Nghiên cứu nâng cao khả năng sinh tổng hợp vancomyxin của chủng xạ khuẩn streptomyces orientalis 4912

Bộ giáo dục đào tạo Trường đại học bách khoa hà nội **************** Luận văn thạc sĩ khoa học Nghiên cứu nâng cao khả sinh tổng hợp vancomyxin chủng xạ khuẩn Streptomyces orientalis 4912 Ngành: Công nghệ sinh học Nguyễn bạch liên Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Lê gia hy Hà nội 2006 mục lục Trang phụ bìa i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục bảng vi Danh mục hình vẽ đồ Thị vii Mở đầu Chương Tổng quan 1.1 Quá trình phát triển chất kháng sinh 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu phát triển chất kháng sinh 1.1.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất kháng sinh 1.1.2.1 Trên giới 1.1.2.2 Tại Việt Nam 1.2 Chất kháng sinh 1.2.1 Định nghĩa chất kháng sinh 1.2.2 Nồng độ ức chế tối thiểu 1.2.3 Phổ kháng khuẩn 1.2.4 Đơn vị kháng sinh 1.2.5 Phân loại chất kháng sinh 1.2.6 Cơ chế tác dụng kháng sinh 1.2.6.1 ức chế tổng hợp tế bào 1.2.6.2 Phá huỷ màng nguyên sinh chất 1.2.6.3 øc chÕ tỉng hỵp protein 1.2.6.4 øc chÕ tổng hợp axit nucleic 10 1.2.6.5 ức chế cạnh tranh 10 Nguyễn Bạch Liên 1.2.7 Tính kháng kháng sinh cđa vi sinh vËt 11 1.2.8 øng dơng cđa chÊt kháng sinh 12 1.2.8.1 Chăn nuôi 12 1.2.8.2 Trồng trọt 13 1.2.8.3 Công nghệ thực phẩm 13 1.3.kháng sinh nhóm glycopeptit 13 1.3.1 cấu tạo chung nhóm kháng sinh glycopeptit 13 1.3.2 Đặc tính sinh học nhóm kháng sinh glycopeptit 14 1.4 vancomyXin 15 1.4.1 Lịch sử phát triển kháng sinh vancomyxin 15 1.4.2 Đặc tính vancomyxin 16 1.4.2.1 Công thức phân tử cấu tạo vancomyxin 16 1.4.2.2 Tính chất lý, hoá học đặc tÝnh sinh häc cña vancomyxin 16 a.TÝnh chÊt vËt lý 16 b Tính chất hoá học 17 c Đặc tính sinh học 18 1.4.3 Cơ chế kháng khuẩn vancomyxin 18 1.4.4 ứng dụng điều trị bệnh vancomyxin 20 1.5 Xạ Khuẩn 20 1.5.1 Xạ khuẩn phân bố 20 1.5.2 Cấu tạo xạ khuẩn 21 1.5.3 Sinh trưởng phát triển xạ khuẩn 22 1.5.4 Sự hình thành bào tử xạ khuẩn 23 1.5.5 Khả phát triển sử dụng chất dinh dưỡng 24 1.5.6 Sinh tổng hợp kháng sinh từ xạ khuẩn 25 1.5.7 Sinh tổng hợp vancomyxin xạ khuẩn 26 Nguyễn Bạch Liên 1.5.8 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình tổng hợp vancomyxin xạ khuẩn 27 1.5.8.1 Điều kiện nuôi cấy 27 Nhiệt độ 27 pH môi trường 28 Độ thông khí 28 Lượng giống 28 1.5.8.2 Thành phần môi trường 38 ¶nh h­ëng cđa ngn cacbon 38 ¶nh hưởng nguồn nitơ 29 Khoáng chất 29 1.5.9 Các tác nhân gây đột biến vi sinh vật 30 1.5.9.1 Tác dụng tác nhân vật lý 31 1.5.9.2 Tác dụng axit nitơ 32 1.5.10 Đột biến xạ khuẩn 32 Chương 2- vật liệu phương pháp 33 2.1 Đối tượng nghiên cứu 33 2.1.1 Chủng giống vi sinh vËt 33 2.1.2 Ho¸ chÊt 33 2.1.3 ThiÕt bị 33 2.1.4 Môi trường (xem phần phụ lục) 34 2.2 Phương pháp nghiên cứu 34 2.2.1 Giữ giống 34 2.2.2 Nhân giống 34 2.2.3 Xác định hoạt tính kháng sinh 34 2.2.4 Định lượng kháng sinh 35 2.2.5 Nghiên cứu nâng cao hiệu suất sinh kháng sinh xử lý UV 35 2.2.6 Xây dựng đường cong sống sót 36 Nguyễn Bạch Liên 2.2.7 Xác định biến đổi hình thái khuẩn lạc sau đột biến 36 2.2.8 Xác định biến đổi hoạt tính kháng sinh 36 2.2.9 Xác định chủng có hoạt tính cao 37 2.2.10 Nghiên cứu điều kiện lên men 2.2.10.1 Lựa chọn môi trường lên men 2.2.10.2 Xác định điều kiện lên men ¶nh h­ëng cđa pH ¶nh h­ëng cđa nhiƯt ®é 38 38 38 38 38 ảnh hưởng độ thông khí 38 ảnh hưởng tỷ lệ giống 38 2.2.10.3 Xác định thành phần môi trường lên men ¶nh h­ëng cđa ngn cacbon 39 39 ¶nh hưởng nguồn nitơ 39 ảnh hưởng nguồn muối khoáng 39 2.2.11 Xác định động thái lên men trình lên men 2.2.12 Xác định sinh khối 2.2.13 Phương pháp xác định đường khử DNSA 39 40 40 Chương Kết thảo luận 41 3.1 Một số đặc điểm sinh học chủng S orientalis 4912 41 3.1.1 Đặc điểm hình thái 3.1.2 Đặc điểm nuôi cấy 3.2 Sự biến động tự nhiên hoạt tính kháng sinh chủng S orientalis 4912 41 42 3.3 Xác định đồ thị sống sót cña chñng S orientalis 4912-81 47 44 3.4 Sù biÕn động hình thái hoạt tính kháng sinh chủng S orientalis 4912-81 sau xö lý UV 3.4.1 Sù biến động hình thái chủng S orientalis 4912-81 49 49 3.4.2 Khả sinh tổng hợp kháng sinh chđng S orientalis 4912-81 sau xư lý tia UV 51 Nguyễn Bạch Liên 3.4.3 Xác định biến chủng có hoạt tính kháng sinh cao 3.5 Một số đặc điểm sinh học chủng S orientalis 4912-81-345 3.5.1 Đặc điểm nuôi cấy 3.5.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá chủng S orientalis 4912-81-345 3.5.2.1 Khả sinh enzym ngoại bào 3.5.2.2 Khả đồng hoá nguồn cacbon 54 55 55 59 59 59 3.5.2.3 ¶nh h­ëng cđa nồng độ muối 60 3.5.2.4 ảnh hưởng nhiệt độ 61 3.5.2.5 ảnh hưởng pH ban đầu 62 3.6 Tối ưu trình lên men S orientalis 4912-81-345 3.6.1 Lựa chọn môi trường lên men 3.6.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp vancomycin chủng S orientalis 4912-81-345 3.6.2.1 ảnh hưởng điều kiện lên men 63 63 ảnh hưởng tỷ lệ giống 64 ảnh hưởng pH ban đầu 65 ảnh hưởng độ thông khí 66 3.6.2.2 ảnh hưởng thành phần môi trường lên men 67 ¶nh h­ëng cđa ngn cacbon 67 ¶nh h­ëng cđa ngn nit¬ 68 ¶nh h­ëng cđa muối khoáng 3.7 Động thái trình lên men 71 72 Kết luận 74 Tài liệu tham khảo 75 Phụ lục 81 Tóm tắt luận văn 84 Nguyễn Bạch Liên 64 64 Danh mục bảng Bảng 1.1 Bảng phân loại kháng sinh dựa cấu tạo hoá học Bảng 1.2 Nồng độ cần thiết số muối khoáng Bảng 3.1 Một số đặc điểm nuôi cấy chủng S orientalis 4912 Bảng 3.2 Hoạt tính kháng sinh cđa c¸c chđng S orientalis 4912 sau chän lọc tự nhiên Bảng 3.3 Hoạt tính kháng sinh chủng có hoạt tính cao chủng gốc theo phương pháp đục lỗ Bảng 3.4 ảnh hưởng thời gian xử lý UV lên khả sống sót chủng S orientalis 4912-81 Bảng 3.5 Sự biến đổi hình thái khuẩn lạc chủng S orientalis 4912- 81 sau xử lý UV Bảng 3.6 Hoạt tính kháng sinh cđa c¸c chđng S orientalis 4912-81 sau xư lý UV Bảng 3.7 Hoạt tính kháng sinh typ khuẩn lạc sau đột biến Bảng 3.8 Sự biến đổi hoạt tính kháng sinh chủng S orientalis 4912-81 sau xử lý UV Bảng 3.9 Kết lên men biến chủng sau đột biến chủng đối chứng Bảng 3.10 Một số đặc điểm nuôi cấy chủng S orientalis 4912-81-345 Bảng 3.11 Đặc điểm khuẩn lạc chủng S orientalis 4912-81-345 môi trường nuôi cấy khác Bảng 3.12 Khả sinh enzym ngoại bào chủng S orientalis 4912-81345 Bảng 3.13 khả ®ång ho¸ ngn cacbon cđa chđng S orientalis 491281-345 Ngun Bạch Liên Bảng 3.14 ảnh hưởng nồng độ muối đến khả sinh trưởng vàphát triển chủng S orientalis 4912-81-345 Bảng 3.15 ảnh hưởng nhiệt độ (0 C) đến khả phát triển chủng S P P oientalis 4912-81-345 B¶ng 3.16 ¶nh h­ëng cđa pH đến khả phát triển sinh CKS chủng S orientalis 4912-81-345 Bảng 3.17 Khả sinh tổng hợp CKS chủng S orientalis 4912-81-345 môi trường lên men Bảng 3.18 ảnh hưởng tỷ lệ giống đến khả sinh tổng hợp vancomyxin Bảng 3.19 ảnh hưởng pH đến khả sinh CKS chủng S orientalis 4912-81-345 Bảng 3.20 ảnh hưởng độ thông khí tới khả sinh tổng hợp vancomyxin Bảng 3.21 ảnh hưởng nguồn cacbon lên khả sinh tổng hợp CKS chủng S orientalis 4912-81-345 Bảng 3.22 ảnh hưởng hàm lượng tinh bột tan đến khả sinh tổng hợp vancomyxin Bảng 3.23 ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh tổng hợp vancomyxin Bảng 3.24 ảnh hưởng hàm lượng peptone đến khả sinh tổng hợp vancomyxin Bảng 3.25 ảnh hưởng hàm lượng khô đậu tương đến khả sinh tổng hợp vacomyxin Bảng 3.26 ảnh hưởng muối khoáng đến khả sinh tổng hợp vancomyxin Bảng 3.27 Động thái trình lên men sinh tổng hợp vancomyxin Nguyễn Bạch Liên Danh mục hình đồ thị H×nh 1.1 CÊu tróc hãa häc cđa vancomyxin H×nh 1.2 Quá trình tổng hợp vancomyxin tế bào xạ khuẩn Hình 3.1 Hình dạng bào tử chuỗi bào tử cđa chđng Streptomyces orientalis 4912 (x 7.000) H×nh 3.2 H×nh dạng khuẩn lạc chủng S orientalis 4912 môi trường Gauze ISP1 Hình 3.3 Hình dạng khuẩn lạc chủng S orientalis 4912 môi trường ISP ISP Hình 3.4 Sơ đồ phân bố hoạt tính kháng sinh chủng S orientalis 4912 sau chọn lọc tự nhiên Hình 3.5 Hoạt tính kháng sịnh khuẩn lạc chủng S orientalis 4912 phương pháp cục thạch Hình 3.6 Hoạt tính kháng sinh biến chủng S orientalis 4912 nuôi môi trường 48 Hình 3.7 Đồ thị phân bố hoạt tính kháng sinh chủng có hoạt tính cao chủng gốc theo phương pháp đục lỗ Hình 3.8 Đồ thị đường cong sống sót chủng S orientalis 4912- 81 sau xư lý UV H×nh 3.9 H×nh dạng khuẩn lạc chủng S orientalis 4912- 81 Hình 3.10 Đồ thị phân bố biến đổi hình dạng khn l¹c cđa chđng S orientalis 4912-81 sau xư lý tia UV Hình 3.11 Sơ đồ phân bố hoạt tính kháng sinh chủng S orientalis 4912-81 Hình 3.12 Hình dáng mặt trước mặt sau khuẩn lạc chủng S orientalis 4912-81-345 môi trường Gause Nguyễn Bạch Liên 10 Hình 3.13 Hình dáng mặt trước mặt sau khuẩn lạc chủng S orientalis 4912-81-345 môi trường ISP Hình 3.14 Hình dáng mặt trước mặt sau khuẩn lạc chủng S orientalis 4912-81-345 môi trường 48 Hình 3.15 Đồ thị động thái trình lên men sinh tổng hợp vancomyxin chủng S orientalis 4912-81-345 Nguyễn Bạch Liên 81 nghiệm với hàm lượng khô đậu tương thay đổi khoảng từ 10 50 g/l Kết trình bày bảng 3.25 ảnh hưởng muối khoáng Trong trình lên men sinh tổng hợp vancomyxin, chất khoáng có tác động lớn lên hoạt động enzym Để kiểm tra tác động số loại muối khoáng lên khả sinh vancomyxin, tiến hành thí nghiệm với số muối khoáng cho có tác động tốt lên khả sinh vancomyxin [58] Kết trình bày bảng 3.26 Bảng 3.26 ảnh hưởng muối khoáng đến khả sinh tổng hợp vancomyxin Muối khoáng Vòng vô khuẩn (mm) (mg/l) CaCl 2H O+ MT CuSO 5H O+MT 16,3 15,8 16,8 16,7 18,3 21,3 10 21,6 22,6 20 22 20,4 40 23 19 100 20,6 18 200 16 15,8 R R R R R R R R Kết nghiên cứu cho thấy, nghiên cứu riêng rẽ loại muối khoáng hàm lượng CaCl 2H O thích hợp chọn để lên men 40 mg/l R R R R vòng vô khuẩn 23 mm CuSO 10 mg/l vòng vô khuẩn 22,6 R R mm Khi môi trường có hàm lượng muối khoáng lớn hoạt tính kháng sinh chủng bị giảm Có điều đặc biệt có kết hợp loại muối khoáng vào môi trường MT hàm lượng tối ưu kết qủa thu vòng kháng khuẩn chủng đạt 26 mm Nguyễn Bạch Liên 82 3.7 Động thái trình lên men Từ kết nghiên cứu tối ưu điều kiện nuôi cấy, thành phần môi trường lên men, tiến hành nghiên cứu động thái trình lên men sinh tỉng hỵp vancomycin cđa chđng S orientalis 4912-81-345 thiết bị lên men Bioflo III với thành phần môi trường MT đà tối ưu gồm có (g/l): Tinh bột tan: Pepton: 45 Khô đậu tương: 30 NaCl 2,5 CaCO R R CaCl 2H O 0,04 CuSO 5H O 0,01 R R R R R R R R Quá trình lên men thực với điều kiện ban đầu lượng dịch bổ sung chiếm 50 % thể tích, pH 7,05, nhiệt độ nuôi 28 C, độ tuổi gièng 40 giê, P P l­ỵng gièng bỉ sung % lượng khí cung cấp 1:1 (v/v) Kết trình bày bảng 3.22 hình 3.12 Kết nghiên cứu động thái trình lên men cho thÊy, 24 giê chđng gièng vÉn ch­a ph¸t triĨn đến 48 sinh khối chủng tăng nhanh đạt mg/ml thời điểm chủng bắt đầu sinh chất kháng sinh đạt cực đại 120 giờ, sau bắt đầu giảm dần Điều thể qua độ lớn vòng vô khuẩn 25,5 mm Nếu kéo dài thời gian lên men giá trị hoạt tính kháng sinh tăng lên mà giảm Như vậy, thời điểm kết thúc lên men thích hợp 120 Nguyễn Bạch Liên 83 Bảng 3.27 Động thái trình lên men sinh tổng hợp vancomyxin chủng S orientalis 4912-81-345 Thời gian pH (giờ) Sinh khối Đường khử Vòng v« khuÈn (mg/ml) (mg/ml) (mm) 7,0 49 24 7,3 38,6 48 7,5 7,0 24,5 20 72 7,8 8,1 22,8 24 96 8,0 8,8 17,4 25 120 8,3 9,0 14,9 25,5 144 8,1 9,3 12,0 23 pH, ®­êng khö (mg/ml),sinh khèi (mg/ml) 60 50 40 30 20 10 0 50 100 150 200 thêi gian, pH sinh khối đường khử vòng vô khuẩn Hình 3.15 Đồ thị động thái trình lên men sinh tổng hợp vancomyxin chủng S orientalis 4912-81-345 Nguyễn Bạch Liên 84 Kết luận Từ kết nghiên cứu đưa kết luận sau: Đà nghiên cứu đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh lý, hoá sinh chủng xạ khuẩn Streptomyces orientalis 4912 nhận từ sưu tập giống Phòng Công nghệ lên men Chủng S orientalis 4912 có đặc điểm giống loài Streptomyces orientalis ISP 5040 (Chương trình Xạ khuẩn Quốc tế đà mô tả); chủng có khả sử dụng hầu hết nguồn đường, phát triển tối ­u ë 28 o -30 o C, pH thÝch hỵp 6,0-8,0; chịu muối tối đa 6% P P P P khả tạo xenlulaza Đà nghiên cứu biến động hình thái hoạt tính sinh kháng sinh chủng S orientalis 4912 trước sau xư lý b»ng UV Thêi gian thÝch hỵp cho đột biến chủng S orientalis 4912 UV 40- 50 giây đà chọn chủng xạ khuẩn có hoạt tính sinh kháng sinh cao chủng gốc Đà lựa chọn chủng xạ khuẩn S orientalis 4912-81-345 có khả sinh tổng hợp vancomyxin cao chủng đột biến có khả sinh tổng hợp kháng sinh cao chủng gốc từ 8-30,3% Đà lựa chọn thành phần môi trường lên men MT với thành phần sau (g/l): Tinh bột tan 45; khô đậu tương 30; pepton 6; CaCO 2; NaCl R R 2,5; CaCl 2H O 0,04; CuSO 5H O 0,01; đà lựa chọn đuợc số điều R R R R R R R R kiện lên men thích hợp: pH 7,0; tỷ lệ tiếp giống 6- 8%; độ thông khí 15% nhiệt độ tối ưu 28 o C P P Đà nghiên cứu động thái trình lên men sinh tổng hợp kháng sinh chủng S orientalis 4912-81-345, thời gian tích luỹ sinh khối kháng sinh cao 120 Nguyễn Bạch Liên 85 Tài liệu tham khảo U Tiếng Việt: Báo cáo tổng kết KHKT đề tài KC 04 -09, (2003), Nghiên cứu áp dụng công nghệ sản xuất kháng sinh hiệu cao nguyên liệu nước, Hà Nội Bộ Khoa học, Công nghệ Môi trường (1998), Đề án phát triển Công nghệ Sinh học Việt Nam đến năm 2010, Hà Nội Công báo số 44-10-2002, Quyết định Thủ tướng Chính phủ việc phê duyệt Chiến lược phát triển ngành Dược giai đoạn đến 2010, số 108/2002/QĐ -TTg ngày 15/8/2002, tr 2007-2889 Ngô Đình Quang Bính, V Balussov, S Penep (1992), Thu nhận chế phẩm sinh học Terravit oxytetracyclin hydrochlorid từ S rimorus Tạp chí Khoa học Công nghƯ, sè 6: – 13 Ngun L©n Dịng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2000), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục, Hà Nội Egorov N X (1983): Thùc tËp vi sinh vËt häc (ng­êi dÞch Ngun Lân Dũng) Nhà xuất Mir, Matxcova Đại học THCN, Hà Nội Nguyễn Văn Hiếu, (2005), Nghiên cứu điều kiện lên men sản xuất vancomycin từ chủng xạ khuẩn, Luận văn thạc sỹ nghành Công nghệ sinh học, Hà Nội Lê Gia Hy, Phạm Kim Dung, Nguyễn Hồng Hà, Vũ Thị Nhung, Phạm Bích Hợp, Phạm Minh Hương, Ngô Đình Bính (1992): Tính đối kháng xạ khuẩn phân lập từ đất Việt Nam bệnh đạo ôn, Tạp chí Sinh học, 14(4): 11 12 Lê Gia Hy, Phạm Bích Hợp, Ngô Đình Quang Bính (1992): Nghiên cứu khả sinh chất kháng sinh chống bệnh đạo ôn số chủng xạ Nguyễn Bạch Liên 86 khuẩn (Streptomyces) phân lập Việt Nam T¹p chÝ Sinh häc, 14(4): 59 – 63 10 Lê Gia Hy (1994), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh đạo ôn thối rễ phân lập Việt Nam, Luận án Phó tiến sỹ, Hà Nội 11 Nguyễn Đình Lạc, Lê Gia Hy, Ngô Đình Quang Bính, Cao Minh Kiểm, Nguyễn Quỳnh Châu, Phạm Kim Dung, Lê Thanh Bình (1983): Nghiên cứu sản xuất ứng dụng Biovit-5 chăn nuôi, Báo cáo tổng kết đề tài 48-01-03-03, VKHVN 12 Lê Đình Lương (1975), Di truyền học vi khuẩn, NXB Khoa häc vµ Kü tht Hµ Néi 13 BiỊn Văn Minh, (2000), Nghiên cứu khả sinh chất kháng sinh số chủng xạ khuẩn phân lập từ đất Bình Trị Thiên, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 14 Lương Đức PhÈm (1998), C«ng nghƯ Vi sinh vËt, NXB N«ng nghiƯp, Hà Nội 15 Lương Đức Phẩm, Hồ Sưởng (1978), Vi sinh tổng hợp, Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội 16 Trương Công Quyền, Ngô Kim Liên, Nguyễn Vân Khanh, Hoàng Thanh Châu, Chu Thị Lộc, Đặng Minh Châu, Đặng Tấn Thủy (1991), Điều tra xạ khuẩn (Streptomyces) sinh chất kháng sinh từ đất Việt Nam (Báo tổng kết đề tài, Bộ Y tế), Hà Nội 17 Lê Ngọc Tú (chủ biên) (1997), Hoá sinh công nghiƯp, NXB Khoa häc vµ Kü tht Hµ Néi 18 Lê Quang Toàn (1990), Về công nghệ kháng sinh Việt Nam, Kỷ yếu công trình: Hội thảo công nghệ kháng sinh, tr 1- 13, Hà Nội 19 Tổng công ty Dược Việt Nam (1997), Nghiên cứu kế hoạch đầu tư phát triển công nghiệp kháng sinh thời kỳ 1996 2010, Hà Nội Nguyễn Bạch Liên 87 20 Tổng công ty Duợc Việt Nam (2000), Báo cáo nghiên cứu tiền khả thi Dự án đầu tư xây dựng nhà máy kháng sinh, Bộ Y tế 21 Cao xuân Thu, (2000), Kháng sinh vitamin, Bộ môn Công nghiệp dược, Trường Đại học Dược Hà Nội 22 Trường Đại học Dược Hà Nội (1998), Hoá dược, tập 1, NXB Hµ Néi U TiÕng Anh: 23 Abraham E.P (1990), “Selective reminiscences of β- lactam antibiotics: Early research on penicillin and cephalosporins”, Bioessays, 58, 601- 606 24 Albert J.R Heck, Thomas J.D Jorgensen, (2004), “ Vancomycin in vacuo”, International Journal of Mass Spectrometry, No 236, pp 11-23 25 Alfonso R.G., (2000), The Science and Practice of pharmacy, Lippicatt Willium & Wilkins 26 Arjun Srinivasan, James D.Dick, and Trish M.Perll, (2002), “Vancomycin resistance in Staphylococci”, Clinical Microbiol Review, No 15 (3), pp 430-438 27 Bates J., (1997), “Epidemiology of vancomycin – resistant enterococci in the community and the relevance of farm animals to human infection”, Journal of Hospital Infection, No 37, pp 89-101 28 Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, Vol 4, (1989) 29 Berdy, J: Recent development in antibiotic research and classification of antibiotics according to the chemical structure, Advance in Applied Microbiology, 18: 309 -406 (1974) 30 Chang H N., Lee Y H., Lee C Y (1992), “ Continuous production of 6APA in an aqueous two-phase system”, Ann N Y Acad Sci, p 643-648 31 Chauhan S.et al., (1998) “Penicillin Vacylase, strain characteristics, enzyme immobilization and kinetic studies”, Curr Microbiol Vol 34 (3): 186-190 Nguyễn Bạch Liên 88 32 Demain, A.L (1981), Industrial Microbiology Science, 214: 987 -995 33 Ellaiah P., Adinarayana K., Chand G M., Subramanyam G S., Srinivasulu B (2002), “Strain improvement studies for cephalosporin C production by Cephalosporium acremonium”, Pharmazie, 57(7), 489-490 [24,at] 34 Felmingham D., D.F.J Brown, C J Soussy, and the European Glycopeptide resistance survey study group, (1998), “European Glycopeptide susceptibility suvey of Gram- positive bacteria for 1995”, Diagn microbiol infect dis, No 31, pp 11- 24 35 Greenwood D., and R Whitley, (2002), “Detail information on the modes of action of anti-infective agents”, Cambridge University Press, Cambridge, pp 11-24 36 Hayakawa M., T.Sadakata, T.Kajiiura, H.Nonomuira, (1991), “New methods for highly selective isolation of Micromonospora and Microbiospora from soil”, Journal fementation Biotechnology, Vol 72 (5), pp 320-326 37 Hoopwood D A., Bibb M J., Chater K F, Kieser T, Bruton C J, Kieser H M, Lydiate D J, Smith C P, Ward J M (1985), Genetic manipulation of streptomyces a laboratory manual, pp 35 – 41 38 Holder I.A., A.N Neely (1998), “Vancomycin resistant Enterococci”, BURNS, No 24, pp 389-391 39 Husheng Yan, Xiaohui Cheng and Binglin He, (1998), “Calculation of concentrations of equilibrum components in an vitro activity test of vancomycin antibiotics and the possible mode of action”, Biophyiscal Chemistry, No 74, pp 107 – 115 40 Hyung-Moo, Sang-Yong Kim, Hyung-Hwan Hyun & Jung-Kul Lee (2002), Ca 2+ and Cu 2+ supplementation augments vancomycin production P P P P by Amycolatoppsis orientalis, Biotechnology Letters, 24, pp 293 296 Nguyễn Bạch Liên 89 41 Ivan A.D Lessard, Steve D Pratt, Deweey G Mccafferty, Dirksen E Bussiere, Charles Hutchins, Barry L.Wanner, Leonard Katz and Christopher T Waslch, (1998), “Homologs of the vancomycin resistance D-Ala- D-Ala dipeptidase Van X in Sreptomyces toyocaensis, Escherichia coli and Synechicystis: attributes of catalytic efficiency, stereoselectivity and regulation with implication for function”, Chemistry & Biology, Vol 5(9), pp 489-504 42 Jensen, S E., and A L Demain (1995), “Beta- lactams”, Genetics and biochemistry of antibiotics production, Butterworth-Heinemann, Newton, Mass, 239-268 43 Greenwood D., and R Whitley, (2002), Detail information on the modes of action of anti-infective agents, Cambridge University Press, Cambridge, pp 11-24 44 Lawrence M T., (2001), Current Medical Diagnosis and Treatment, Mc Graww Hill, USA 45 Mack H McCornick, Lawrence and James M McGuire, (1962), Vancomycin and method for its preparation, Patened Dec 4, pp 165-174 46 Medical Microbiology, (2003), “Inhibition of bacterial cell wall synthesis”, The University of Texas Medial Branch at Galveston, pp 4554 47 Michael J.,J Pelczar, E.C.S Chan and R Noel (1993), Antibiotics and other chemotherapeutics agents, in Microbiology concepts and applications, McGraw –Hill, Inc 48 Noris E Allen, Thalia I Nicas, (2003), Mechanism of action of oritavancin and related glycopeptide antibiotics, FEMS Microbiology reviews, No 26, pp 511- 532 49 Rayan C W., (1996), Journal Medical & Chemical., Vol 12, pp 310 NguyÔn Bạch Liên 90 50 Robert E.W Hancock and Daniel.S Chapple, (1999), “Peptide antibiotics”, Antimicrobial agents and chemotherapy, pp 1317 – 1323 51 Queener S.W and Neuss N (1982), “Biosynthesis of β- lactam antibiotics”, Chemistry and biology of β- lactam antibiotics, 3, 1-81, Academic Press, Lt®., London, Unit Kingdom 52 Snell J F (1996), Biosynthesis of Antibiotics, Vol 1, Acad Pr., N Y., London [57,at] 53 Tam, D.V., D.K Duc, M Fetozon and J.C Tabet: Identification of Dekamycin antibiotics, J Chromatograph, 440:71 – 85 (1988) 54 Thomas Staroske and Dudley H.William (1998), “Synthesis of covalent head – to-tail dimers of Vancomycin”, Tetrahedron letters, No 39, pp 4917 – 4920 55 Timothy J Ward, Tanya M Oswald (1997), “Enantioselectivity in cappillary electrophoresis using the macrocylic antibiotics”, Journal of Chromatography A, No 792, pp 309 – 325 56 Truong, C Q., T.L Chu, V.K Nguyen, T.C Hoang, C Thanh and L.Mai:(1977) A new antibiotic Dekamycin, Biologia (Blatislava), 32(3): 217 – 222 57 Turk biol (2003), Investigation of the Antibicrobial Activity of some Streptomyces Isolates, No 27, pp 79-84 58 Yarbrough, G.G., D.P Taulor, R.T Rowlands, M.S Crawford and L.L Lasure (1993), Screening microbioal metabolites for new drugs – Theoretical and pratical issues, J Antibiotics, 535 – 545 59 Waskman S.A (1959), The actinomyces, Vol 1, pp 372 60 Wright G., (2005), Glycopeptide biosynthesis, MAC Biochemistry, No 30, pp1-3 Nguyễn Bạch Liên 91 Phụ lục I.thành phần môi trường nuôi cấy MT Gauze 1(g/l): Tinh bét tan 20; K HPO 0,5; MgSO 0,5; KNO 0,5; R R R R R R R R NaCl 0,5; FeSO 0,01; th¹ch 20; n­íc cÊt lÝt; pH 7,2-7,4 R R MT Gauze (g/l): Cao thÞt 0,5; pepton 5; NaCl 5; glucoza 10; th¹ch 20; n­íc cÊt lÝt; pH 7,0-7,2 MT MPA (g/l): Cao thÞt 5; pepton 10; NaCl 5; th¹ch 20; n­íc cÊt lÝt; pH 7,0 MT 48 (g/l): Cao nÊm men 3; tinh bét tan 10; th¹ch 20; n­íc cÊt lÝt; pH 7,0 MT ISP (g/l): Trypton 5; cao nÊm men 3; th¹ch 20; n­íc cÊt lÝt; pH 7,07,2 MT ISP (g/l): Cao nÊm men 4; cao malt 10; dextrose 4; n­íc cÊt lÝt; th¹ch 20; pH 7,3 MT ISP (g/l): Tinh bét tan 10; K HPO 1; MgSO 7H O 1; NACl 1; R R R R R R R R (NH ) SO 2; CaCO 2; nước cất lít; dung dịch A 1ml; thạch 20; R R R R R R R R pH 7,2-7,4 Dung dÞch muèi A (%): FeSO 0,1; MnCl 0,1; ZnSO 0,1; n­íc cÊt 100 ml R R R R R R MT ISP (g/l): Pepton 1; NaCl 0,5; KNO 1; n­íc cÊt lÝt; pH 7,0 R R MT ISP (g/l): (NH ) SO 2,64; K HPO 5,65; KH PO 2,38; MgSO 1; R R R R R R R R R R R R R R R R dung dÞch B ml; nguồn cacbon 10; thạch đà rửa 20-25; nước cất lÝt; pH 6,8-7,0 Dung dÞch muèi B (%): CuSO 0,64; FeSO 0,11; MgCl 0,79; n­íc cÊt 100 R R R R R R ml 10 MT (g/l): Glucoza 15; bột đậu tương 15; pepton 3; NaCl 2,5; CaCO 2; R R n­íc cÊt lÝt; pH 6,5-7,0 11 MT (g/l): RØ ®­êng 20; pepton 5; glucoza 10; sacaroza 20; CaCO 2; R nước cất lít; pH 6,5-7,0 Nguyễn Bạch Liên R 92 12 MT (g/l): Glucoza 15; bột đậu tương 15; pepton 3; NaCl 2,5; CaCO 2; R R n­íc cÊt lÝt; pH 6,5-7,0 13 MT (g/l): Glucoza 15; khô đậu tương 15; cao ngô 5; NaCl 2,5; CaCO 2; R R n­íc cÊt lÝt; pH 6,5-7,0 14 MT (g/l): Glucoza 15; khô đậu t­¬ng 15; pepton 5; NaCl 2,5; CaCO 2; R R n­íc cÊt lÝt; pH 6,5-7,0 15 MT (g/l): Tinh bét tan 10; pepton 6; NH Cl 2,5; CaCO 2; n­íc cÊt lÝt; R R R R pH 6,5-7,0 16 MT (g/l): Tinh bét tan 10; glucoza 5; pepton 6; (NH )SO 2,5; CaCO 2; R R R R R R n­íc cÊt lÝt; pH 6,5-7,0 17 MT (g/l): Tinh bét tan 10; sacaroza 10; pepton 6; NH Cl 2,5; CaCO 2; R R R R n­íc cÊt lÝt; pH 6,5-7,0 18 MT (g/l): RØ ®­êng 20; glucoza 10; pepton 4; CaCO 2; n­íc cÊt lÝt; pH R R 7,0-7,2 19 MT 10 (g/l): RØ ®­êng 20; pepton 4; glucoza 5; sacaroza 5; n­íc cÊt lÝt; pH 7,0-7,2 20 MT 11 (g/l): Glucoza 10; rØ ®­êng 20; cao nÊm men 2; NaCl 2,5; CaCO ; R R n­íc cÊt lÝt; pH 7,0- 7,2 21 MT 79 (g/l): glucoza 10; pepton 10; cazein thủ ph©n 2; cao nÊm men 2; NaCl 6; K HPO 0,2; th¹ch 20; n­íc cÊt lÝt; pH 7,2-7,4 R R R R 22 MT khoai tây (g/l) : khoai tây miếng 200 ; thạch 20 ; n­íc cÊt 1lÝt ; pH 7,0-7,2 Ngun B¹ch Liên 93 II Một số hình ảnh qúa trình lên men thiết bị Bioflo III Nguyễn Bạch Liên 94 Tóm tắt luận văn Nghiên cứu nâng cao khả sinh tổng hợp vancomyxin chủng xạ khuẩn Streptomyces orientalis 4912 Vancomyxin kháng sinh thuộc nhóm glycopeptit có hoạt tính kháng vi khuẩn Gram (+) như: Staphylococcus, Streptococcus, Corynebacterium kể chủng kháng lại penixillin Ngày vancomyxin sử dụng điều trị hữu hiệu số bệnh nhiễm khuẩn, đặc biệt bệnh gây nên vi khuẩn đà nhờn với kháng sinh thông dụng khác Việc sản xuất thuốc kháng sinh nói chung hay vancomyxin nói riêng điều kiện Việt Nam vấn đề cấp thiết nhằm giải tình trạng thiếu thuốc chữa bệnh tình trạng giá thuốc cao nhập chủ yếu Trước thực tế đó, giao thực đề tài: Nghiên cứu nâng cao khả sinh tổng hợp vancomyxin chủng xạ khuẩn Streptomyces orientalis 4912 Chúng đà nghiên cứu biến động hình thái hoạt tính sinh kháng sinh chủng S orientalis 4912 tr­íc vµ sau xư lý b»ng UV đà lựa chọn chủng xạ khuẩn Streptomyces orientalis 4912-81-345 có khả sinh tổng hợp kháng sinh lớn chủng gốc khoảng 30,3% Chúng đà lựa chọn môi trường lên men tối ưu thành phần môi trường lên men MT sau (g/l): Tinh bột tan 45; khô đậu tương 30; pepton 6; CaCO 2; NaCl 2,5; CaCl 2H O 0,04; CuSO 5H O 0,01; đà lựa chọn R R R R R R R R R R số điều kiện lên men thích hợp: pH 7,0; tỷ lệ tiếp giống 6- 8%; độ thông khí 15% nhiệt độ tối ưu 28 o C Qua kết nghiên cứu động thái P P trình lên men sinh tổng hợp kháng sinh chủng S orientalis 4912-81345, đà xác định thời gian tích luỹ sinh khối kháng sinh cao chủng S orientalis 4912-81-345 120 Từ khoá: lên men; kháng sinh; Streptomyces orientalis; vancomyxin Nguyễn Bạch Liên 95 Enhancement of vancomycin productivity of Streptomyces orientalis 4912 Vancomycin is a glycopeptide antibiotic that is widely used in Vietnam for the treatment of infectious diseases caused by streptococci and Gram-positive bacteria, especially those strains of Staphylococcus, Streptococcus and Corynebacterium which are resistant to penicilin Since treatment by this imported antibiotics is rather costly, its domestic production represents great scientific and economical interest In our study, strain Streptomyces orientalis 4912 has been studied with respect to the biological and cultivation characteristics and vancomycin activity This project aims to enhance the productivity of this strain through repeated selection after treatment by UV-radiation The vancomycin productivity of selected positive variants was enhanced from to 30.3% compared to the original strain The medium and conditions for the enhancement of vancomycin productivity was studied Resulting medium MT5 contained (g/l): soluble starch, 45; soybean meal, 30; pepton, 6.0; CaCO , 2.0; NaCl, 2.5; R R R R CaCl 2H O, 0.04; CuSO 5H O, 0.01; pH 7.0 Shake flask cultivations were R R R R R R R R performed for 120 hours under the following conditions: inoculum rate, 6-8%; aeration, 15% v/v; temperature 28 C; agitation, 200 rpm Harvested biomass P P gained around 9.0 mg/ml dried weight and the peak of vancomycin activity was determined as the clear zone diameter of 25,5mm Key word: antibiotic; fermentation; Streptomyces orientalis; vancomycin; Nguyễn Bạch Liên ... dưỡng 24 1.5.6 Sinh tổng hợp kháng sinh từ xạ khuẩn 25 1.5.7 Sinh tổng hợp vancomyxin xạ khuẩn 26 Nguyễn Bạch Liên 1.5.8 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình tổng hợp vancomyxin xạ khuẩn 27 1.5.8.1... lên khả sinh tổng hợp CKS chủng S orientalis 4912- 81-345 Bảng 3.22 ảnh hưởng hàm lượng tinh bột tan đến khả sinh tổng hợp vancomyxin Bảng 3.23 ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh tổng hợp vancomyxin. .. 1.5.7 sinh tổng hợp vancomyxin xạ khuẩn Cũng giống đường sinh tổng hợp nhóm glycopeptit, vancomyxin tổng hợp cách ngưng tụ đơn vị nhỏ mà đơn vị lại tạo thành từ đường sinh tổng hợp riêng Sự tổng hợp