Nghiên cứu quy trình tạo sinh khối chủng bacillus subtilis

Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện ĐẶT VẤN ĐỀ Trong q trình ni trồng thủy sản, lượng thức ăn thừa chất thải hữu thải môi trường nuôi lớn Các hợp chất hữu nhân tố kích thích phát triển VSV gây ô nhiễm ao nuôi làm cân hệ sinh thái ao Mặt khác, trình phân hủy không triệt để hợp chất hữu từ thức ăn thừa, chất thải xác động vật nuôi sinh số chất độc Một số hợp chất độc (NH3, H2S, CH4…) phát triển mức VSV khơng có lợi mơi trường ni làm giảm chất lượng nước dẫn đến tăng stress tăng khả nhiễm bệnh, tơm cá phát triển cịi cọc tỷ lệ chết tăng cao Trước đây, người ta thường dùng chất kháng sinh để phòng trị bệnh cho gia súc, gia cầm tôm cá Việc sử dụng kháng sinh thời gian dài để lại nhiều hậu không mong muốn kháng thuốc vi khuẩn rối loạn hệ vi sinh vật đường ruột dẫn đến khó điều trị Nghiêm trọng tồn dư kháng sinh thịt động vật dẫn đến việc hạ giá thành sản phẩm, gây cản trở cho việc xuất làm thiệt hại lớn chăn ni Do đó, để khắc phục tình trạng này, biện pháp giải vấn đề ô nhiễm môi trường nuôi trồng thủy sản sử dụng phương pháp bền vững thân thiện với mơi trường Trong đó, phương pháp sinh học lựa chọn ưu tiên hàng đầu Thông qua sử dụng chế phẩm sinh học chất ô nhiễm giảm thiểu tối đa trả lại cân sinh thái cho môi trường Đặc biệt, phương pháp không để lại hậu hay tồn dư sử dụng loại hóa chất thuốc kháng sinh Với xu hướng phát triển khoa học kỹ thuật, tương lai gần chế phẩm sinh học ngày áp dụng rộng rãi Phương pháp sinh học dựa vào trình hoạt động chủng vi sinh vật Các chủng có khả phân hủy hợp chất hữu đơn giản phức hợp nhờ khả tổng hợp enzyme phân hủy hữu (protease, amylase, cellulose…), đồng thời tạo chất đối kháng ức chế VSV gây bệnh Một loài vi sinh vật chứng minh có nhiều khả xử lý ô nhiễm ao nuôi hiệu Bacillus Trong đó, chủng Bacillus subtilis sử dụng phổ biến thủy sản Với nhiều hệ enzyme có tác dụng phân hủy hợp chất hữu thải từ thức ăn thừa phế thải làm giảm tích lũy bùn hữu nên chủng Bacillus subtilis lựa chọn để thực quy trình thu nhận sinh khối nhằm sản xuất chế phẩm sinh học xử lý nước ao nuôi thủy sản SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện Đề tài nghiên cứu điều kiện nguồn dinh dưỡng ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển chủng Bacillus subtilis nhằm rút điều kiện tối ưu cho trình thu nhận sinh khối Nội dung đề tài bao gồm: - Nghiên cứu lựa chọn môi trường nuôi cấy tăng sinh cho chủng Bacillus subtilis - Khảo sát yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển chủng Bacillus subtilis nhiệt độ, pH môi trường - Nghiên cứu nguồn dinh dưỡng cacbon, nitơ muối khoáng - Nghiên cứu khả tạo bào tử Bacillus subtilis - Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian đến tốc độ sinh trưởng cho chủng Bacillus subtilis - Xây dựng quy trình thu nhận sinh khối Bacillus subtilis SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghề ni thủy sản khu vực ĐBSCL Trong năm gần ngành nuôi trồng thuỷ sản (NTTS) đạt thành tựu to lớn, đóng góp đáng kể cho phát triển ngành thuỷ sản nói riêng cho kinh tế quốc dân nói chung Trong hoạt động hỗ trợ cho phát triển ngành nuôi trồng thuỷ sản, chế biến thức ăn, sản xuất giống thuỷ sản, thú y đặc biệt công tác phát triển hệ thống thuỷ lợi không nhắc đến Như biết, hoạt động NTTS Việt Nam chủ yếu tiến hành vùng ĐBSCL - Hình 1.1 Nuôi trồng thủy sản ĐBSCL [18] vùng chiếm phần lớn sản lượng diện tích NTTS nước với tổng diện tích có khả phát triển NTTS tồn vùng khoảng 1.377.800 diện tích đưa vào phát triển NTTS (2005) 709.980 ha, tổng sản lượng NTTS (2005) đạt 1.014.590 chiếm tới 72% tổng sản lượng NTTS tồn quốc Dự tính đến năm 2010 khu vực ĐBSCL nuôi thủy sản nước mặn-lợ 649.430 ha, nuôi trồng thủy sản nước 366.590 [13] Với trạng phát triển hoạt động NTTS vùng ĐBSCL cần có đầu vào tương ứng bao gồm giống, thức ăn đặc biệt nguồn cấp nước thích hợp Điều cho thấy ni trồng thủy sản ngày chiếm vị trí quan trọng phát triển kinh tế xã hội khu vực ĐBSCL 1.2 Ơ nhiễm mơi trường giải pháp xử lý ao ni thủy sản 1.2.1 Tình trạng nhiễm mơi trường Vấn đề nóng bỏng khu vực ĐBSCL ô nhiễm môi trường nước ao nuôi thủy sản Theo đánh giá nhà khoa học, năm nguồn chất thải nuôi trồng thủy sản khu vực ĐBSCL thải khoảng gần 500 triệu m bùn chất thải nuôi trồng thủy sản Riêng chất thải nuôi cá tra, cá ba sa triệu tấn/năm [7] Nguồn chất thải độc hại chưa xử lý triệt để thải vào sông rạch khu vực làm ảnh huởng đến sinh hoạt người dân Ở nhiều địa phương, người dân phải đối mặt với bệnh đường tiêu hóa, bệnh sốt xuất huyết, bệnh suy dinh dưỡng trẻ em SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện ngộ độc thực phẩm hay hóa chất trình sản xuất canh tác vùng đất ngập nước ni trồng thủy sản Do đó, tìm hiểu ngun nhân dẫn đến nhiễm mơi trường nước từ ao nuôi cá tra ĐBSCL cần thiết 1.2.2 Ngun nhân gây nhiễm Tuy có nhiều ngun nhân làm cho mơi Hình 1.2 Ơ nhiễm môi trường ao nuôi cá [16] trường nước sông kênh rạch bị ô nhiễm như: chất thải từ khu công nghiệp, từ sản xuất lúa, từ nuôi thủy sản, chất thải từ sinh hoạt người dân Trong đó, tình trạng nhiễm môi trường nước khu vực nuôi thủy sản vấn đề xúc Nguyên nhân chủ yếu tình trạng lượng thức ăn thừa tích tụ ao gia tăng diện tích ao ni Theo số nghiên cứu cho thấy ô nhiễm tập trung chủ yếu vào dư lượng thức ăn thừa thãi cá, tôm thối rữa bị phân hủy ao nuôi Những chất thải ao nuôi thải ngồi khơng gây dịch bệnh cho vật ni mà cịn tác động tới sức khỏe người qua nguồn nước sinh hoạt Bên cạnh hệ thống thủy lợi phục vụ nuôi thủy sản chưa bảo đảm không tuân thủ qui định bảo vệ môi trường xây dựng hệ thống xử lý nước cấp, nước thải, chất thải từ ao nuôi, không đảm bảo điều kiện vệ sinh thú y nuôi trồng thủy sản, không xây dựng hệ thống ao lắng để xử lý nước trước cho vào ao nuôi xử lý nước thải trước xả sông rạch Điển hình khu vực ni cá tra hầm tiếng dọc bờ sông Tiền, sông Hậu chủ ao đầm xả nước thải ô nhiễm bùn đáy ao sông lại bơm trực tiếp nguồn nước nhiễm vào lại ao ni cá [8] Đứng trước vấn đề ô nhiễm môi trường nuôi trồng thủy sản gây nay, cần phải có biện pháp hữu hiệu để khắc phục nhằm đem lại nguồn nước cho vật nuôi lẫn người 1.2.3 Giải pháp khắc phục Ðể bảo đảm phát triển lợi ngành nuôi trồng thủy sản ÐBSCL nhằm đáp ứng yêu cầu hội nhập quốc tế, cần phải thực biện pháp thích hợp để giải khó khăn nhiễm Hiện nay, có số biện pháp nhằm giảm thiểu ô nhiễm môi trường nước nuôi thủy sản áp dụng giải pháp học, hóa học sinh học SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện 1.2.3.1 Giải pháp học Giải pháp thường dùng dùng bơm để hút ao rải vôi khắp mặt ao dùng hệ thống tái tuần hoàn nước Hệ thống phát triển nhiều nơi chủ yếu để loại bỏ tác nhân gây bệnh virút hệ thống nuôi Chúng mang lại số hiệu định việc giảm lượng nước thải môi trường lượng nước thải vào thuỷ vực lân cận giảm đáng kể [7] Ngồi ra, hệ thống khép kín giúp người NTTS ngăn ngừa chất độc hại tác nhân gây bệnh, thuốc trừ sâu thuốc diệt cỏ Hệ thống tái tuần hồn dùng để tăng cường việc diệt vi khuẩn, giúp loại bỏ chất hữu lơ lửng chất chứa tác nhân gây bệnh hay dư lượng hoá chất Tuy nhiên giải pháp học để hút chất thải ngồi địi hỏi đầu tư lớn chi phí vận hành máy móc tốn việc xử lý chất thải Nếu chất thải không xử lý triệt để dẫn tới nguy phát tán nguồn nhiễm kênh, rạch Do đó, biện pháp học khơng phải giải pháp tồn diện cho vấn đề xử lý ô nhiễm môi trường nước thủy sản 1.2.3.2 Giải pháp hóa học Các hố chất dùng nuôi trồng thuỷ sản bao gồm chất khử trùng, tác nhân kháng khuẩn, thuốc trị bệnh khác Các loại vật tư kiến trúc công trình chất dẻo, phụ gia, chất màu, chất chống ơxy hố, chất chống cháy, diệt nấm, tẩy trùng v.v nhằm kháng cự lại vi khuẩn tồn sẵn có ao Các chất xử lý đất nước phèn (sunfat nhômkali), thạch cao, vôi, EDTA (Axit dinatri ethylendiamintetraacetic), zeolit [7] Khi sử dụng, tác dụng mong muốn, đơn giản, rẻ tiền, hoá chất gây nhiều tác hại ảnh hưởng xấu đến môi trường người Cụ thể chúng bị tồn lưu mơi trường thuỷ sinh, tích tụ dư lượng thuốc kháng khuẩn chất lắng đọng có tiềm ức chế hoạt tính vi khuẩn giảm mức độ phân rã chất hữu Các hố chất gây độc để lại dư lượng sinh vật khơng phải đối tượng ni Do đó, giải pháp sử dụng mang lại nguy hiểm cho thủy sản người tiêu dùng sản phẩm liên quan 1.2.3.3 Giải pháp sinh học Dùng chế phẩm sinh học xử lý nguồn nước ao nuôi cá biện pháp sinh học phổ biến Tuy nhiên, q trình ni cần phải tăng cường sục khí để VSV hữu SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện hiệu phát triển Đồng thời, phải bổ sung thường xuyên VSV hữu hiệu vào ao nuôi để đẩy mạnh q trình phân hủy, VSV có tính đối kháng với VSV gây bệnh Và bổ sung chế phẩm vào thức ăn để tăng cường miễn dịch cho vật nuôi Việc sử dụng chế phẩm sinh học để giải vấn đề nước ao ni cá có thuận lợi khống chế dịch bệnh, tăng sức đề kháng đồng thời cung cấp phương thức an toàn bền vững người nuôi tiêu dùng Dùng chế phẩm sinh học xử lý triệt để thành phần độc hại gây nhiễm có nước thải, chất thải thành chất an toàn sinh thái Các chế phẩm sinh học vi khuẩn yếm khí, hiếu khí, xạ khuẩn, nấm men để xử lý lượng thức ăn dư thừa, chất thải ao nuôi, nguồn bùn cặn đáy ao nuôi v.v [7] Như vậy, để khắc phục vấn đề xử lý nước ao nuôi thủy sản mà không ảnh hưởng xấu đến chất lượng giống giai đoạn q trình ni việc chọn giải pháp để khắc phục cần thiết Trong giải pháp áp dụng nay, phương pháp sinh học quan tâm nhiều nhất, cho hiệu xử lý ô nhiễm cao thân thiện với môi trường Do phương pháp chiếm vai trò quan trọng qui mô giá thành đầu tư, chi phí cho đơn vị khối lượng chất khử Đặc biệt xử lí nước thải biện pháp sinh học không gây ô nhiễm, tái ô nhiễm môi trường 1.3 Một số nguồn dinh dưỡng cần thiết cho sinh trưởng phát triển VSV 1.3.1 Nguồn dinh dưỡng cacbon vi sinh vật Nguồn cacbon có vai trị quan trọng cho sinh trưởng phát triển VSV Chúng vừa nguồn lượng vừa nguồn dinh dưỡng cho thể Mỗi lồi VSV thích hợp với nguồn cacbon khác Do đó, vào nguồn dinh dưỡng cacbon mà người ta chia vi sinh vật thành nhóm khác (bảng 1.1) Như vậy, tùy nhóm vi sinh vật mà nguồn cacbon cung cấp chất vô (CO 2, NaHCO3, CaCO3 ) chất hữu Trong tất nguồn cacbon đơn giản tổng hợp dùng làm nguồn dinh dưỡng cho VSV số nguồn cacbon thay rỉ đường, dịch kiềm sunfit, tinh bột cellulose, dầu thực vật…vv sử dụng phổ biến công nghệ lên men Bảng 1.1 Thành phần nhóm vi sinh vật [5] Nhóm sinh Tự dưỡng SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân Dị dưỡng Hoại sinh Ký sinh Luận văn tốt nghiệp lý VSV Nguồn C GVHD: Nguyễn Văn Nguyện Tự dưỡng Tự dưỡng Dị dưỡng Dị dưỡng quang hóa quang hóa CO2 CO2 Chất hữu Chất hữu Sự trao đổi Nguồn lượng Ánh sáng Một số chất hợp chất chất nguyên Ánh sáng vô đơn sinh giản thể khác Động vật Vi khuẩn Ví dụ VSV Vi khuẩn có nitrate, lưu Vi khuẩn nguyên sắc tố màu huỳnh vô lưu huỳnh sinh, nấm, đỏ màu, vi màu tía số vi khuẩn khuẩn sắt Chất hữu Chất hữu Sự trao đổi Lấy từ tổ chất chức chất nguyên dịch thể sinh xác thể hữu sống VSV gây Nấm, vi bệnh cho khuẩn gây thối, lên men người, động vật, thực vật, virus 1.3.1.1 Rỉ đường: gồm rỉ đường mía rỉ đường củ cải Mật mía mật củ cải đường khơng kết tinh q trình sản xuất đường thường gọi rỉ đường Rỉ đường mía phụ phẩm thu cơng nghiệp ép mía thành đường sau thu saccharose Là hỗn hợp phức tạp Bên cạnh hàm lượng đường lên men cao, rỉ đường chứa lượng đáng kể hợp chất chứa nitrogen, vitamin hợp chất vơ Ngồi cịn chứa số chất keo vi sinh vật tạp nhiễm Do người ta thường xử lý rỉ đường trước dùng làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật Rỉ đường củ cải nước cốt sinh sản xuất đường từ củ cải đường Dịch cô đặc dùng lâu dài Trong rỉ đường ngồi thành phần kích thích sinh trưởng VSV cịn chứa số chất mà dùng nồng độ cao kìm hãm sinh trưởng vi sinh vật SO 2, hydroxylmethylfurfurol…v.v Trong công nghiệp lên men người ta thường dùng cacbon nguồn nguồn rỉ đường chúng rẻ tiền thích hợp sử dụng nhiều loại vi sinh vật khác Mặt khác, rỉ đường có chứa hàm lượng đường cao, chất kích thích sinh trưởng cho VSV SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện Bảng 1.2 Thành phần hoá học rỉ đường mía rỉ đường củ cải [5] Thành phần Tỷ lệ Rỉ đường củ cải Rỉ đường mía (saccharose) (saccharose) Đường tổng số % 48 - 52 48 - 56 Chất hữu khác % 12 - 17 - 12 Protein (N x 6,25) % - 10 2-4 Kali % 2,0 - 7,0 1,5 - 5,0 Canxi % 0,1 - 0,5 0,4 - 0,8 Magie % 0,09 0,06 Photpho % 0,02 - 0,07 0,6 - 2,0 Biotin mg/kg 0,02 - 0,15 1,0 - 3,0 Axit pantotenic mg/kg 50 - 110 15 -55 Inozitol mg/kg 5000 - 8000 2500 - 6000 Tiamin mg/kg 1,3 1,8 3.1.3.2 Tinh bột cellulose Tinh bột sử dụng dạng bột khoai, sắn, lúa chủ yếu người ta hay dùng tinh bột khoai mì Ngồi thành phần dinh dưỡng phù hợp cho trình lên men, tinh bột khoai mì cịn chứa nhiều chất khống kali, natri, photpho, magie sắt [3] Mặt khác, khoai mì dùng làm thực phẩm cho người thường loại thiếu dinh dưỡng, giá thường rẻ loại dễ trồng nên tinh bột mì sử dụng nhiều trình lên men Dạng nguyên liệu trước sử dụng làm môi trường nuôi cấy phải qua khâu xử lý đường hóa Tuy nhiên chủng vi sinh vật có hệ enzym amylase phát triển, người ta sử dụng trực tiếp tinh bột sống khơng qua khâu đường hóa để ni cấy vi sinh vật Thành phần chúng nêu bảng 1.3 Đối với cellulose người ta thường sử dụng dạng rơm, rạ, giấy…Cấu tạo tính chất chúng đặc biệt phức tạp nhằm tạo vững cho cellulose Do đó, việc phân hủy chúng trở nên khó khăn Tuy vậy, cellulose bị phân hủy VSV điều kiện thích hợp phân hủy địi hỏi cần có nhiều loại enzyme khác SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện 1.3.1.3 Dịch kiềm sulfite Là loại phế phẩm công nghiệp sản xuất cellulose Chúng có đặc tính hấp thụ nhiều oxy, nuôi cấy vi sinh vật hiếu khí giảm mức cung cấp oxy tới 60% so với mức bình thường Thành phần chúng gồm 80% chất khô đường hexose (glucose, mannose, galactose), phần cịn lại đường pentose (cylose, arabinose) Ngồi dịch kiềm sulfite có chứa acid ligninsulfuric Acid chưa VSV sử dụng 1.3.1.4 Dầu thực vật Dầu thực vật bao gồm số loại dầu dầu đậu nành, dầu dừa, dầu đậu phộng, dầu hạt bông, dầu hướng dương…v.v Các loại dầu kể dùng cho vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật với chức vừa nguồn cacbon vừa chất phá bọt Nhưng loại dầu có mặt mơi trường có vai trị nguồn cacbon vi sinh vật nuôi cấy sinh enzyme lipase Đồng thời lượng chất béo cho vào môi trường nuôi cấy phải phù hợp với mức độ tạo bọt môi trường bổ sung nhiều làm chậm trình đồng hóa nguồn cacbohydrate VSV làm tăng độ nhớt mơi trường Bảng 1.3 Thành phần hóa học trung bình khoai mì [3] STT Thành phần Đơn vị tính Số lượng Protein % 1,1 Lipid % 0,2 Glucid tổng số % 36,4 Cellulose % 1,5 Tro % 0,8 Kali mg/100g 394 Canxi mg/100g 25,0 Photpho mg/100g 30,0 Sắt mg/100g 1,2 10 Vitamin B1 mg/100g 0,03 11 Vitamin B2 mg/100g 0,03 12 Vitamin PP mg/100g 0,6 mg/100g 34 mg/100g 520 Vitamin SVTH:Huỳnh Thị13Quỳnh Ngân C 14 Axit folic Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện 1.3.2 Nguồn dinh dưỡng nitơ vi sinh vật Nitơ tham gia vào thành phần nhiều vật chất có tế bào protein, enzyme, axit nucleic Đặc biệt chúng có nhiều protein Chúng thường tồn dạng nitơ hữu vô Nguồn nitơ hữu protein thường có phân tử lượng lớn, khó xâm nhập vào tế bào VSV Muốn sử dụng nguồn nitơ VSV phải phân giải chúng thành axitamin Do đó, tế bào nitơ tham gia vào thành phần cấu trúc tạo nên tế bào vi sinh vật, giúp tế bào hoàn thiện chức hoạt động sống Một số nguồn nitơ hữu vô dùng phổ biến ni cấy VSV trình bày bảng 1.4 Bảng 1.4 Một số nguồn nitơ nuôi cấy VSV [5] Nguồn nitơ Đặc điểm Urê Là nguồn thức ăn nitơ trung tính mặt sinh lý, bị phân giải enzim ureaza giải phóng NH3 CO2 NH2 - CO - NH2 + H2O → 2NH3 + CO2 Tan nhiều nước, vừa nguồn cung cấp nitơ vừa có tác dụng điều chỉnh pH Pepton Là loại chế phẩm thuỷ phân không triệt để số loại protein Casein Là phosphoprotein, thành phần có chứa gốc acid phosphoric.Trong dung dịch, casein tạo thành ion lưỡng tính Trong sữa casein dạng canxi caseinat lại kết hợp với canxiphosphat tạo thành phức hợp canxi phosphocaseinat (các mixen) Các casein liên kết với để tạo thành có mặt canxi kết tủa có casein K SVTH:Huỳnh Thị Quỳnhxuống Ngân khơng10 Các muối Ví dụ KNO3, NaNO3…Các muối thích hợp nitrate nhiều loại tảo, nấm sợi xạ khuẩn thích hợp nhiều loại nấm men vi khuẩn Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện mật độ quang xác định số lượng tế bào khuẩn lạc nguồn nitơ có độ hấp thu cao phương pháp đổ đĩa thạch 2.5.7 Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ muối lên sinh trưởng phát triển Bacillus subtilis Phương pháp: Được thực theo phương pháp mục 2.5.1 2.5.2 Cách tiến hành: Chuyển 10% giống ni trước 24h vào bình tam giác chứa sẵn 100ml môi trường TCS với nồng độ muối khảo sát :1%, 2%, 3%, 5% Điều chỉnh môi trường pH = trùng chế độ 121 0C 15 phút Sau đó, ni giống 24h máy lắc với tốc độ lắc máy 120v/ph, t = 300C Sau 24h nuôi đem đo độ hấp thu quang xác định số lượng tế bào phương pháp đổ đĩa 2.5.8 Nghiên cứu xây dựng môi trường nuôi cấy cho chủng Bacillus subtilis Phương pháp: Được thực hai phương pháp nêu mục 2.5.1 2.5.2 Cách tiến hành: Môi trường thay chuẩn bị đầy đủ để nuôi cấy chủng Bacillus subtilis ( cho bảng 3.1) với điều kiện tối ưu t = 300C, pH 6,0 Đem trùng môi trường trước cấy giống VSV Chuyển 10% giống vào môi trường thay thế, sau ni máy lắc nhiệt độ 300C; pH 6,0 Sau 24h đo độ hấp thu quang xác định số lượng tế bào kỹ thuật đổ đĩa 2.5.9 Nghiên cứu khả tạo bào tử chủng Bacillus subtilis Phương pháp: Nghiên cứu thực theo phương pháp mục 2.5.1 2.5.2 Cách tiến hành: - Bổ sung 0.01% MnCl2.4H2O vào bình 250ml chứa sẵn giống ni trước 24h Sau đem ni tiếp máy lắc ngày liên tục chế độ 30 0C, tốc độ quay 120v/ph Sau 24h đem đo độ hấp thu quang tiến hành xác định khuẩn lạc Trong ngày cuối SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 29 Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện chuyển 5ml mẫu vào hai ống nghiệm khác Một ống nghiệm đem xác định khuẩn lạc ống lại đem xử lý nhiệt 800C, 10 phút trước xác định khuẩn lạc 2.5.10 Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian đến tốc độ sinh trưởng chủng Bacillus subtilis Phương pháp: Dùng hai phương pháp nêu mục 2.5.1 mục 2.5.2 Cách tiến hành: Chuyển 10% giống cấp lên lít mơi trường lỏng chứa sẵn thiết bị lên men môi trường trùng chế độ 1210C 15 phút Nuôi cấy chủng ngày liên tiếp Sau điểm thời gian 0h, 24h, 36h, 48h 72h đo độ hấp thu quang xác định nồng độ tế bào SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 30 Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Lựa chọn môi trường nuôi cấy: Sau làm thực nghiệm nuôi cấy chủng Bacillus subtilis loại môi trường LB, TCS, TSA Saboraud Liquid Medium thời gian 24 nhiệt độ 30 0C, tiến hành xác định đo độ hấp thu quang dung dịch ni cấy Thí nghiệm lặp lại lần Kết ghi nhận đồ thị 3.1 Hình 3.1: Giống cấy chuyền môi trường thạch Đồ thị 3.1 Lựa chọn môi trường nuôi cấy cho chủng Bacillus subtilis SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 31 Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện Dựa kết bảng 3.1 cho thấy, môi trường TCS có giá trị hấp thu quang cao (1.780), tiếp sau môi trường TSA (1.216) môi trường SLM (0.624), riêng mơi trường LB có giá trị hấp thu quang thấp (0.007) Kết xác định số lượng tế bào môi trường TCS tương ứng 5,5.1010 (CFU/ml) Điều cho thấy môi trường TCS mơi trường tổng hợp thích hợp cho q trình sinh trưởng phát triển chủng Bacillus subtilis Mặt khác, TCS mơi trường có nguồn dinh dưỡng cao thuận lợi cho sinh trưởng phát triển chủng Do chúng tơi định chọn mơi trường mơi trường nhân giống cấp thích hợp để sử dụng làm nghiên cứu thí nghiệm giai đoạn sau 3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ lên sinh trưởng phát triển Bacillus subtilis Nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến hoạt động sống VSV Mọi loài vi sinh vật phát triển mạnh giới hạn nhiệt độ định Ngoài khoảng nhiệt độ vi sinh vật bị hạn chế phát triển Do mà việc nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng phát triển VSV quan trọng cần thiết nhằm xác định nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng phát triển VSV Qua khảo sát thí nghiệm lặp lại hai lần chúng tơi thu kết ảnh hưởng nhiệt độ thể qua đồ thị 3.2 Đồ thị 3.2: Ảnh hưởng nhiệt độ đến tốc độ sinh trưởng phát triển Bacillus subtilis SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 32 Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện Nhìn vào đồ thị thấy, chủng Bacillus subtilis có khả hoạt động dải nhiệt độ rộng từ 300C đến 500C Trong chủng vi sinh vật có khả sinh trưởng mạnh nhiệt độ 300C với nồng độ tế bào 1,0.1010 (CFU/ml) Mặt khác, nhiệt độ 300C nhiệt độ phòng nên thuận lợi cho việc nuôi giống thiết bị nuôi cấy đơn giản Với khả chịu nhiệt độ cao 50 0C chủng vi sinh vật tạo điều kiện thuận lợi cho công nghệ sấy khô chế phẩm giai đoạn sau 3.3 Ảnh hưởng pH lên sinh trưởng phát triển Bacillus subtilis Căn vào đồ thị 3.3 nhận thấy pH cho tốc độ sinh trưởng mạnh chủng Bacillus subtilis pH 6,0 với nồng độ tế bào 2,0.1010 (CFU/ml) Tuy nhiên thấy khoảng pH – tốc độ sinh trưởng khác không đáng kể Có thể nhận thấy chủng khơng thích hợp với môi trường axit kiềm mạnh mà chúng phát triển mạnh môi trường axit yếu trung tính Theo số nghiên cứu trước cho thấy, chủng vi khuẩn hoạt động mạnh dải pH rộng từ 5.5 – 8.5 Do đó, kết nghiên cứu đề tài phù hợp với nghiên cứu ảnh hưởng pH sinh trưởng phát triển chủng Bacillus subtilis Ngoài ra, số tác giả chứng minh pH 6,0 làm tăng tính thấm qua màng, hoạt động chuyển hố vật chất tế bào, hình thành ATP…v.v có tác động tích cực lên q trình trao đổi chất VSV Do đó, chúng tơi chọn pH – khoảng pH Đồ thị 3.3: Ảnh hưởng pH đến tốc độ sinh trưởng Bacillus subtilis thích hợp cho sinh trưởng phát triển Bacillus subtilis SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 33 Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện 3.4 Ảnh hưởng nguồn cacbon lên sinh trưởng phát triển Bacillus subtilis Trong việc nghiên cứu thu nhận sinh khối VSV, yếu tố quan tâm nguồn dinh dưỡng Trong nguồn cacbon nguồn dinh dưỡng thiết yếu sinh trưởng VSV Nguồn cacbon thường sử dụng nghiên cứu tinh bột, mật rỉ, saccharose, glucose, dầu thực vật, dịch đường thuỷ phân từ bột gỗ …vv.Tuy nhiên, để giảm chi phí cho việc nghiên cứu người ta sử dụng số nguồn cacbon thay tinh bột, glucose, succarose, rỉ đường, bột mì Kết nghiên cứu ảnh hưởng nguồn cacbon ghi nhận đồ thị 3.4 Thí nghiệm lặp lại lần Đồ thị 3.4 Ảnh hưởng nguồn cacbon đến tốc độ sinh trưởng phát triển Bacillus subtilis Qua quan sát ta thấy tất nguồn cacbon có khả sử dụng làm nguồn dinh dưỡng cho trình sinh trưởng phát triển Bacillus subtilis nguồn tinh bột với nồng độ tế bào 0,5.1010 (CFU/ml) cho tốc độ phát triển cao Điều cho thấy chủng Bacillus subtilis có hoạt tính enzyme amylase cao nguồn cacbon liên quan đến tinh bột Theo nghiên cứu Tô Minh Châu “thu nhận sinh khối chủng Bacillus subtilis sản xuất chế phẩm sinh học” nguồn cacbon tối ưu để chủng sinh trưởng phát triển SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 34 Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện nguồn rỉ đường có bổ sung 2% tinh bột với nồng độ tế bào 1,1.10 11 (CFU/ml) Điều giải thích giai đoạn đầu ni cấy chủng vi khuẩn sử dụng số đường đơn rỉ đường để sinh trưởng Đến giai đoạn sản xuất hợp chất thứ cấp, chúng sử dụng hệ enzyme để thủy phân tinh bột thành đường đơn khác làm nguồn dinh dưỡng cho tế bào Tuy nhiên, tinh bột tinh khiết sử dụng chủ yếu ni cấy quy mơ nhỏ Cịn áp dụng vào quy mơ lớn thường dùng nguồn nguyên liệu thô, phụ phẩm rẻ tiền dễ kiếm Do đó, để đáp ứng yêu cầu cho sản xuất công nghiệp người ta thường dùng nguồn cacbon rỉ đường bột mì 3.5 Ảnh hưởng nguồn nitơ lên sinh trưởng phát triển Bacillus subtilis Nguồn nitơ cung cấp cho tế bào nhiều dạng khác gồm nguồn nitơ hữu vô Nguồn nitơ hữu thường phong phú nitơ có hầu hết quan thực vật động vật Trong nuôi cấy VSV nguồn nitơ sử dụng chủ yếu nguồn hữu có hàm lượng protein cao Do chúng có khả hấp thu tốt với vi sinh vật Còn nguồn nitơ vơ khả sử dụng nguồn nitơ VSV hạn chế số chất vô chứa nitơ khơng thích hợp cho q trình ni cấy VSV Nguồn nitơ lựa chọn khảo sát nuôi cấy Bacillus subtilis bao gồm pepton, bã đậu nành, casein, KNO3, NaNO3 urê hợp chất dễ kiếm dùng phổ biến công nghệ lên men Tuy nhiên, muốn sử dụng nguồn nitơ này, VSV phải phân giải chúng thành chất đơn giản để tế bào hấp thụ dễ dàng Kết khảo sát thể đồ thị 3.5 Kết nghiên cứu ảnh hưởng nguồn nitơ đến tốc độ sinh trưởng Bacillus subtilis cho thấy, nguồn nitơ lựa chọn khảo sát hầu hết cho tốc độ sinh trưởng cao ứng với giá trị độ hấp thu quang cao (từ 1,5 đến 1,8), riêng với casein độ hấp thu quang nhỏ (1,408) Trong KNO3 nguồn nitơ tối ưu ứng với nồng độ tế bào 1,1.10 11 (CFU/ml) Kết nghiên cứu cho thấy chủng Bacillus subtilis thích hợp với nguồn nitơ vơ muối Na K urê Còn nguồn nitơ hữu cơ, bã đậu nành chúng có giá trị dinh dưỡng cao cho VSV chứa nhiều acid amin khơng thay lysin, tryptophan nên chúng môi trường thuận lợi cho sinh trưởng phát triển vi sinh vật casein pepton Đây đánh giá nguồn nguyên liệu thay hữu hiệu nuôi cấy vi sinh công nghiệp SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 35 Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện Đồ thị 3.5 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến tốc độ sinh trưởng phát triển Bacillus subtilis 3.6 Ảnh hưởng nguồn muối khoáng lên sinh trưởng phát triển Bacillus subtilis Trong công nghệ lên men, người ta nhận thấy vai trị dinh dưỡng khống quan trọng cho trình trao đổi chất VSV Các chất khống sử dụng ni cấy VSV chất khống dạng đơn chất hay hợp chất, dạng vơ hay hợp chất hữu Ở khảo sát ảnh hưởng chất khống dạng vơ nguồn muối natriclorua với nồng độ khác Kết nghiên cứu thể đồ thị 3.6 SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 36 Đồ thị 3.6 Ảnh hưởng nồng độ muối lên tốc độ sinh trưởng phát triển Bacillus subtilis Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện Kết nghiên cứu (đồ thị 3.6) cho thấy, khoảng nồng độ từ 1% đến 3% cho tốc độ sinh trưởng Bacillus subtilis cao với nồng độ lớn 3% khả sinh trưởng giảm rõ rệt Do đó, khoảng nồng độ muối thích cho chủng vi khuẩn sinh trưởng 1- 3% nồng độ 3% nồng độ tế bào 0,5.1010 (CFU/ml) 3.7 Xây dựng môi trường nuôi cấy Trong công nghệ sản xuất chế phẩm sinh học qui mô công nghiệp thường mơi trường có thành phần đơn giản, dễ kiếm rẻ tiền lựa chọn làm môi trường nuôi cấy cho đối tượng vi sinh vật để thu nhận sản phẩm từ chúng sinh khối, enzyme số chất có hoạt tính sinh học khác Do đó, sau tiến hành lựa chọn thành phần mơi trường thích hợp cho q trình sinh trưởng phát triển chủng Bacillus subtilis, lựa chọn môi trường nuôi cấy lượng lớn bảng 3.1 Kết nghiên cứu thu nhận sinh khối môi trường cho nồng độ tế bào chủng Bacillus subtilis 5,0.1010 (CFU/ml) Kết cho thấy, chủng vi khuẩn có khả cho sinh trưởng mạnh không môi trường tinh khiết (tổng hợp) mà chúng cịn dễ dàng thích nghi với mơi trường tự nhiên có thành phần tương tự mơi trường thương mại Vì vậy, q trình ni cấy Bacillus subtilis dễ dàng hơn, đồng thời giảm đáng kể chi phí mơi trường ni cấy thay số thành phần môi trường tổng hợp nguyên liệu rẻ tiền Bảng 3.1 Thành phần môi trường thay cho chủng Bacillus subtilis Thành phần SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 37 Tỷ lệ Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện Cao nấm men 60% Tinh bột 5% KNO3 0,5% NaCl 3% K2HPO4 25% 3.8 Khả tạo bào tử chủng Bacillus subtilis Mục đích việc tạo bào tử nhằm bảo quản kéo dài thời gian lưu trữ sinh khối vi sinh vật chế phẩm Kết nghiên cứu xác định nồng độ tế bào tạo thành bào tử Bacillus subtilis 0,5.1010 (CFU/ml) Với nồng độ cho thấy chủng Bacillus subtilis có khả tạo bào tử cao (so với tổng số tế bào ban đầu 1,0.1010 (CFU/ml)) 3.9 Ảnh hưởng thời gian đến tốc độ sinh trưởng phát triển chủng Bacillus subtilis VSV có thời gian hệ ngắn Ở vi khuẩn, thời gian khoảng 0,3 – giờ, nấm men tảo – Do đó, để sản xuất nhiều sinh khối thời gian ngắn cần thiết phải nghiên cứu ảnh hưởng thời gian để chọn thời điểm kết thúc q trình ni cấy thích hợp Kết nghiên cứu thời gian ni cấy trình bày đồ thị 3.7 SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 38 Đồ thị 3.7 Ảnh hưởng thời gian đến tốc độ sinh trưởng chủng Bacillus subtilis Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện Chú thích: (*)’ : x109 (CFU/ml) Qua đồ thị cho thấy, thời điểm mà chủng VSV phát triển môi trường lỏng thiết bị lên men 48 Theo kết nghiên cứu Ngô Thị Duy Ngọc ảnh hưởng thời gian đến tốc độ sinh trưởng Bacillus subtilis môi trường bán rắn thời gian tạo sinh khối nhanh 24h với nồng độ tế bào 4,0.10 (CFU/ml) Như vậy, kết luận chủng Bacillus subtilis sinh trưởng phát triển môi trường lỏng tốt môi trường bán rắn 3.10 Đánh giá chất lượng sinh khối sau nuôi cấy Sau nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng Bacillus subtilis lựa chọn tất nguồn thích hợp cho chủng sinh trưởng pháp triển nuôi cấy thời gian định chúng tơi đưa tiêu chí để đánh giá khả tạo sinh khối chủng Bacillus subtilis bảng 3.2 Bảng 3.2 Đánh giá khả tạo sinh khối chủng Bacillus subtilis Các tiêu đánh giá sản phẩm sinh khối chủng Bacillus subtilis sau nuôi cấy 5,0.1010 (CFU/ml) Nồng độ tế bào Thời gian tạo sinh khối 48h 0,5.1010 (CFU/ml) Số lượng tế bào tạo bào tử SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân Kết 39 Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện 3.11 Xây dựng qui trình thu nhận sinh khối Bacillus subtilis Bacillus subtilis Bảo quản tủ -200C Hoạt hóa giống Dùng TCS + agar Cấy chuyền môi trường thạch Giữ giống Bảo quản Cấy ria T= 48h 300C, TCS Nuôi cấy cấp SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 40 Tỷ lệ cấp giống 10% T=50C Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện T=300C, t=24h, pH 6, 120v/ph Tinh bột 5% KNO3 0,5% NaCl 3%.T=300C, pH Môi trường thay thế, T=300C, t=48h, 120v/ph, pH 6.0, tỷ lệ cấp giống 10%, tốc độ khuấy 150v/ph + dO2 Lựa chọn nguyên liệu tạo môi trường nuôi cấy Xây dựng môi trường nuôi cấy Tinh bột 5%, KNO3 0,5%, NaCl 3%, cao nấm men 60%, K2HPO4 25% Nuôi cấy qui mô lớn Sản phẩm sinh khối Hình 3.2 Quy trình thu nhận sinh khối chủng Bacillus subtilis Thuyết minh quy trình cơng nghệ thu nhận sinh khối chủng Bacillus subtilis: - Giống vi sinh vật: Bacillus subtilis lấy từ phịng thí nghiệm vi sinh thuộc TTCNSTH Chủng VSV bảo quản môi trường thạch nghiêng tủ lạnh nhiệt độ 50C - Hoạt hóa : Ni chủng vi khuẩn Bacillus subtilis môi trường TCS 300C, tốc độ lắc 120v/ph 24h - Cấy chuyền : + Chuyền 0,1ml dịch VSV hoạt hóa nhỏ lên đĩa thạch chứa môi trường TCS + agar dùng que trải dàn bề mặt môi trường se lại + Đem nuôi cấy tủ ấm 300C 24h + Giữ giống: Cấy VSV từ đĩa thạch sang ống thạch nghiêng môi trường TCS + agar Nuôi cấy tủ ấm 300C 48h SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 41 Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện + Bảo quản: Ở 50C tháng, sau phải tiến hành cấy chuyền lại - Ni cấy cấp 1: + Nuôi chủng VSV Bacillus subtilis môi trường TCS 30 0C, 24h, với tốc độ lắc 120v/ph + Sau 24h nuôi cấy nồng độ tế bào đạt 5,5.1010 (CFU/ml) - Lựa chọn nguyên liệu tạo môi trường nuôi cấy: Khảo sát nguồn dinh dưỡng cacbon (gồm rỉ đường, tinh bột, succarose, glucose, bột mì), nitơ (casein, pepton, KNO 3, NaNO3, bã đậu nành, urê) nguồn muối khống (NaCl) Sau đó, chọn nguồn dinh dưỡng xác định tỷ lệ thích hợp của nguồn cacbon, nitơ muối khống nhằm tạo mơi trường tăng sinh cho chủng Bacillus subtilis sinh trưởng phát triển - Nuôi cấy thiết bị lên men: Sau chuẩn bị giống môi trường đầy đủ, chuyển tất vào thiết bị lên men Chủng Bacillus subtilis nuôi liên tục 48h mơi trường có thành phần dinh dưỡng thích hợp t=30 0C, pH=6, tốc độ khuấy 150v/ph + dO 2, với tỷ lệ cấp giống 10% Nồng độ tế bào sau lên men đạt 5,0.1010 (CFU/ml) CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Qua q trình nghiên cứu khảo sát chúng tơi rút kết luận sau: Môi trường tăng sinh để chủng Bacillus subtilis sinh trưởng phát triển tốt môi trường TCS với nồng độ tế bào 5,5.1010 (CFU/ml) Xác định nhiệt độ thích hợp t = 30 0C có nồng độ tế bào 1,0.1010 (CFU/ml) pH pH với nồng độ tế bào đạt 2,0.1010 (CFU/ml) Xác định nguồn cacbon, nitơ nguồn muối khống thích hợp cho sinh trưởng phát triển chủng vi sinh bao gồm: - Tinh bột (5%) có nồng độ tế bào 0,5.1010 (CFU/ml) - KNO3 (0,5%) có nồng độ tế bào 1,1.1011 (CFU/ml) SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 42 Luận văn tốt nghiệp GVHD: Nguyễn Văn Nguyện - NaCl (3%) có nồng độ tế bào 0,5.1010 (CFU/ml) Kết tạo bào tử chủng đạt nồng độ tế bào 0,5.10 10 (CFU/ml) sau thời gian 72h, pH = 6,0, t = 300C Xác định thời gian ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng Bacillus subtilis 48h với nồng độ tế bào 5,0.1010 (CFU/ml) Xây dựng quy trình tạo sinh khối gồm giai đoạn: ni cấy cấp nuôi cấy qui mô lớn - Nuôi cấy cấp 1: Trên môi trường TCS, 300C, tốc độ lắc 120v/ph 24 - Nuôi qui mô lớn: + Môi trường thay + Điều kiện nuôi cấy: T0C = 30; tốc độ khuấy 150v/ph (phụ thuộc vào oxy hịa tan);dO2 = 50%; pH 6.0; Sục khí 1atm; Thời gian 48 h; Tỉ lệ câp giống 10% 4.2 Kiến nghị Do thời gian có hạn, số nghiên cứu đề tài chưa hồn thiện nên chúng tơi có số kiến nghị sau: Tiến hành nghiên cứu tiếp tục số ảnh hưởng đến trình sinh trưởng phát triển vi sinh vật thiết bị lên men tốc độ khuấy, nồng độ oxy Khảo sát số nguồn cacbon, nitơ mở rộng để chọn nguyên liệu thay cho nuôi cấy công nghiệp Nghiên cứu số phương pháp tạo bào tử để nâng cao hiệu suất trình tạo chế phẩm SVTH:Huỳnh Thị Quỳnh Ngân 43 ... khoáng - Nghiên cứu khả tạo bào tử Bacillus subtilis - Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian đến tốc độ sinh trưởng cho chủng Bacillus subtilis - Xây dựng quy trình thu nhận sinh khối Bacillus subtilis. .. khối chủng Bacillus subtilis Thuyết minh quy trình cơng nghệ thu nhận sinh khối chủng Bacillus subtilis: - Giống vi sinh vật: Bacillus subtilis lấy từ phịng thí nghiệm vi sinh thuộc TTCNSTH Chủng. .. Đánh giá khả tạo sinh khối chủng Bacillus subtilis Các tiêu đánh giá sản phẩm sinh khối chủng Bacillus subtilis sau nuôi cấy 5,0.1010 (CFU/ml) Nồng độ tế bào Thời gian tạo sinh khối 48h 0,5.1010