường lỏng lắc liên tục Trong mơi trường lỏng, mơ sẹo phóng thích tế bào riêng lẻ hay cụm tế bào dính để hấp thụ chất dinh dưỡng Sau tế bào chuyển sang mơi trường đặc để tái sinh thành 1.1.3.6 Nuôi cấy thể đơn bội Cây thể đơn bội mang nhiễm sắc thể giảm nửa, sử dụng phần sau cho việc nuôi cấy in vitro: - Túi phấn: Thu túi phấn từ chồi hoa khử trùng chồi hoa Cịn thu túi phấn hoa nở phải khử trùng túi phấn - Hạt phấn: Được nuôi cấy môi trường để tạo mô sẹo - Cụm hoa: Thường ni cấy mơi trường lỏng SVTH: Ưng Thị Mỹ Tiên MSSV: 0811110086 Khóa Luận Tốt Nghiệp GVHD: Th.S Trịnh Thị Lan Anh 1.1.3.7 Ni cấy protoplast (tế bào trần) Tế bào thực vật xử lý hố lý để tách lớp vỏ cenlulose, cịn giữ chức tế bào Trong mơi trường thích hợp, protoplast phân chia tế bào hay tái sinh thành (Nguyễn Đức Lượng, 2002) Với cách nuôi cấy này, ta áp dụng để chuyển gene vào tế bào trần hay tạo đa bội cách dung hợp hai tế bào trần với 1.1.4 Ưu nhược điểm kỹ thuật nhân giống in vitro 1.1.4.1 Ưu điểm Thuận lợi phương pháp vi nhân giống môi trường bán rắn so với phương pháp nhân giống truyền thống (giâm, chiết, ghép ) là: - Những nhân giống in vitro đồng di truyền - Có khả tái sinh từ vùng mô quan khác như: trục thân, lóng thân, phiến lá, cuống lá, hoa, chồi phát hoa, hạt phấn… mà tự nhiên thực - Hệ số nhân cao, sản xuất số lượng lớn giống thời gian ngắn nhằm đáp ứng nhu cầu thương mại - Được nuôi cấy điều kiện vô trùng, khỏe mạnh, virus thông qua xử lý nhiệt hay nuôi cấy đỉnh sinh trưởng - Sản xuất quanh năm chủ động kiểm soát yếu tố ngoại cảnh nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm… - Tạo có khả hoa, tạo sớm - Tạo dịng tồn (cây chà là) tồn đực (cây măng tây) theo mong muốn - Dễ dàng tạo giống trồng phương pháp chuyển gen SVTH: Ưng Thị Mỹ Tiên MSSV: 0811110086 Khóa Luận Tốt Nghiệp GVHD: Th.S Trịnh Thị Lan Anh Ngồi ra, phương pháp vi nhân giống giảm nhiều cơng sức chăm sóc, nguồn mẫu dự trữ lâu dài chiếm khơng gian so với phương pháp nhân giống truyền thống 1.1.4.2 Nhược điểm Dễ xuất biến dị soma q trình ni cấy, đặc biệt tái sinh qua mơ sẹo Q trình nhân giống phức tạp gồm nhiều giai đoạn liên quan cần khoảng thời gian dài trước thích ứng trồng ngồi vườn ươm Nhân giống mơi trường bán rắn có giá thành sản xuất cịn cao (do sử dụng agar) thời gian cấy chuyền dài Khi sản xuất qui mơ cơng nghiệp, chi phí cho lượng nhân cơng cịn lớn Sự đa dạng dòng sản phẩm nhân giống hạn chế cụ thể loài ngũ cốc tái hình thành in vitro thường khó xảy ra, đặc biệt với thân gỗ 1.2 Tình hình sản xuất hoa Lan giới Việt Nam 1.2.1 Tình hình sản xuất hoa Lan giới Hiện nhu cầu hoa Lan thị trường giới lớn, ngày tăng mang lại lợi nhuận kinh tế cao Tỷ lệ hàng năm ngành sản xuất hoa giới 10%, đạt khoảng 40 tỉ USD Trong năm 2000, kim ngạch xuất nhập Lan cắt cành Lan giới đạt 150 triệu USD, Lan cắt cành đạt 128 triệu USD Thị trường tiêu thụ hoa Lan Châu Âu hấp dẫn Năm 2006, khối EU có sản lượng xuất hoa Lan giới đạt 55 tỉ sản phẩm, mang lại giá trị kim ngạch xuất hoa Lan 73 EUR Trong đó, Hà Lan quốc gia Châu âu có cơng nghiệp trồng Lan xuất khẩu, trồng nhà kính nên Hà Lan xuất hoa quanh năm, đồng thời đầu mối trung gian nhập hoa Lan (37%) từ nước khác giới Năm SVTH: Ưng Thị Mỹ Tiên MSSV: 0811110086 Khóa Luận Tốt Nghiệp GVHD: Th.S Trịnh Thị Lan Anh 2006, Hà Lan xuất hoa Lan chiếm 95% (52.049 ngàn sản phẩm) tổng sản lượng hoa Lan khối EU (Nguồn: AIPH/Union Fluer: International Statistics Flowers an Plants 2007) Mặc dù, khối châu Âu có sản lượng xuất hoa Lan cao so với khối khác nhu cầu tiêu thụ hoa Lan khối EU cao nên năm 2006 sản lượng nhập hoa Lan từ nước lên tới 155 tỉ sản phẩm, giá trị kim ngạch nhập đạt gần 90 tỉ EUR (Nguồn: AIPH/Union Fluer: International Statistics Flowers an Plants 2007) Hoa Lan mặt hàng xuất chiến lược, mang lại nguồn lợi kinh tế cho nhiều quốc gia Châu Á Thái Lan nước xuất chủ yếu hoa Lan nhiệt đới, đặc biệt Dendrobium, phổ biến Dendrobium sonia Jumbo White Ngồi cịn số lồi tiếng khác Aranda, Mokara, Vanda Oncidium Hơn 80% Dendrodium thị trường giới từ Thái Lan Chỉ với loại hoa Lan chủ lực Dendrobium, Thái Lan đạt doanh thu năm gần 600 triệu USD từ giá trị xuất loại hoa Trong đó, Đài Loan nước đứng đầu giới sản xuất xuất hoa Lan Hồ Điệp qui trình cơng nghệ cao, giá trị doanh thu từ xuất loại hoa hàng năm khoảng 43 triệu USD Trên thị trường giới, sản phẩm chủ yếu hoa Lan Hồ Điệp hoa chậu, sản phẩm có giá trị kinh tế cao gấp nhiều lần so với Lan Hồ Điệp cắt cành Hàng năm, Đài Loan sản xuất 36 triệu cành Phalaenopsis Trong đó, 12 triệu cành hoa Lan xuất nước như: triệu cành đến Nhật Bản; triệu cành đến Trung Quốc; 2,5 triệu cành tới Hoa Kỳ 3,5 triệu cành cho quốc gia khác Vào tháng 6/2004, Hoa Kỳ cấp giấy phép xuất Phalaenopsis cho Đài Loan thị trường Hoa Kỳ (Nguồn: The world’s fascination with potted orchid- Floraculture Itn.htm) SVTH: Ưng Thị Mỹ Tiên 10 MSSV: 0811110086 ... mơi trường thích hợp cho rễ chồi Lan Hồ Điệp nhằm thiết lập nhân nhanh giống Lan Hồ Điệp Phalaenopsis sp kỹ thuật ni cấy ngập chìm tạm thời TIS (Temporary Immersion System) Đối tượng phạm vi nghiên... pháp nuôi cấy PLB hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời, nghiên cứu giống Lan Hồ Điệp chủ yếu giống (Dtps Taida Salu) giống (Dtps Taida Firebird) Thí nghiệm bố trí kiểu đầy đủ ngẫu nhiên hồn tồn... Th.S Trịnh Thị Lan Anh   Hình 3.7 Sự sinh trưởng phát triển Lan Hồ Điệp bình Plantima a, b,c: Chồi Lan ni cấy hệ thống Plantima d: Chồi Lan sau tuần nuôi cấy hệ thống Plantima e: Chồi ban đầu,