Thu nhận bột đạm giàu astaxanthin từ phế liệu đầu tôm sú bằng protease và lipase kết hợp

ĐỒN THANH NIÊN CỘNG SẢN HỒ CHÍ MINH BAN CHẤP HÀNH TP.HỒ CHÍ MINH - CƠNG TRÌNH DỰ THI GIẢI THƯƠNG SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ERUKA LẦN THỨ XX NĂM 2018 TÊN CÔNG TRÌNH: THU NHẬN BỘT ĐẠM GIÀU ASTAXANTHIN TỪ PHẾ LIỆU ĐẦU TÔM SÚ BẰNG PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG PROTEASE VÀ LIPASE KẾT HỢP LĨNH VỰC NGHIÊN CỨU: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM CHUYÊN NGÀNH: KHOA HỌC THỰC PHẨM – DINH DƯỠNG Mã số cơng trình………………………… MỤC LỤC MỞ ĐẦU ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED 1.ĐẶT VẤN ĐỀ Error! Bookmark not defined MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU VỀ TÔM SÚ PENAEUS MONODON 1.1.1 Cấu tạo đặc điểm sinh học tôm sú 1.1.2 Tình hình ni đánh bắt tôm Việt Nam .5 1.1.3 Phế liệu tôm hướng tận dụng sản xuất 1.2 Astaxanthin, carotenoprotein động vật thủy sản số phương pháp chiết rút 1.2.1 Astaxanthin 1.2.2 Carotenoprotein 14 1.2.3 Một số phương pháp chiết rút carotenoprotein từ phế liệu chế biến động vật giáp xác 16 1.3 Giới thiệu enzyme tính chất ứng dụng CNTP 20 1.3.1 Giới thiệu chung enzyme protease .21 1.3.2 Yếu tố ảnh hưởng hoạt độ enzyme 22 1.3.3 Enzyme Lipase 22 1.4 Quá trình thuỷ phân protein 28 1.4.1 Khái niệm chất trình thuỷ phân protein: 28 1.4.2 Các phương pháp thuỷ phân protein 29 CHƯƠNG 33 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU 33 2.1.1 Đầu tôm: 33 2.1.2 Enzyme Protease 33 2.1.3 Enzyme Lipase: 33 2.1.4 Hóa chất: 34 2.2 Nội dung phương pháp nghiên cứu 34 2.2.1 Nội dung nghiên cứu 34 2.2.2 Bố trí thí nghiệm thủy phân phế lệu đầu tơm sú enzyme Alcalase Lipase kết hợp 36 2.3 Các phương pháp phân tích dùng nghiên cứu 49 2.4 Phương pháp xử lí số liệu 49 CHƯƠNG 51 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .51 3.1 Thành phần phế liệu đầu tôm 51 3.2 Xác định pH đẳng điện dịch thủy phân phế liệu đầu tôm 52 3.3 Khảo sát trình thủy phân đầu tôm sú Alcalase LFG 2.4 1128 55 3.3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến trình thủy phân đầu tôm sú Alcalase 55 3.3.2 Ảnh hưởng nồng độ enzyme đến trình thủy phân phế liệu đầu tôm Alcalase 61 3.4 Khảo sát q trình thủy phân đầu tơm sú Lipase L3126 67 3.4.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến q trình thủy phân đầu tơm sú Lipase .67 3.4.2 Ảnh hưởng nồng độ enzyme lipase đến q trình thủy phân đầu tơm sú lipase 72 3.5 Hiệu suất thu hồi protein astaxanthin cho thủy phân sử dụng kết hợp Alcalase LFG 2.4 1128 Lipase l3126 77 3.5.1 Tổng hiệu suất thu hồi protein sử dụng kết hợp Alcalase Lipase Error! Bookmark not defined 3.5.2 Tổng hiệu suất thu hồi astaxanthin sử dụng kết hợp Alcalase Lipase Error! Bookmark not defined 3.6 Đánh giá sơ chất lượng bột nhão .78 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 82 KIẾN NGHỊ .85 TÀI LIỆU THAM KHẢO 86 PHỤ LỤC A .1 PHỤ LỤC B .16 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Sản Lượng Ni Trồng Thủy Sản Việt Nam Tính Đến Năm 2016 Hình 1.2 Cấu Trúc Hóa Học Của Một Số Carotenoid (Melba Và Cộng Sự, 2001) Hình 1.3 Quy Trình Chiết Rút Astaxanthin Từ Vỏ Tơm Sú Tươi Của Trần Ngọc Châu ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED Hình 1.4 Quy Trình Tách Chiết Astaxanthin Từ Phế Liệu Vỏ Tơm Của Ks.Nguyễn Văn Ngoạn ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED Hình 2.1 Nội Dung Nghiên Cứu .35 Hình 3.1 Hàm Lượng Protein Hòa Tan Trong Dịch Trong Sau Li Tâm Và Khi Kết Tủa Ở Các Giá Trị Ph Khác Nhau 54 Hình 3.2 Hàm Lượng Astaxanthin Trong Dịch Trong Sau Li Tâm Và Khi Kết Tủa Ở Các Giá Trị Ph Khác Nhau 54 Hình 3.2 Biến Đổi Hàm Lượng Protein Hòa Tan Trong Dịch Thủy Phân Theo Thời Gian Ở Các Nhiệt Độ Khác Nhau .56 Hình 3.3 Hiệu Suất Thu Hồi Protein Theo Thời Gian Ở Các Nhiệt Độ Khác Nhau 58 Hình 3.4 Hàm Lượng Astaxanthin Thu Được Theo Thời Gian Thủy Phân Ở Các Nhiệt Độ Khác Nhau 59 Hình 3.5 Hiệu Suất Thu Hồi Astaxanthin Theo Thời Gian Ở Các Nhiệt Độ Khác Nhau 60 Hình 3.6 Biến Đổi Hàm Lượng Protein Hòa Tan Trong Dịch Thủy Phân Theo Thời Gian Ở Các Nồng Độ Khác Nhau .62 Hình 3.7 Hiệu Suất Thu Hồi Protein Theo Thời Gian Ở Các Nồng Độ Khác Nhau 63 Hình 3.8 Hàm Lượng Astxanthin Thu Được Theo Thời Gian Ở Các Nồng Độ Enzyme Khác Nhau 65 Hình 3.9: Hiệu Suất Thu Hồi Astaxanthin Theo Thời Gian Ở Các Nồng Độ Enzyme Khác Nhau 66 Hình 3.10: Biến Đổi Hàm Lượng Protein Hòa Tan Theo Thời Gian Khi Thủy Phân Với Lipase Ở Các Nhiệt Độ Khác Nhau 68 Hình 3.11: Hiệu Suất Thu Hồi Protein Theo Thời Gian Khi Thủy Phân Với Lipase Ở Các Nhiệt Độ Khác Nhau 69 Hình 3.12: Hàm Lượng Astaxanthin Thu Được Theo Thời Gian Khi Thủy Phân Với Lipase Ở Các Nhiệt Độ Khác Nhau 70 Hình 3.13: Hiệu Suất Thu Hồi Astaxanthin Theothời Gian Khi Thủy Phân Với Lipase Ở Các Nhiệt Độ Khác Nhau 71 Hình 3.14: Biến Đổi Hàm Lượng Protein Hịa Tan Theo Thời Gian Khi Thủy Phân Với Lipase Ở Các Nồng Độ Enzyme Khác Nhau .73 Hình 3.15: Hiệu Suất Thu Hồi Protein Theo Thời Gian Khi Thủy Phân Với Lipase Ở Các Nồng Độ Enzyme Khác Nhau 74 Hình 3.16: Hàm Lượng Astaxanthin Thu Được Theo Thời Gian Khi Thủy Phân Với Lipase Ở Các Nồng Độ Enzyme Khác Nhau 75 Hình 3.17: Hiệu Suất Thu Hồi Astaxanthin Theo Thời Gian Khi Thủy Phân Với Lipase Ở Các Nồng Độ Enzyme Khác Nhau 76 Hình 3.18 Tổng Hiệu Suất Thu Hồi Protein Khi Kết Hợp Hai Enzyme ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED Hình 3.19 Tổng Hiệu Suất Thu Hồi Astaxanthin Khi Sử Dụng Kết Hợp Hai Enzyme ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 2.1 Đă ̣c Tính Của Enzyme Alcalase Lfg 2.4 1128 33 Bảng 2.2 Đă ̣c Tính Của Enzyme Lipase From Porcine Pancreas (L3126) .34 Bảng 3.1 Thành Phần Hóa Học Cơ Bản Của Nguyên Liệu Đầu Tôm P.Monodon 51 Bảng 3.2 Thành Phần Hóa Học Cơ Bản Của Bột Carotenoprotein 79 ĐẶT VẤN ĐỀ LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Ngành chế biế n tôm đông lạnh xuấ t khẩ u Việt Nam những ngành kinh tế mũi nho ̣n, tạo nhiều công ăn viê ̣c làm mang lại nhiều ngoại tê ̣ cho đấ t nước Trong công nghê ̣ chế biế n thủy sản xuấ t khẩ u Viê ̣t Nam, tỷ lê ̣ mă ̣t hàng giáp xác đông lạnh chiế m từ 70 – 80% sản lươ ̣ng chế biế n Trong mă ̣t hàng tôm xuấ t khẩ u chiế m tỷ lê ̣ lớn, 50% tổ ng kim ngạch xuấ t khẩ u Cùng với khối lươ ̣ng tôm xuấ t khẩ u năm thì phế thải liê ̣u bao gồm đầu vỏ tơm cũng lớn Thông thường đầu tôm chiế m 25 – 40% so với khối lươ ̣ng toàn thể với lươ ̣ng tôm xuấ t khẩ u năm 2016 6,7 triê ̣u tấ n sẽ suy đươ ̣c lươ ̣ng phế liê ̣u đầu tôm – triê ̣u tấ n đươ ̣c thải trình chế biế n (Tổng cục thủy sản) Phế liệu đầu tôm sử dụng chủ yếu sản xuất thức ăn gia súc, phần nhỏ để thu nhận chitin chitosan Đây cách giúp mang lại hiệu kinh tế Tuy nhiên, cần thiết để tìm phương hướng sử dụng nguồn phế liệu cách có hiệu hơn, mang lại nhiều lợi ích cao kinh tế, kỹ thuật mơi trường Trong phế liê ̣u đầu tơm có lươ ̣ng lớn protein, chitin, đặc biệt chấ t màu astaxanthin, hợp chất sinh học ngày thu hút ý từ nhà sản xuất chuyên gia sức khỏe Vì nghiên cứu nhằm mục đích thu nhận astaxanthin dạng bột carotenoprotein với hiệu suất thu hồi cao, thiết bị đơn giàn, khơng tốn hóa chất Astaxanthin đươ ̣c biế t đế n chấ t chống oxy hoá mạnh với lươ ̣ng chống oxy hoá gấ p 10 lần so với ß- carotene 500 lần so với vitamin E (Ferreira, 2016) Chính lý này, hiê ̣n nay, chấ t màu này đươ ̣c sử du ̣ng nhiều y ho ̣c, thực phẩ m, mỹ phẩ m thức ăn thuỷ sản, đă ̣c biê ̣t thức ăn cho cá hồi Ống số tương ứng với ống đối chứng chứa nước cấ t Tấ t các ống sau pha đúng nồng độ, để khoảng 20 phút Tiế n hành đo mâ ̣t độ quang dung dich ̣ ở bước sóng 595 nm  Dựng đường chuẩ n Định lượng protein mẫu thí nghiệm Lấ y 1ml mẫu thí nghiê ̣m cho vào ống nghiê ̣m, thêm vào ml thuốc thử Bradford Đem đo mâ ̣t độ quang ở bước sóng 595 nm Từ suy hàm lươ ̣ng protein có mẫu thí nghiê ̣m Mẫu đươ ̣c pha loãng cho mâ ̣t độ quang đo đươ ̣c khoảng đường chuẩ n 2.4 Tính tốn kết Từ phương trình đường ch̉ n và mâ ̣t độ quang mẫu khảo sát ta suy hàm lươ ̣ng protein mẫu là X (µg/ml) có m (g) ngun liê ̣u Vâ ̣y lươ ̣ng protein có gam nguyên liê ̣u là: Hàm lươ ̣ng protein (mg/g) = X 1000.m Xác định hàm lượng astaxanthin theo phương pháp Tolasa Mẫu tôm (hoă ̣c bột carotenoprotein) đươ ̣c chiế t ba lần acetone với tỉ lê ̣ mẫu: acetone 1:5 Để tách các thành phần tan nước, dich ̣ chiế t acetone đươ ̣c bổ sung hexane với tỉ lê ̣ gấ p lần mẫu và đưa vào phễu chiế t, thêm 0.5g NaCl, Na2SO4 và thêm 20ml nước cấ t, lắ c nhẹ phễu chiế t và để yên bóng tối đế n pha tách hoàn toàn Lớp hexane phía đươ ̣c tách và đinh ̣ mức lên 10ml, đo độ hấ p thu ̣ ở bước song 470nm thiế t bi ̣đo UV – Vis Hàm lươ ̣ng astaxanthin đươ ̣c xác đinh ̣ dựa vào đường chuẩ n astaxanthin 0.5µmol/ml Xác định hàm lượng lipid tổng theo phương pháp Soxhlet 4.1 Nguyên lí Dùng dung mơi kỵ nước trích ly hồn tồn lipid từ ngun liệu nghiền nhỏ Hàm lượng lipid tổng tính tốn cách cân trực tiếp lượng dầu sau chưng cất loại dung môi tính gián tiếp từ khối lượng bã cịn lại 4.2 Dụng cụ, hóa chất thiết bị  Dụng cụ thiết bị  Tủ hút ẩm  Tủ sấy  Cân  Bộ Soxhlet  Cốc đốt 100ml  Giấy gói mẫu  Kẹp inox  Hóa chất  Na2SO4  Ether ethylic ether dầu hỏa 4.3 Tiến hành  Chuẩn bị túi bột trích ly  Chuẩn bị tờ giấy xốp có kích thước 10x15cm Cuộn lại thành ống hình trụ có đường kính khoảng 2,5 cm (tùy theo đường kính bầu chiết) Gấp kín đầu làm đáy, lót vào bơng gịn cho kín Sấy giấy xốp đến trọng lượng không đổi  Sấy khô nguyên liệu đến khối lượng khơng đổi Cân xác khoảng 5g mẫu thử nghiền nhỏ đồng đều, cho vào bao giấy sấy khô biết trước khối lượng Dùng bút chì viết lên bao giấy khối lượng bao bì mẫu  Tiến hành trích ly  Cho bao giấy vào ống chiết hệ thống Soxhlet, lắp trụ chiết vào bình cầu gắn ống sinh hàn Qua ống sinh hàn, dùng phễu cho dung môi vào trụ chiết cho lượng dung mơi chảy xuống bình cầu lượng phễu chiết đủ ngập mẫu Dùng làm nút đầu ống sinh hàn Mở nước lạnh vào ống sinh hàn, mở công nguồn nhiệt để bắt đầu q trình trích ly lipid Điều chỉnh nhiệt độ trích ly lipid cho chu kỳ hồn lưu dung môi đạt từ – lần Chiết từ – 12 trích ly hồn tồn hết chất béo Khi ngưng hoạt động hệ thống Soxhlet phải đảm bảo gói giấy lúc ngập ether Để biết trình chiết hồn tất xong chưa, lấy vài giọt ethet ống chiết nhỏ lên mặt kính đồng hồ lên mảnh giấy lọc, sau cho bay hết ether, mặt kính khơng có vết loang xem chiết xong chất béo khỏi mẫu thử  Khi ether chảy xuống hết bình cầu, lấy bao giấy khỏi ống chiết Soxhlet, đặt vào tủ Hotte để làm bay hết ether cho vào tủ sấy 100 – 1050C 30 phút Để nguội mẫu chiết bình hút ẩm 30 – 35 phút Xác định khối lượng cân 4.4 Tính tốn X = ((P – P1) *100)/G P: khối lượng giấy xốp mẫu khô trước chiết chất béo (g) P1: khối lượng giấy xốp bã sau chiết chất béo (g) G: khối lượng mẫu thực phẩm đem phân tích (g) Xác định hàm lượng tro phương pháp trọng lượng, nung 6000C 5.1 Nguyên tắc Dùng sức nóng (550 - 6000C) nung cháy hồn tồn chất hữu Phần cịn lại đem cân tính phần trăm tro có thực phẩm 5.2 Dụng cụ hoá chấ t  Dụng cụ  Lò nung 10  Cân phân tích  Bình hút ẩm  Chén nung sứ  Đèn cồn hay bếp điện  Hóa chất  HNO3 đâ ̣m đă ̣c  H2 O2 5.3 Tiến hành  Nung chén sứ rửa lò nung 550 - 6000C đến lượng không đổi Để nguội bình hút ẩm cân cân phân tích xác đến 0,0001g  Cho vào chén sứ khoảng 5g mẫu thử Cân tất phân tích với độ xác Cho tất vào lò nung nâng nhiệt độ từ từ 550 - 6000C  Nung tro trắng, nghĩa loại hết chất hữu cơ, thường khoảng -  Trường hợp tro đen, lấy để nguội, cho thêm vài giọt H2O2  HNO3 đậm đặc nung lại đến tro trắng  Để nguội bình hút ẩm cân đến độ xác Tiếp tục nung thêm nhiệt độ 30 phút để nguội bình hút ẩm cân lượng khơng đổi 5.4 Tính toán: Hàm lươ ̣ng tro tở ng số X, đươ ̣c biểu thi ̣ phần trăm khối lươ ̣ng, đươ ̣c tính theo cơng thức: X = ((G2 – G) *100) / (G1 – G) Trong đó: 11 G: khối lươ ̣ng chén nung (g) G1: khối lươ ̣ng chén nung và mẫu trước nung (g) G2: khối lươ ̣ng chén nung mẫu sau nung (g) Xác định độ ẩm phương pháp trọng lượng, sấy đến độ ẩm khơng đổi 1050C 6.1 Ngun lí Dùng sức nóng làm bay lượng nước tự mẫu Cân trọng lượng mẫu trước sau sấy khô, từ tính phần trăm nước có mẫu thực phẩm 12 6.2 Dụng cụ, thiết bị  Dụng cụ thiết bị  Tủ sấy  Cân phân tích  Bình hút ẩm  Chén sứ  Đũa thủy tinh 6.3 Tiến hành  Lấy chén sứ đem sấy 1050C trọng lượng không đổi, để chén trogn bìn hút ẩm đến nguội (20 – 25 phút) cân chén sứ (chính xác đến 0.001g)  Cho vào chén xác khoảng 2g mẫu Sấy 1050C đến trọng lượng không đổi, thời gian sấy Sấy xong, làm nguội chén sứ bình hút ẩm (20 – 25 phút) cân  Tiến hành hai mẫu song song, sai số hai lần cân không 0.5% Kết cuối trung bình cộng kết hai lần xác định song song Tính xác đến 0.01% 6.4 Tính tốn Hàm lượng ẩm tính theo cơng thức: X = ((G1 – G2) *100)/ (G1 – G) Trong đó: G: trọng lượng chén sứ khơng đổi (g) G1: trọng lượng chén sứ mẫu trước sấy (g) 13 G2: trọng lượng chén sứ mẫu sau sấy tới trọng lượng không đổi (g) Xác định hàm lượng protein tổng theo phương pháp Kjeldahl 7.1 Ngun lí Vơ hóa mẫu acid sulfuric đậm đặc với có mặt chất xúc tác Sau đó, tiến hành kiềm hóa sản phẩm phản ứng Tiếp theo, chưng cất chuẩn độ lượng amoniac giải phóng ra, từ tính đƣợc hàm lượng nitơ tổng số mẫu Để tính hàm lượng protein thơ, lấy giá trị hàm lượng nitơ tổng số nhân với hệ số 6,25 7.2 Dụng cụ, thiết bị hóa chất  Dụng cụ thiết bị  Bộ chưng cất đạm Kjeldahl tự động, Đức  Các dụng cụ thủy tinh chưng cất đạm kèm theo số dụng cụ thủy tinh khác ống đong, bình định mức, cốc chịu nhiệt Đức  Hóa chất  H2SO4 đậm đặc  HCl 0.02N  HCl 0.1N  Dung dịch NaOH 40%  Hỗn hợp xúc tác K2SO4 CuSO4 (5:1)  Dung dịch H3BO3 4%  Thuốc thử tashiro (2g metyl xanh: 1g metyl đỏ pha 1000ml cồn 96o) 7.3 Tiến hành 14  Vơ hóa mẫu: Cân lượng mẫu từ 0,2 – 1g cho vào ống Kjeldahl Thêm khoảng 0,5-1g xúc tác (hỗn hợp K2SO4:CuSO4 theo tỉ lệ 5:1) Cho vào ống khoảng 12 ml acid sulfuric đậm đặc Đặt ống Kjeldahl vào hệ thống phá mẫu Cài đặt nhiệt độ thời gian cho máy, thời gian vô hóa mẫu khoảng từ – Khi giai đoạn hoàn tất, chất lỏng ống có màu xanh da trời nhạt có màu trắng Nếu thấy ống số cặn rắn thêm nước cất vào lắc  Chưng cất amoniac: Đặt ống Kjeldahl vô hóa vào hệ thống chưng cất Thời gian chưng cất mẫu khoảng phút Thêm giọt thị Tashiro vào bình hấp thụ tiến hành chưng cất  Chuẩn độ lượng amoniac hấp thụ: tiến hành chuẩn độ dung dịch HCl 0,02N Dấu hiệu ngừng chuẩn độ màu dung dịch chuẩn độ chuyển từ màu xanh dương sang màu mận đỏ 7.4 Tính tốn Hàm lượng nitơ mẫu thử xác định theo công thức sau: WN (%) = ((V1 – Vo) * C * 100)/ M Trong đó: WN: hàm lượng nitơ tổng số mẫu (%) V1: thể tích dung dịch HCl 0,1N dùng để chuẩn độ mẫu thử (ml) Vo: thể tích dung dịch HCl 0,1N dùng để chuẩn độ mẫu trắng (ml) M : khối lượng mẫu đem phân tích (g) C: Nồng độ HCl dung để chỉnh độ 15 Hàm lượng protein thô mẫu thử xác định theo công thức sau: WProtein (%) = 6,25* WN Trong đó: WN: hàm lượng nitơ tổng số mẫu (%) WProtein: hàm lượng protein thô mẫu (%) 16 PHỤ LỤC B KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Bảng 3.1 Kết khảo sát xác định điểm pI pH A Hàm lượng protein Hàm lượng hòa tan astaxanthin 0,08 ± 0,02 0,4 ± 0,02 4.5 0,03 ± 0,02 0,64 ± 0,04 0,04 ± 0,02 0,6 ± 0,06 5.5 0,09 ± 0,04 0,5 ± 0,01 0,11 ± 0,05 0,33 ± 0,3 Các bảng số liệu thủy phân dùng Alcalsase LFG 2.4 1128 Bảng 3.2 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ enzyme đến hàm lượng protein hòa tan 0h 1h 2h 3h 4h 5h 0,10% 1,97±0,08cd 2,61±0,10f 2,96±0,11d 2,82±0,03d 2,54±0,01e 2,23±0,00f 0,20% 1,98±0,02cd 2,93±0,00e 4,18±0,12c 3,38±0,03c 3,11±0,04d 2,93±0,02e 0,30% 2,09±0,02bc 3,13±0,00d 4,43±0,05c 3,50±0,02c 3,30±0,02c 3,15±0,01d 0,40% 2,17±0,08b 3,72±0,04b 5,05±0,02b 4,15±0,13b 3,72±0,02b 3,39±0,01b 0,50% 2,44±0,05a 4,12±0,01a 5,70±0,17a 4,83±0,14a 4,58±0,03a 3,82±0,04a 0,60% 1,92±0,06c 3,45±0,05c 5,12±0,03b 4,12±0,03b 3,76±0,02b 3,25±0,02c Các gía trị trung bình cột có ký tự khác khác biệt có nghĩa mặt thống kê (p