Luận văn thạc sĩ tối ưu một số điều kiện môi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp protease của chủng nấm

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC LÝ THỊ HUYỀN TỐI ƯU MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEASE CỦA CHỦNG NẤM ASPERGILLUS ORYZAE VTCC – F - 0187 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG THÁI NGUYÊN - 2018 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC LÝ THỊ HUYỀN TỐI ƯU MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEASE CỦA CHỦNG NẤM ASPERGILLUS ORYZAE VTCC – F - 0187 Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Người hướng dẫn khoa học: TS Trịnh Đình Khá THÁI NGUYÊN - 2018 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi nhóm nghiên cứu Các số liệu kết trình bày luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Mọi trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn gốc Mọi giúp đỡ cá nhân tập thể ghi nhận lời cám ơn Tôi xin chịu hồn tồn trách nhiệm cam đoan Tác giả Lý Thị Huyền ii LỜI CẢM ƠN Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Trịnh Đình Khá giảng viên trường Đại học Khoa học, định hướng ý tưởng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn nghiên cứu, sửa luận văn tạo điều kiện hóa chất trang thiết bị nghiên cứu để tơi hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy, cô giáo khoa Công nghệ sinh học trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên giảng dạy tạo điều kiện chu đáo cho suốt q trình học tập hồn thành luận văn Bên cạnh đó, tơi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đồng nghiệp động viên giúp đỡ tơi suốt q trình học tập để tơi có kết ngày hơm Với lịng biết ơn sâu sắc, tơi xin chân thành cảm ơn tất giúp đỡ quý báu ! Thái Nguyên, tháng 10 năm 2018 Học viên Lý Thị Huyền iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤCDANH MỤC CÁC BẢNG iii DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vii MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài .1 Mục tiêu đề tài Nội dung nghiên cứu .2 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Protease 1.1.1 Khái niệm 1.1.2 Phân loại protease .4 1.1.3 Cơ chế xúc tác 1.1.4 Nguồn thu protease 1.1.5 Ứng dụng 11 1.2 Sinh tổng hợp protease .14 1.2.1 Chủng giống 14 1.2.2 Môi trường nuôi cấy 14 1.2.3 Các phương pháp nuôi cấy 14 1.2.4 Thu nhận protease 15 1.2.5 Các điều kiện môi trường ảnh hưởng đến khả tổng hợp protease A oryzae .17 1.3 Sản xuất protease từ Aspergillus oryzae 19 1.3.1 Aspergillus oryzae 19 1.3.2 Sản xuất chế phẩm protease 20 CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Nguyên liệu nghiên cứu .24 iv 2.1.1 Chủng giống 24 2.1.2 Môi trường nuôi cấy 24 2.1.3 Hóa chất 24 2.1.4 Thiết bị, dụng cụ .25 2.1.5 Dung dịch đệm 25 2.2 Địa điểm thời gian 26 2.3 Phương pháp nghiên cứu 26 2.3.1 Nuôi cấy sinh tổng hợp protease .26 2.3.2 Xác định hoạt độ protease .26 2.3.3 Tối ưu số yếu tố môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp protease 29 2.3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp protease .30 2.3.5 Xử lý số liệu 31 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 Khả sinh tổng hợp protease chủng A oryzae VTCC-F-0187 .32 3.2 Tối ưu điều kiện sinh tổng hợp protease 33 3.2.1 Tối ưu tỉ lệ bột lõi ngô bột đậu tương 33 3.2.2 Tối ưu tỉ lệ cám gạo bổ sung 34 3.2.3 Tối ưu độ ẩm 35 3.2.4 Tối ưu nhiệt độ nuôi cấy 36 3.2.5 Tối ưu pH nuôi cấy 37 3.2.6 Tối ưu thời gian lên men 39 3.3 Sản xuất chế phẩm .40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 PHỤ LỤC 48 v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Phân loại protease theo pH hoạt động tối ưu Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng thí nghiệm 24 Bảng 2.2 Thiết bị sử dụng thí nghiệm 25 Bảng 2.3 Danh sách dung dịch đệm sử dụng thí nghiệm 25 Bảng 2.4 Nồng độ pha loãng Tyrosine 27 Bảng 2.5 Tỉ lệ tương ứng bột đậu tương bột lõi ngô 29 Bảng 2.6 Tỉ lệ tương ứng bột đậu tương, bột lõi ngô bột cám gạo .30 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.2 Sơ đồ phân loại protease Hình 1.3 Mơ hình phân tử enzyme protease (papain) .6 Hình 1.4 Mơ hình phân tử enzyme protease (renin) Hình 2.1 Đường chuẩn Tyrosine 28 Hình 3.1 Hoạt tính phân giải casein dịch chiết enzyme ngoại bào từ chất lên men xốp chủng A oryzae VTCC-F-0187 32 Hình 3.2 Ảnh hưởng tỷ lệ chất bột đậu tương/lõi ngô đến khả sinh tổng hợp protease chủng A oryzae VTCC-F-0187 33 Hình 3.3 Ảnh hưởng nồng độ cám gạo đến khả sinh tổng hợp protease chủng A oryzae VTCC-F-0187 35 Hình 3.4 Ảnh hưởng độ ẩm tới khả sinh tổng hợp protease chủng A oryzae VTCC-F-0187 36 Hình 3.5 Ảnh hưởng nhiệt độ tới khả sinh tổng hợp enzyme protease chủng A oryzae VTCC-F-0187 .37 Hình 3.6 Ảnh hưởng pH mơi trường tới khả sinh tổng hợp protease chủng A oryzae VTCC-F-0187 .38 Hình 3.7 Khả sinh protease theo thời gian chủng A oryzae VTCC-F0187 39 Hình 3.8 Lên men chủng A oryzae VTCC-F-0187 sản xuất chế phẩm protease .41 Hình 3.9 Khả sinh tổng hợp protease chủng A oryzae VTCC-F-0187 điều kiện tối ưu sau lần lên men 42 vii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Tên đầy đủ Tên viết tắt BĐT Bột đậu tương LN Lõi ngô CG Cám gạo TCA Tricloacetic acid OD Optical density (Độ hấp thụ ánh sáng) Hdp Hoạt độ protease hspl Hệ số pha lỗng HT Hoạt tính HTtb Hoạt tính trung bình SS Sai số MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Enzyme chất xúc tác sinh học tổng hợp tế bào sống thể sinh vật Enzyme tham gia phản ứng sinh hóa thể làm tăng tốc độ phản ứng không bị thay đổi sau phản ứng Enzyme khơng có ý nghĩa với q trình sinh trưởng, sinh sản sinh vật mà enzyme cịn có vai trị quan trọng với người cơng nghệ chế biến thực phẩm, y học, công nghệ gen bảo vệ môi trường Nhiều quốc gia sử dụng phổ biến enzyme sản xuất đời sống mang lại lợi nhuận kinh tế lớn cho người [2] Protease nhóm enzyme có khả thủy phân liên kết peptide úng dụng nhiều công nghiệp, nông nghiệp công nghệ sinh học [31] Protease có vai trị quan trọng ngành cơng nghiệp dược phẩm, y tế, thực phẩm công nghệ sinh học, chiếm gần 60% thị trường enzyme [27], protease từ vi sinh vật ước tính chiếm khoảng 40% tổng lượng enzyme bán toàn giới [28] Aspergillus oryzae loại nấm sợi liệt kê sinh vật "thường công nhận an toàn (GRAS)" Cục quản lý thực phẩm dược phẩm Hoa Kỳ A oryzae có lịch sử sử dụng lâu dài ngành công nghiệp thực phẩm sản xuất thực phẩm lên men truyền thống, hoạt tính phân giải protein cao [16, 24] A oryzae có khả sinh tổng hợp nhiều loại enzyme ngoại bào amylase, protease, pectinase, lipase, xylanase, cellulase, catalase, phytase, glucose oxidase [23] Sử dụng vi sinh vật nguồn cung cấp protease cải thiện đáng kể hiệu sản xuất, chế phẩm tạo nhiều Tuy nhiên, giá thành chế phẩm protease cao nhu cầu sử dụng enzyme ngày nhiều Để phát triển dây truyền sản xuất protease đạt hiệu cao, có nhiều cơng trình nghiên cứu tiến hành để chọn lọc chủng giống, tìm kiếm chất 36 vậy, độ ẩm 60% độ ẩm tốt cho chủng A oryzae VTCC-F-0187 sinh tổng hợp protease Hình 3.4 Ảnh hưởng độ ẩm tới khả sinh tổng hợp protease chủng A oryzae VTCC-F-0187 Trong nghiên cứu trước đây, A oryzae var brunneus WO3 ni chất cơm trắng có hàm lượng nước ban đầu 40% phù hợp cho phát triển [26] Aspergillus oryzae (Ozykat-1) nuôi chất có cám lúa mì cám gạo 33% độ ẩm tối ưu 50% [13] Như chủng A oryzae VTCCF-0187 nuôi hỗn hợp 35% bột đậu tương, 55% bột lõi ngơ 10% cám gạo có độ ẩm tối ưu cao thí nghiệm đạt 60% 3.2.4 Tối ưu nhiệt độ nuôi cấy Chủng A oryzae VTCC-F-0187 nuôi cấy nhiệt độ khác từ 25 - 35C môi trường có tỉ lệ bột đậu tương : lõi ngơ : cám gạo tương ứng 35% : 55% : 10%, khoáng Czapeck, độ ẩm 60%, pH Sau ngày nuôi cấy thu dịch enzyme thô để xác định hoạt tính 37 Kết cho thấy, tăng nhiệt độ từ 25 – 30C sinh tổng hợp protease tăng lên hoạt tính enzyme đạt cao 23,7 U/g nhiệt độ 30C giảm dần tăng nhiệt độ lên 33C 35C (Hình 3.5 phụ lục 4) Hình 3.5 Ảnh hưởng nhiệt độ tới khả sinh tổng hợp enzyme protease chủng A oryzae VTCC-F-0187 Những nghiên cứu trước cho thấy, A oryzae LBA 01 có phạm vi nhiệt độ tối ưu cho hoạt động 55-60°C [32] A niger nuôi chất bột hướng dương có nhiệt độ tối ưu 30°C [18] A clavatus có nhiệt độ tối ưu 40°C [33] A oryzae LK-101 có nhiệt độ tối ưu 50°C [30] Như vậy, nhiệt độ tối ưu A oryzae VTCC-F-0187 A niger thấp A oryzae LBA 01, Aspergillus clavatus A oryzae LK-101 3.2.5 Tối ưu pH nuôi cấy pH môi trường ni cấy ảnh hưởng lớn tới hoạt tính enzyme protease, ảnh hưởng đến mức độ ion hóa chất cảm ứng sinh enzyme Để tìm 38 khoảng pH tối ưu cho khả sinh tổng hợp amylase từ chủng nấm A oryzae, tiến hành lên men chủng A oryzae VTCC-F-0187 mơi trường có tỉ lệ % BĐT: LN: CG 35:55:10, độ ẩm 60%, nhiệt độ 30oC pH khác từ đến Ni cấy ngày sau thu dịch enzyme protease để xác định hoạt tính Hình 3.6 Ảnh hưởng pH môi trường tới khả sinh tổng hợp protease chủng A oryzae VTCC-F-0187 Với kết ta nhận thấy, với pH môi trường nuôi cấy tăng từ lên hoạt tính enzyme tăng mạnh (từ 19,5 U/g pH lên 21,4 U/g pH đạt cực đại 25,1 U/g pH 6) Sau tiếp tục tăng pH môi trường từ lên lên 8, hoạt tính enzyme giảm mạnh, pH hoạt tính 23,7 U/g, pH hoạt tính cịn 20,8 U/g (Hình 3.6 phụ lục 5) Như vậy, chủng A oryzae VTCC-F-0187 sinh tổng hợp protease mạnh điều kiện pH môi trường ban đầu nghiêng phía acid Tương tự nghiên cứu trước đây, Aspergillus oryzae BCRC 30118 phát triển ổn định pH 39 3.0-6.0 [21] Aspergillus sp có pH tối ưu [29] A oryzae phát triển ổn định khoảng pH 2,5-6,5 với độ pH tối ưu 3,5 [22] 3.2.6 Tối ưu thời gian lên men Thời gian lên men yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sinh tổng hợp enzyme nấm Để đánh giá khả sinh tổng hợp protease theo thời gian, chủng A oryzae VTCC-F-0187 nuôi cấy môi trường chất gồm 35% bột đậu tương, 55% lõi ngơ, 10% cám gạo, khống Czapek, độ ẩm 60%, pH 6, nhiệt độ 30°C, thời gian khác Sau thu dịch enzyme để xác định hoạt tính protease Hình 3.7 Khả sinh protease theo thời gian chủng A oryzae VTCC-F-0187 Từ kết cho thấy, thời gian ảnh hưởng lớn tới hoạt tính enzyme protease A oryzae Sau ngày nuôi cấy A oryzae có hoạt tính 7,7 (U/g), ngày hoạt tính tiếp tục tăng đạt cực đại 27,1 (U/g) 40 ngày thứ Như vậy, hoạt tính ngày thứ gấp gần lần hoạt tính ngày Sau ngày thứ hoạt tính A oryzae bắt đầu giảm, giảm mạnh đến ngày thứ 8, hoạt tính cịn 19,1 U/g (Hình 3.7 phụ lục 6) Điều cho thấy, trình sinh tổng hợp protease gắn liền với trình phát triển A oryzae A oryzae bắt đầu sinh enzyme hệ sợi phát sinh sau ngày khả tăng mạnh bào tử xuất khoảng ngày thứ 3, thứ Hoạt tính enzyme A oryzae lên cao ngày thứ thứ trình hóa nâu bào tử nấm bắt đầu Những ngày sau bào tử nấm hóa nâu ngày nhiều sinh tổng hợp enzyme nấm giảm Như vậy, thời gian thích hợp cho chủng A oryzae VTCC-F-0187 sinh tổng hợp protease ngày Trong nghiên cứu trước đây, Aspergillus sp có thời gian lên men 120 [29] A niger nuôi bột hướng dương thời gian lên men tối ưu 72 [18] Như thời gian lên men tối ưu chủng A oryzae VTCC-F-0187 dài so với chủng A sp A niger 3.3 Sản xuất chế phẩm Sau tìm điều kiện tối ưu môi trường nuôi cấy, tiến hành lên men chủng A oryzae VTCC-F-0187 hỗn hợp chất 35% bột đậu tương, 55% bột lõi ngô 10% cám gạo, với độ ẩm ban đầu 60%, pH ban đầu 6, nhiệt độ 30C tủ điều khiển nhiệt độ, có khơng khí lưu thơng Trong q trình ni khơng cần điều chỉnh pH, thời gian lên men ngày (Hình 3.8) Khi trộn giống xong, mơi trường trải lên khay có kích thước 30x50 cm, phủ báo khử trùng để lên men Kết thúc trình lên men tiến hành chiết enzyme chế phẩm enzyme thơ (Hình 3.9) 41 Hình 3.8 Quy trình lên men sản xuất chế phẩm protease từ A Oryzae VTCC – F - 0187 A B C Hình 3.9 Lên men chủng A oryzae VTCC-F-0187 sản xuất chế phẩm protease A: Chuẩn bị chất lên men; B: Lên men thiết bị điều khiển nhiệt 42 độ; C: Cơ chất sau lên men Kết hình 3.10 cho thấy, khả sinh tổng hợp protease chủng A oryzae VTCC-F-0187 lần đạt 27,2 U/g, lần đạt 27 U/g, lần đạt 27 U/g Như vậy, chủng A oryzae VTCC-F-0187 sinh tổng hợp protease ổn định điều kiện tối ưu ổn định sau lần lên men So sánh với điều kiện chưa tối ưu, khả sinh tổng hợp protease chủng A oryzae VTCC-F-0187 tăng 76,5% từ 15,3 U/g lên 27 U/g Dịch chiết enzyme thơ sử dụng để đông khô tạo chế phẩm enzyme protease bổ sung vào thức ăn chăn ni Hình 3.10 Khả sinh tổng hợp protease chủng A oryzae VTCC-F-0187 điều kiện tối ưu sau lần lên men 43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Chủng A oryzae VTCC-F-0187 có khả sinh tổng hợp protease ngoại bào, khơng bị hoạt tính sinh tổng hợp enzyme sau trình bảo quản chủng giống Chủng A oryzae VTCC-F-0187 có khả tổng hợp protease cao lên men hỗn hợp chất gồm 35% bột đậu tương, 55% bột lõi ngô 10% cám gạo Điều kiện để chủng A oryzae VTCC-F-0187 sinh tổng hợp protease tối ưu là: độ ẩm ban đầu 60%, nhiệt độ 30C, pH ban đầu thời gian lên men ngày Đã tiến hành lên men thu dịch enzyme thơ sản xuất chế phẩm đánh giá ổn định sinh tổng hợp protease chủng A oryzae VTCCF-0187 điều kiện tối ưu KIẾN NGHỊ Thử nghiệm lên men lượng lớn với nguồn chất bột đậu tương, lõi ngô cám gạo điều kiện tối ưu Tạo chế phẩm enzyme bổ sung vào thức ăn chăn nuôi gia súc, nâng cao chất lượng vật nuôi 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Nguyễn Thị Hiền (2012), Công nghệ sản xuất enzyme, protein ứng dụng, NXB giáo dục Việt Nam Nguyễn Đức Lượng (2012), Công nghệ enzyme, NXB Đại học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh Lê Văn Việt Mẫn, Trần Thị Ánh Tuyết (2006), "Khảo sát số tính chất chế phẩm Protease từ canh trường nuôi cấy bề mặt Aspergillus oryzae ứng dụng Enzyme sản xuất nước mắm", Tạp chí phát triển khoa học cơng nghệ, (5), Tr 53-58 Nguyễn Văn Mùi (2001), Thực hành hóa sinh học, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội Bùi Thị Nhung (2013), Nghiên cứu tạo chế phẩm protease từ Bacillus subtilis có natto Nhật Bản hướng tới thực phẩm chức năng, Luận văn thạc sĩ - Đại học Sư phạm thành phố Hồ Chí Minh Lương Đức Phẩm (2010), Giáo trình Cơng nghệ lên men, NXB giáo dục Việt Nam Nguyễn Thị Thảo (2005), Tối ưu điều kiện nuôi cấy chủng Sertia sp DT3 sinh tổng hợp protease ngoại bào xác định tính chất lí hóa, Luận văn thạc sĩ - Viện sinh thái tài nguyên sinh vật Đặng Thị Thu (2012), Công nghệ enzyme, NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội Đồng Thị Thanh Thu (2004), Nghiên cứu sản xuất chế phẩm enzyme protease từ vi sinh vật để ứng dụng lĩnh vực công nghệ thực phẩm, Luận văn thạc sĩ - Trường Đại học Khoa học tự nhiên - thành phố Hồ Chí Minh 45 10 Đỗ Thị Bích Thủy (2012), "Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến thu nhận chế phẩm protease ngoại bào Bacillus amyloliquefacien N1", Tạp chí khoa học - Đại học Huế, 71(2), Tr 279-290 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 11 Amri E., Mamboya F ( 2012), "Papain, a Plant Enzyme of Biological Importance: A Review ", American Journal of Biochemistry and Biotechnology, 8, pp 99-104 12 Bennett J W (2010), "An Overview of the Genus Aspergillus", Caister Academic Press, 978, pp 55-53 13 Chutmanop J., Chuichulcherm S., Chisti Y., Srinophakun P (2008), "Protease production by Aspergillus oryzae in solid-state fermentation using agroindustrial substrates", Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 83, pp 1012–1018 14 Galagan J E., Calvo S E., Cuomo C., Ma L J., Wortman J R., Batzoglou S., Lee S I., Basturkmen M (2005), "Sequencing of Aspergillus nidulans and comparative analysis with Aspergillus fumigatus and Aspergillus oryzae", Nature, 438, pp 1105-1115 15 Geiser D (2009), "Sexual structures in Aspergillus: morphology, importance and genomics", Medical mycology, 47, pp 21-26 16 Gotou T., Shinoda T., Mizuno S., Yamamoto N (2009), "Purification and identification of proteolytic enzymes from Aspergillus oryzae capable of producing the antihypertensive peptidee Ile-Pro-Pro", Journal of Bioscience and Bioengineering, 107, pp 615–619 17 Gradman A H., Kad R (2008), "Renin Inhibition in Hypertension", Journal of the American College of Cardiology, 51, pp 519-528 46 18 Hamid M., Ikram-Ul H (2009), "Production of Acid Protease by Aspergillus niger Using Solid State Fermentation", Pakistan J Zool, 41, pp 253-260 19 Kitamoto K (2002), "Molecular biology of te Koij molds", Adv in Appl Microbiol, 51, pp 129-153 20 Klich M A (2002), Identification of common Aspergillus species, Trakya University 21 Li-Jung Y., Ya-Hui C., Shann-Tzong J (2013), "Purification and characterization of acidic protease from Aspergillus oryzae BCRC 30118", Journal of Marine Science and Technology, 21, pp 105-110 22 Li C., Xu D (2014), "Production optimization, purification, and characterization of a novel acid protease from a fusant by Aspergillus oryzae and Aspergillus niger", European Food Research and Technology, 238, pp 905–917 23 Machida M., Asai K S., M et al (2005), "Genome sequencing and analysis of Aspergillus oryzae", Nature, 438, pp 1157–1161 24 Matsushita-Morita M., Tada S., Suzuki S e a (2011), "Overexpression and characterization of an extracellular Leucine Aminopeptidease from Aspergillus oryzae", Current Microbiology, 62, pp 557–564 25 Nafisa Saddig A A (2016), Optimization of Conditions for Protease Production from Aspergillus niger under Solid State Fermentation, University of Khartoum 26 Narahara H., Koyama Y., Yoshida T., Pichangkura S., Ueda R., Taguchi H (1982), "Growth and enzyme production in a solid state culture of Aspergillus oryzae", Journal of Fermentation Technology, 60, pp 311320 47 27 Ramakrishna V., Rajasekhar S., Reddy L S (2010), "Identification and purification of metalloprotease from dry grass pea (Lathyrus sativus L.) seeds", Applied Biochemistry and Biotechnology, 160, pp 63-71 28 Rao M B., Tanksale A M., Ghatge M S., Deshpande V V (1998), "Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases", Microbiology and Molecular Biology Reviews, 62, pp 597-635 29 Shivakumar S (2012), "Production and characterization of an acid Protease from a local Aspergillus Sp by solid substrate fermentation", Scholars Research Library, 4, pp 188-199 30 Si-Kyung, Joo-Yeon L., Hwa H., Kim C M (2010), "Purification and characterization of Aspergillus oryzae LK-101 salt-tolerant acid protease isolated from soybean paste", Food Science and Biotechnology, 19, pp 327–334 31 Silva T A S., Knob A., Tremacoldi C R., Brochetto-Braga M R., Carmona E C (2011), "Purification and some properties of an extracellular acid protease from Aspergillus clavatus", World Journal of Microbiology and Biotechnology, 27, pp 2491–2497 32 Soares de Castro R J., Sato H H (2014), "Protease from Aspergillus oryzae: Biochemical Characterization and Application as a Potential Biocatalyst for Production of Protein Hydrolysates with Antioxidant Activities", Journal of Food Processing, 372352, pp 905-917 33 Tremacoldi C R., Watanabe N K., Carmona E C (2004), "Production of Extracellular Acid Proteases by Aspergillus Clavatus", World Journal of Microbiology and Biotechnology, 20, pp 639–642 34 Vishwanatha K S., Appu Rao A G., Singh S A (2009), "Characterisation of acid protease expressed from Aspergillus oryzae MTCC 5341", Food Chemistry, 114, pp 402-407 48 PHỤ LỤC Phụ lục Ảnh hưởng tỷ lệ BĐT/Lõi ngô đến khả sinh tổng hợp protease chủng A oryzae VTCC-F-0187 Tỷ lệ BĐT/ 45:55 40:60 35:65 30:70 25:75 20:80 15:85 10:90 5:95 OD1 0,502 0,541 0,581 0,508 0,499 0,492 0,47 0,469 0,45 OD2 0,498 0,552 0,595 0,51 0,49 0,457 0,439 OD3 0,505 0,537 0,582 0,505 0,498 0,492 0,472 0,455 5 5 5 5 HT1 15,4 16,6 17,8 15,5 15,3 15,0 14,4 14,3 13,8 HT2 15,2 16,9 18,2 15,6 15,5 15,6 15,0 14,0 13,4 HT3 15,5 16,4 17,8 15,5 15,2 15,0 14,4 13,9 13,4 HTtb 15,3 16,6 18,0 15,5 15,3 15,2 14,6 14,1 13,5 SS 0,1 0,2 0,2 0,1 0,2 0,3 0,3 0,2 0,2 LN HSPL 0,508 0,51 0,44 Phụ lục Ảnh hưởng nồng độ cám gạo đến khả sinh tổng hợp protease chủng A oryzae VTCC-F-0187 nồng 10 15 35 40 OD1 0,602 0,641 0,621 0,578 0,519 0,492 0,47 0,429 0,32 OD2 0,598 0,652 0,615 0,46 0,427 0,319 OD3 0,585 0,637 0,612 0,525 0,498 0,492 0,472 0,415 0,34 5 5 5 5 HT1 18,4 19,7 19,0 17,7 15,9 15,0 14,4 13,1 9,7 HT2 18,3 20,0 18,8 15,6 15,5 14,7 14,1 13,0 9,7 HT3 17,9 19,5 18,8 16,1 15,2 15,0 14,4 12,7 10,4 HTtb 18,2 19,7 18,9 16,5 15,6 14,9 14,3 12,9 9,9 SS 0,3 0,2 0,1 1,1 0,3 0,2 0,2 0,2 0,4 độ HSPL 20 0,51 25 30 0,508 0,481 45 49 Phụ lục Ảnh hưởng độ ẩm đến khả sinh tổng hợp protease chủng A oryzae VTCC-F-0187 pH OD1 OD2 OD3 HS HT1 PL HT2 HT3 HTtb SS 0,65 0,637 0,62 19,9 19,5 19,0 19,5 0,5 0,68 0,701 0,712 20,8 21,5 21,8 21,4 0,5 0,758 0,753 0,739 23,2 23,1 22,6 23,0 0,3 0,831 0,82 0,802 25,5 25,1 24,6 25,1 0,5 0,745 0,793 0,781 22,8 24,3 23,9 23,7 0,8 0,67 0,672 0,689 20,5 20,6 21,1 20,8 0,3 Phụ lục Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh tổng hợp protease chủng A oryzae VTCC-F-0187 Nhiệt HS 25 0,515 0,494 0,485 15,7 15,1 14,8 15,2 0,5 28 0,65 0,656 0,656 19,9 20,1 20,1 20,1 0,1 30 0,778 0,762 0,772 23,8 23,3 23,6 23,7 0,2 33 0,723 0,714 0,726 22,1 21,9 22,2 22,1 0,2 35 0,521 0,545 0,529 15,9 16,6 16,1 16,3 0,4 độ PL HT1 HT2 HT3 HTtb SS Phụ lục Ảnh hưởng độ pH đến khả sinh tổng hợp protease chủng A oryzae VTCC-F-0187 HS PL HT1 HT2 HT3 0,62 19,92896 19,52741 19,00232 19,5 0,5 0,68 0,758 0,701 0,712 0,753 0,739 5 20,8556 23,26486 21,50425 23,11042 21,84402 22,67799 21,4 23,0 0,5 0,3 0,831 0,82 0,802 25,51969 25,17992 24,62394 25,1 0,5 0,745 0,793 0,781 22,86332 24,34595 23,97529 23,7 0,8 0,67 0,672 0,689 20,54672 20,60849 21,13359 20,8 0,3 pH OD1 OD2 OD3 0,65 0,637 HTtb SS 50 Phụ lục Ảnh hưởng thời gian lên men đến khả sinh tổng hợp protease chủng A oryzae VTCC-F-0187 Ngày OD1 OD2 OD3 hspl HT1 HT2 HT3 HTtb SS 0,265 0,251 0,248 8,0 7,6 7,5 7,7 0,3 0,376 0,357 0,382 11,4 10,8 11,6 11,3 0,4 0,61 0,621 18,6 18,6 19,0 18,8 0,2 0,702 0,723 0,725 21,5 22,1 22,2 22,0 0,4 0,819 0,809 0,822 25,1 24,8 25,2 25,1 0,2 0,862 0,886 0,897 26,4 27,2 27,5 27,1 0,6 0,73 0,742 0,721 22,4 22,7 22,1 22,4 0,3 0,609 0,631 0,627 18,6 19,3 19,2 19,1 0,4 0,61 Phụ lục Lên men sản xuất chế phẩm protease chủng A oryzae VTCC-F0187 Lần OD1 OD2 OD3 Lần 0,879 0,899 0,882 Lần 0,862 0,886 Lần 0,86 0,882 Hs HT HT1 HT2 HT3 27,0 27,6 27,1 27,2 0,3 0,887 26,4 27,2 27,2 27,0 0,4 0,891 26,4 27,1 27,4 27,0 0,5 pl tb SS ... Tối ưu số yếu tố môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp protease Thí nghiệm thiết kế độc lập đánh giá ảnh hưởng yếu tố môi trường đến khả sinh tổng hợp protease chủng nấm Aspergillus...ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC LÝ THỊ HUYỀN TỐI ƯU MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG ẢNH HƯỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP PROTEASE CỦA CHỦNG NẤM ASPERGILLUS ORYZAE... VTCC-F-0187 sinh tổng hợp protease 35 Hình 3.3 Ảnh hưởng nồng độ cám gạo đến khả sinh tổng hợp protease chủng A oryzae VTCC-F-0187 3.2.3 Tối ưu độ ẩm Độ ẩm ảnh hưởng đến trao đổi chất chủng nấm q