Nghiên cứu sản xuất kháng huyết thanh rubella sử dụng cho kiểm định vắc xin tại việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Formatted: Font: Times New Roman PHẠM THÀNH TRƯỜNG Formatted: Font: Times New Roman Formatted: Font: Times New Roman NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT KHÁNG HUYẾT THANH RUBELLA SỬ DỤNG CHO KIỂM ĐỊNH VẮC XIN TẠI VIỆT NAM Formatted: Font: Times New Roman CHUYÊN NGHÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS TRƯƠNG QUỐC PHONG TS NGÔ THU HƯỜNG Formatted: Font: Times New Roman Hà Nội - Năm 2018 Luận văn thạc sĩ Khoa học Phạm Thành Trường- CB160060 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan, cơng trình nghiên cứu khoa học tơi cộng phòng Kiểm định vắc xin hướng dẫn PGS.TS Trương Quốc Phong TS Ngô Thu Hường Các số liệu, kết luận văn trung thực chưa công bố cơng trình khác Học viên Phạm Thành Trường Xác nhận quan (Trung tâm Nghiên cứu Sản xuất Vắc xin Sinh phẩm Y tế) LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới: PGS TS Trương Quốc Phong, Trung tâm nghiên cứu phát triển công nghệ sinh học – Viện công nghệ sinh học công nghệ thực phẩm - Trường Đại học bách khoa Hà Nội TS Ngơ Thu Hường – Trưởng phịng kiểm định, Trung tâm nghiên cứu, sản xuất Vắc xin sinh phẩm Y tế trực tiếp giảng dạy hướng dẫn thực đề tài Trong thời gian học tập nghiên cứu vừa qua, nhận giúp đỡ tạo điều kiện thầy cô Viện công nghệ sinh học công nghệ thực phẩm thầy Phịng Đào tạo - Trường Đại học bách khoa Hà Nội Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ q báu Tồn nội dung nghiên cứu khóa luận thực hồn thành phịng Kiểm định vắc xin, Trung tâm Nghiên cứu, sản xuất vắc xin sinh phẩm y tế (POLYVAC) Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ quý báu tập thể cán phòng Kiểm định tạo điều kiện nhiệt tình giúp đỡ tơi thời gian thực đề tài Nhân xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban lãnh đạo Trung tâm Nghiên cứu, sản xuất vắc xin sinh phẩm y tế (POLYVAC) cử nhân Nguyễn Xuân Hòa Trưởng phòng Sản xuất vắc xin Sởi bán thành phẩm, nơi công tác, tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian học tập nghiên cứu Cuối xin chân thành cảm ơn bạn bè đồng nghiệp gia đình ln quan tâm giúp đỡ động viên tơi suốt thời gian học tập hồn thành khóa luận Hà Nội, Ngày tháng năm 2018 Học viên Phạm Thành Trường Luận văn thạc sĩ Khoa học Phạm Thành Trường- CB160060 CÁC CHỮ VIẾT TẮT BHKCPE Baby hamster kidney: tế bào thận chuột đồng sơ sinh.Cytopathic Formatted Table effect (đám hoại tử tế bào) Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 13 pt, Not Bold, Font color: Auto CPE Cytopathic effect (đám hoại tử tế bào) CR Mẫu chứng âm CFA Freund’s Complete Adjuvants (Ttá dược hoàn chỉnh) FBS Fetal Bovine Serum (hHuyết bê bào thai) FL Tế bào ung thư màng ối người GMP Good Manufacturing Practice (tThực hành sản xuất tốt) HI Haemagglutination Inhibition (Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu) IFA Freund’s Incomplete Adjuvants (tTá dược khơng hồn chỉnh) IgA Imunoglobulin A IgG Imunoglobulin G IgM Imunoglobulin M LM Liquid Medium (môi trường lỏng) M33 Chủng virus Rubella MEM Minimum Essential Medium (mMôi trường cần thiết tối thiểu) MR Measles-Rubella (Mẫu vắc xin phối hợp sởi -– rubella) MS Master Seed (chủng giống gốc) OSS Out of specification (ngoài tiêu chuẩn) PB Phospate Buffer PBS Phosphate Buffered Saline (dung dịch đệm muối phốt phát) POLYVAC Trung tâm Nghiên cứu, sản xuất Vắc xin Sinh phẩm Y tế Rb Rubella RK13 Tế bào thận thỏ Newzealand (dòng tế bào thường trực) SCD Soybean Casein Digest SPF Specific Pathogen Free (không chứa tác nhân gây bệnh) TCMR Tiêm chủng mở rộng TGC Thioglycolate TRYPSIN-EDTA Trypsin-Ethylen Diamine Tetra Acetic acid Formatted: Font: (Default) Times New Roman, 13 pt, Font color: Auto Formatted: Font: (Default) Arial, 12 pt Formatted: Font color: Auto Formatted: Default Paragraph Font, Font: (Default) Times New Roman, 13 pt, Not Bold, Font color: Auto, Pattern: Clear Formatted: Default Paragraph Font, Font: (Default) Times New Roman, 13 pt, Not Bold, Font color: Auto, Pattern: Clear Formatted: Font color: Auto Luận văn thạc sĩ Khoa học Phạm Thành Trường- CB160060 Vero Tế bào thận khỉ xanh châu phi (dòng tế bào thường trực) WFI Water for injection (nước pha tiêm) WHO World Health Organization (Tổ chức y tế giới) WS Working Seed (chủng sản xuất) Luận văn thạc sĩ Khoa học Phạm Thành Trường- CB160060 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình ảnh cấu trúc virus rubella .44 Field Code Changed Hình 1.2 Cấu trúc virus Rubella kính hiển vi điện tử 55 Formatted: Font: Times New Roman, 13 pt, Font color: Auto Hình 1.3 Sự sâm nhập nhân lên virus .77 Hình 1.4 Phân tích vùng gen đảm nhiệm chức nhạy cảm với nhiệt độ virus Rubella .1111 Hình 1.5 Tạo virus thay vùng p150 virus rubella tính nhạy cảm với nhiệt độ 1212 Hình 2.1 Hình ảnh quy trình lấy máu toàn thu huyết lợn .3331 Hình 2.2 Hình ảnh quy trình tiêm thu hồi máu thỏ 3634 Hình 2.3 Đọc kết mycoplasma dựa màu sắc môi trường 3735 Hình 2.4 Hình ảnh chuẩn độ ngược kháng nguyên HA 3936 Hình 2.5 Hình ảnh chuẩn độ hiệu giá kháng thể HI 3937 Hình 2.6 Hình ảnh plaque giếng 4139 Hình 2.7 Hình ảnh đám hủy hoại virus rubella kính hiển vi huỳnh quang 4240 Hình 3.1 Hiệu giá kháng nguyên rubella quy trình nghiên cứu 4543 Hình 3.2 Hiệu giá kháng huyết thu nhóm lợn thử nghiệm 4745 Hình 3.3 Hiệu giá kháng huyết thu nhóm thỏ thử nghiệm 5451 Hình 3.4 Hình ảnh tế bào vero, PRK, RK13 mẫu có virus, mẫu virus trung hịa kháng huyết mẫu đối chứng 6157 Hình 3.5 Hình ảnh tế bào vero sử dụng kháng huyết Nhật Bản (A), POLYVAC sản xuất (B) tế bào đối chứng .6359 Hình 3.6 Hình ảnh tế bào FL sử dụng kháng huyết Nhật Bản (A), POLYVAC sản xuất (B) tế bào đối chứng .6460 Hình 3.7 Hình ảnh tế bào PRK sử dụng kháng huyết Nhật Bản (A), POLYVAC sản xuất (B) tế bào đối chứng .6561 Hình 3.8 Hình ảnh plaque virus rubella (đốm bắt màu đen) thử nghiệm hiệu giá ổn định nhiệt sử dụng kháng huyết Nhật Bản (A) POLYVAC sản xuất (B) Formatted: Font: Times New Roman, 13 pt Luận văn thạc sĩ Khoa học Phạm Thành Trường- CB160060 .6662 Hình 3.9 Hiệu giá trung bình loạt vắc xin mẫu chuẩn Rb-R0113 sử dụng kháng huyết Nhật Bản kháng huyết POLYVAC sản xuất .6763 Hình 3.10 Độ giảm hiệu giá trung bình thử nghiệm ổn định nhiệt loạt vắc xin mẫu chuẩn Rb-R0113 sử dụng kháng huyết Nhật Bản kháng huyết POLYVAC sản xuất 6964 Formatted: Font: Times New Roman, 13 pt, Font color: Auto Hình 3.11 Hình ảnh nhận dạng virus rubella (đám tế bào phát màu xanh sáng) sử dụng kháng huyết Nhật Bản (A) POLYVAC sản xuất (B) 7065 Formatted: Font: Times New Roman, 13 pt, Font color: Auto Formatted: Font: Times New Roman, 13 pt Formatted: Font: Times New Roman, 13 pt Hình 1.1 Hình ảnh cấu trúc virus rubella 44 Formatted Hình 1.2 Cấu trúc virus Rubella kính hiển vi điện tử 55 Formatted Hình 1.3 Sự sâm nhập nhân lên virus 77 Formatted Hình 1.4 Phân tích vùng gen đảm nhiệm chức nhạy cảm với nhiệt độ virus Rubella .1111 Formatted Hình 1.5 Tạo virus thay vùng p150 virus rubella tính nhạy cảm với nhiệt độ 1212 Formatted Hình 2.1 Hình ảnh quy trình lấy máu toàn thu huyết lợn .3131 Formatted Hình 2.2 Hình ảnh quy trình tiêm thu hồi máu thỏ 3434 Formatted Hình 2.3 Đọc kết mycoplasma dựa màu sắc môi trường 3535 Formatted Hình 2.4 Hình ảnh chuẩn độ ngược kháng nguyên HA 3636 Formatted Hình 2.5 Hình ảnh chuẩn độ hiệu giá kháng thể HI 3737 Formatted Hình 2.6 Hình ảnh plaque giếng 3939 Formatted Hình 2.7 Hình ảnh đám hủy hoại virus rubella kính hiển vi huỳnh quang 4040 Formatted Hình 3.1 Hiệu giá kháng nguyên rubella quy trình nghiên cứu 4343 Formatted Hình 3.2 Hiệu giá kháng huyết thu nhóm lợn thử nghiệm 4545 Formatted Hình 3.3 Hiệu giá kháng huyết thu nhóm thỏ thử nghiệm 5151 Formatted Hình 3.4 Hình ảnh tế bào vero, PRK, RK13 mẫu có virus, mẫu virus trung hịa kháng huyết mẫu đối chứng 5757 Formatted Hình 3.5 Hình ảnh tế bào vero sử dụng kháng huyết Nhật Bản (A), POLYVAC Formatted: Font: 13 pt, Font color: Auto Luận văn thạc sĩ Khoa học Phạm Thành Trường- CB160060 sản xuất (B) tế bào đối chứng .5959 Hình 3.6 Hình ảnh tế bào FL sử dụng kháng huyết Nhật Bản (A), POLYVAC sản xuất (B) tế bào đối chứng .6060 Hình 3.7 Hình ảnh tế bào PRK sử dụng kháng huyết Nhật Bản (A), POLYVAC sản xuất (B) tế bào đối chứng .6161 Hình 3.8 Hình ảnh plaque virus rubella (đốm bắt màu đen) thử nghiệm hiệu giá ổn định nhiệt sử dụng kháng huyết Nhật Bản (A) POLYVAC sản xuất (B) 6262 Hình 3.9 Hiệu giá trung bình loạt vắc xin mẫu chuẩn Rb-R0113 sử dụng kháng huyết Nhật Bản kháng huyết POLYVAC sản xuất .6363 Formatted: Font: Times New Roman, 13 pt Formatted: Font: Times New Roman, 13 pt Formatted: Font: 13 pt, Font color: Auto Formatted: Font: Times New Roman, 13 pt Formatted: Font: Times New Roman, 13 pt Formatted: Font: 13 pt, Font color: Auto Formatted: Font: Times New Roman, 13 pt Formatted: Font: Times New Roman, 13 pt Formatted: Font: 13 pt, Font color: Auto Formatted: Font: Times New Roman, 13 pt Formatted: Font: Times New Roman, 13 pt Formatted: Font: 13 pt, Font color: Auto Formatted: Font: Times New Roman, 13 pt Hình 3.10 Độ giảm hiệu giá trung bình thử nghiệm ổn định nhiệt loạt vắc xin mẫu chuẩn Rb-R0113 sử dụng kháng huyết Nhật Bản kháng huyết POLYVAC sản xuất 6464 Hình 3.11 Hình ảnh nhận dạng virus rubella (đám tế bào phát màu xanh sáng) sử dụng kháng huyết Nhật Bản (A) POLYVAC sản xuất (B) 6565 Formatted: Font: Times New Roman, 13 pt Formatted: Font: 13 pt, Font color: Auto Formatted: Font: Times New Roman, 13 pt Formatted: Font: Times New Roman, 13 pt Formatted: Font: 13 pt, Font color: Auto Formatted: Font: Times New Roman, 13 pt Hình 1.1 Hình ảnh cấu trúc virus rubella Formatted: Font: Times New Roman, 13 pt Hình 1.2 Cấu trúc virus Rubella kính hiển vi điện tử Formatted: Font color: Auto Hình 1.3 Sự sâm nhập nhân lên virus Formatted: Font color: Auto Hình 2.1 Hình ảnh quy trình lấy máu toàn thu huyết lợn 28 Formatted: Font color: Auto Hình 2.2 Hình ảnh quy trình tiêm thu hồi máu thỏ 31 Formatted: Font color: Auto Hình 2.3 Đọc kết mycoplasma dựa màu sắc môi trường .32 Formatted: Font color: Auto Hình 2.4 Hình ảnh chuẩn độ ngược kháng nguyên HA .34 Formatted: Font color: Auto Hình 2.5 Hình ảnh chuẩn độ hiệu giá kháng thể HI .34 Formatted: Font color: Auto Hình 2.6 Hình ảnh plaque giếng 36 Formatted: Font color: Auto Hình 2.7 Hình ảnh đám hủy hoại virus rubella kính hiển vi huỳnh quang .37 Formatted: Font color: Auto Hình 3.1 Hiệu giá kháng nguyên rubella quy trình nghiên cứu 40 Formatted: Font color: Auto Hình 3.2 Hiệu giá kháng huyết thu nhóm lợn thử nghiệm 42 Formatted: Font color: Auto Hình 3.3 Hiệu giá kháng huyết thu nhóm thỏ thử nghiệm .48 Formatted: Font color: Auto Formatted: Font color: Auto Luận văn thạc sĩ Khoa học Phạm Thành Trường- CB160060 Hình 3.4 Hình ảnh tế bào vero sử dụng kháng huyết Nhật Bản (A), POLYVAC sản xuất (B) tế bào đối chứng 55 Formatted: Font color: Auto Hình 3.5 Hình ảnh tế bào FL sử dụng kháng huyết Nhật Bản (A), POLYVAC sản xuất (B) tế bào đối chứng 56 Formatted: Font color: Auto Hình 3.6 Hình ảnh tế bào PRK sử dụng kháng huyết Nhật Bản (A), POLYVAC sản xuất (B) tế bào đối chứng 57 Formatted: Font color: Auto Hình 3.7 Hình ảnh plaque virus rubella (đốm bắt màu đen) thử nghiệm hiệu giá ổn định nhiệt sử dụng kháng huyết Nhật Bản (A) POLYVAC sản xuất (B) .58 Formatted: Font color: Auto Hình 3.8 Hiệu giá trung bình loạt vắc xin mẫu chuẩn Rb-R0113 sử dụng kháng huyết Nhật Bản kháng huyết POLYVAC sản xuất 59 Formatted: Font color: Auto Hình 3.9 Độ giảm hiệu giá trung bình thử nghiệm ổn định nhiệt loạt vắc xin mẫu chuẩn Rb-R0113 sử dụng kháng huyết Nhật Bản kháng huyết POLYVAC sản xuất 60 Formatted: Font color: Auto Hình 3.10 Hình ảnh nhận dạng virus rubella (đám tế bào phát màu xanh sáng) sử dụng kháng huyết Nhật Bản (A) POLYVAC sản xuất (B) .61 Formatted: Font color: Auto Luận văn thạc sĩ Khoa học Phạm Thành Trường- CB160060 DANH MỤC CÁC BẢNG, BIỂU ĐỒ Bảng 1.1 Các đường tiêm sử dụng không sử dụng tá dược 1717 Bảng 1.2 Thể tích tiêm tối đa hỗn hợp kháng nguyên/tá dược vị trí tiêm lồi động vật khác .1818 Bảng 2.1 Quy trình tiêm lợn tạo kháng huyết nhóm thử nghiệm 2726 Bảng 2.2 Quy trình tiêm thỏ tạo kháng huyết nhóm thử nghiệm 3432 Bảng 3.1 Tối ưu hố thời điểm thay mơi trường quy trình sản xuất kháng nguyên rubella 4442 Bảng 3.2 Kết hiệu giá kháng huyết lợn nhóm thử nghiệm 4644 Bảng 3.3 Kết hiệu giá kháng huyết thỏ nhóm thử nghiệm 5350 Bảng 3.4 Kết kiểm tra chất lượng kháng huyết thỏ lợn .5855 Bảng 3.5 Kết hiệu giá loạt vắc xin mẫu chuẩn Rb-R0113 sử dụng kháng huyết Nhật Bản kháng huyết POLYVAC sản xuất 6662 Bảng 3.6 Kết ổn định nhiệt loạt vắc xin mẫu chuẩn Rb-R0113 sử dụng kháng huyết Nhật Bản kháng huyết POLYVAC sản xuất 6864 Bảng 1.1 Các đường tiêm sử dụng không sử dụng tá dược 1717 Bảng 1.2 Thể tích tiêm tối đa hỗn hợp kháng nguyên/tá dược vị trí tiêm lồi động vật khác .1818 Bảng 2.1 Quy trình tiêm lợn tạo kháng huyết nhóm thử nghiệm 2626 Bảng 2.2 Quy trình tiêm thỏ tạo kháng huyết nhóm thử nghiệm 3232 Bảng 3.1 Tối ưu hố thời điểm thay mơi trường quy trình sản xuất kháng nguyên rubella 4242 Bảng 3.2 Kết hiệu giá kháng huyết lợn nhóm thử nghiệm 4444 Bảng 3.3 Kết hiệu giá kháng huyết thỏ nhóm thử nghiệm 5050 Bảng 3.4 Kết kiểm tra chất lượng kháng huyết thỏ lợn .5555 Bảng 3.5 Kết hiệu giá loạt vắc xin mẫu chuẩn Rb-R0113 sử dụng kháng huyết Nhật Bản kháng huyết POLYVAC sản xuất 6262 Field Code Changed Formatted: Font color: Auto Luận văn thạc sĩ Khoa học Phạm Thành Trường – CB160060 Phạm Thành Trường – CB160060 Formatted: Font: Times New Roman Formatted: Font: Times New Roman A B Tế bào đối chứng Hình 3.554 Hình ảnh tế bào vero sử dụng kháng huyết Nhật Bản (A), POLYVAC sản xuất (B) tế bào đối chứng Formatted: Font: Times New Roman Field Code Changed Formatted: Font: Times New Roman, Font color: Auto Từ kết thu cho thấy kháng huyết Polyvac sản xuất có chất lượng kiểm định khơng có khác biệt so với kháng huyết Nhật Bản – đơn vị chuyển giao công nghệ sản xuất vắc xin rubella cho Việt Nam sử dụng Như tiêu chuẩn chất lượng kháng huyết thu được, tính đặc hiệu kháng thể sản xuất sử dụng cho thử nghiệm phát tác nhân ngoại lai Chúng đánh giá kháng huyết lợn Polyvac sản xuất đảm bảo yêu cầu chất lượng tính đặc hiệu cho thử nghiệm phát tác nhân ngoại lai tế bào vero Formatted: Font: Times New Roman 3.4.1.2 Thử nghiệm phát tác nhân ngoại lai tế bào FL Tiến hành thử nghiệm nhận dạng lô sản xuất vắc xin bán thành phẩm rubella loạt R0118, R0218, R0318 loại kháng huyết Polyvac sản xuất kháng huyết Nhật Bản sản xuất, thực tế bào FL Kết Formatted: Font color: Auto thu quan sát kính hiển vi cho thấy hình ảnh tế bào thời điểm quan sát cuối thử nghiệm mẫu sử dụng kháng huyết Nhật Bản kháng huyết Polyvac sản xuất khơng thay đổi hình dạng (khơng có đám hoại tử) so với tế bào đối chứng (sử dụng môi trường thay cho mẫu virutvirus) khơng có tượng hấp phụ hồng cầu bề mặt tế bào 62 Formatted: Font color: Auto Luận văn thạc sĩ Khoa học Phạm Thành Trường – CB160060 Phạm Thành Trường – CB160060 Formatted: Font: Times New Roman Formatted: Font: Times New Roman A B Tế bào đối chứng Hình 3.665 Hình ảnh tế bào FL sử dụng kháng huyết Nhật Bản (A), POLYVAC sản xuất (B) tế bào đối chứng Field Code Changed Formatted: Font: Times New Roman, Font color: Auto Từ kết thu được, tiêu chuẩn chất lượng kháng huyết thu được, tính đặc hiệu kháng thể sản xuất sử dụng cho thử nghiệm phát tác nhân ngoại lai, đánh giá kháng huyết lợn Polyvac sản xuất đảm bảo yêu cầu chất lượng tính đặc hiệu cho thử nghiệm phát tác nhân ngoại lai tế bào FL Formatted: Font: Times New Roman 3.4.1.3 Thử nghiệm phát tác nhân ngoại lai tế bào PRK Tiến hành thử nghiệm nhận dạng lô sản xuất vắc xin bán thành phẩm rubella loạt R0118, R0218, R0318 loại kháng huyết Polyvac sản xuất kháng huyết Nhật Bản sản xuất, thực tế bào PRK Kết Formatted: Font color: Auto thu quan sát kính hiển vi cho thấy hình ảnh tế bào thời điểm quan sát cuối thử nghiệm mẫu sử dụng kháng huyết Nhật Bản kháng huyết Polyvac sản xuất khơng thay đổi hình dạng (khơng có đám hoại tử) so với tế bào đối chứng (sử dụng môi trường thay cho mẫu virutvirus) khơng có tượng hấp phụ hồng cầu bề mặt tế bào 63 Formatted: Font color: Auto Luận văn thạc sĩ Khoa học Phạm Thành Trường – CB160060 Phạm Thành Trường – CB160060 Formatted: Font: Times New Roman Formatted: Font: Times New Roman Formatted: Font: Times New Roman Formatted: Font: Times New Roman A B Tế bào đối chứng Hình 3.776 Hình ảnh tế bào PRK sử dụng kháng huyết Nhật Bản (A), POLYVAC sản xuất (B) tế bào đối chứng Tương tự kết thu sử dụng kháng huyết thử nghiệm phát tác nhân ngoại lại tế bào Vero tế bào FL Chúng đánh giá kháng huyết lợn Polyvac sản xuất đảm bảo yêu cầu chất lượng tính đặc hiệu cho thử nghiệm phát tác nhân ngoại lai tế bào PRK 3.4.2 Ứng dụng kháng huyết sản xuất từ thỏ kiểm định vắc xin Toàn kháng huyết rubella sản xuất từ thỏ kiểm tra chất lượng vô trùng Mycoplasma, kết đạt nên sử dụng thử nghiệm kiểm định vắc xin rubella Polyvac bao gồm thử nghiệm đo hiệu giá, ổn định nhiệt thử nghiệm nhận dạng virus mẫu vắc xin thành phẩm Các kháng huyết sử dụng cho thử nghiệm song song với kháng huyết Nhật Bản cung cấp loạt vắc xin thành phẩm MR01180318 vắc xin mẫu chuẩn 3.4.2.1 Thử nghiệm chuẩn độ hiệu giá vắc xin phối hợp sởi-rubella thành phẩm Các kết cho thấy hình ảnh plaque thử nghiệm hiệu giá ổn định nhiệt rõ ràng, dễ đọc 64 Field Code Changed Formatted: Font: Times New Roman, Font color: Auto Luận văn thạc sĩ Khoa học Phạm Thành Trường – CB160060 Phạm Thành Trường – CB160060 Formatted: Font: Times New Roman Formatted Table Plaque B A Hình 3.887 Hình ảnh plaque virus rubella (đốm bắt màu đen) thử nghiệm hiệu giá ổn định nhiệt sử dụng kháng huyết Nhật Bản (A) POLYVAC sản xuất (B) Kết hiệu giá mẫu chuẩn nằm khoảng giá trị quản lý 3,9-4,2 Formatted: Font color: Auto Field Code Changed Formatted: Font color: Auto Formatted: Font color: Auto lg PFU/0,5 ml, hiệu giá virus rubella loạt vắc xin nằm tiêu chuẩn chấp thuận  3,0 lg PFU/0,5 ml Kết sử dụng kháng huyết thỏ Polyvac Nhật Bản cho kiểm định chuẩn độ hiệu giá thể chi tiết bảng 3.5: Bảng 3.5555 Kết hiệu giá loạt vắc xin mẫu chuẩn RbR0113 sử dụng kháng huyết Nhật Bản kháng huyết POLYVAC sản xuất Hiệu giá (lg PFU/0,5 ml) Mẫu RbR0113 Loạt Kháng huyết Nhật Kháng huyết Bản POLYVAC 4,02 4,05 4,06 4,03 4,1 4,15 Trung bình 4,06 4,08 CV Vắc xin MR0118 1,19% 3,75 65 3,71 Field Code Changed Luận văn thạc sĩ Khoa học Phạm Thành Trường – CB160060 Phạm Thành Trường – CB160060 MR0218 3,71 3,72 MR0318 3,76 3,75 Trung bình 3,74 3,73 CV 0,6 % Formatted: Font: Times New Roman Formatted: Font: Times New Roman Hình 3.998 Hiệu giá trung bình loạt vắc xin mẫu chuẩn Rb-R0113 sử dụng kháng huyết Nhật Bản kháng huyết POLYVAC sản xuất Từ kết thu nhận thấy độ lệch chuẩn kết hiệu giá loại kháng huyết sử dụng thấp: 1,19% mẫu chuẩn vắc xin, 0,6% 66 Field Code Changed Formatted: Font: Times New Roman, Font color: Auto Luận văn thạc sĩ Khoa học Phạm Thành Trường – CB160060 Phạm Thành Trường – CB160060 loạt vắc xin điều chứng tỏ sử dụng kháng huyết POLYVAC sản xuất kết tương đối ổn định khơng có khác biệt với kết sử dụng kháng huyết Nhật Bản 3.4.2.2 Thử nghiệm ổn định nhiệt vắc xin sởi-rubella thành phẩm Kết độ giảm hiệu giá ủ mẫu vắc xin phối hợp sởi- rubella thành phẩm 370C so với 40C loạt vắc xin mẫu chuẩn, sử dụng kháng huyết Nhật Bản kháng huyết POLYVAC sản xuất thể bảng 3.6: Bảng 3.6666 Kết ổn định nhiệt loạt vắc xin mẫu chuẩn Rb-R0113 sử dụng kháng huyết Nhật Bản kháng huyết POLYVAC sản xuất Field Code Changed Ổn định nhiệt (giảm ≤ 1,0 lg) Mẫu Loạt Kháng huyết Kháng huyết Nhật Bản POLYVAC 0,02 0,01 Rb- 0,12 0,09 R0113 0,05 0,09 Trung bình 0,06 0,06 MR0118 0,02 MR0218 0,08 0,06 MR0318 0,05 0,04 Trung bình 0,04 0,04 Vắc xin Từ kết thu chúng tơi có đồ thị kết sau: 67 Formatted Table Luận văn thạc sĩ Khoa học Phạm Thành Trường – CB160060 Phạm Thành Trường – CB160060 Formatted: Font: Times New Roman Formatted: Font: Times New Roman Hình 3.10109 Độ giảm hiệu giá trung bình thử nghiệm ổn định nhiệt loạt vắc xin mẫu chuẩn Rb-R0113 sử dụng kháng huyết Nhật Bản kháng huyết POLYVAC sản xuất Kết độ giảm hiệu giá thử nghiệm ổn định nhiệt loạt vắc xin mẫu chuẩn thu không 1,0 lg ủ 370C so với 40C Cho thấy kháng huyết sản xuất đáp ứng yêu cầu chất lượng tính đặc hiệu cho thử nghiệm đo hiệu giá vắc xin 3.4.2.3 Thử nghiệm nhận dạng virus rubella Hình ảnh nhận dạng nhận biết đám tế bào phát màu xanh huỳnh quang rõ ràng loại kháng huyết Kết cho thấy kháng huyết mà chúng tơi sản xuất hồn tồn đáp ứng yêu cầu chất lượng, sử dụng cho thử nghiệm kiểm định chất lượng vắc xin theo tiêu chuẩn WHO 68 Field Code Changed Formatted: Font: Times New Roman, Font color: Auto Luận văn thạc sĩ Khoa học Phạm Thành Trường – CB160060 Phạm Thành Trường – CB160060 Formatted: Font: Times New Roman A Đám tế bào nhiễm virut rubella phát màu xanh huỳnh quang B Hình 3.111110 Hình ảnh nhận dạng virus rubella (đám tế bào phát màu xanh sáng) sử dụng kháng huyết Nhật Bản (A) POLYVAC sản xuất (B) Formatted: Centered Field Code Changed Formatted: Font color: Auto Formatted: Font: Times New Roman 69 Luận văn thạc sĩ Khoa học Phạm Thành Trường – CB160060 Phạm Thành Trường – CB160060 KẾT LUẬN Từ kết thu đưa số kết luận sau: Đã xây dựng lựa chọn quy trình sản xuất kháng nguyên rubella: quy Formatted: Font color: Auto trình thay môi trường thực sau ngày gây nhiễm virus rubella thu hoạch hỗn dịch virus sau ngày thay môi trường Đã xây dựng lựa chọn quy trình sản xuất kháng huyết thỏ lợn với hiệu giá cao o Quy trình sản xuất lợn: Mũi mũi tiêm 10 ml (5 ml virutvirus Rubella + ml CFA), tiêm mông Từ mũi thứ tiêm ml virutvirus Rubella vào mông Tiến hành lấy máu toàn vào thời điểm 56 ngày thử nghiệm o Quy trình sản xuất kháng huyết thỏ: Mũi tiêm da 5ml (2,5 ml Rubella + 2,5 ml CFA) Mũi mũi tiêm da đùi, ml/con Tiêm mũi da đùi, 10 ml/con Tiêm tĩnh mạch tai mũi 5,6, 10 ml/con Lấy máu toàn ngày thứ 70 thử nghiệm Kháng huyết sản xuất đảm bảo chất lượng vơ trùng, tính đặc hiệu virus rubella, không nhiễm mycoplasma, hiệu giá đạt tiêu chuẩn quy định ≥ 512 đơn vị Kháng huyết sản xuất chất lượng tương đương với kháng huyết Nhật Bản Kháng huyết lợn sử dụng tốt cho thử nghiệm: phát tác nhân ngoại lai (trên loại tế bào PRK, Vero, FL) Kháng huyết thỏ sử dụng cho thử nghiệm xác định hiệu giá ổn định nhiệt, nhận dạng virus rubella mẫu vắc xin thành phẩm rubella theo tiêu chuẩn tổ chức Y tế giới (WHO) 70 Formatted: Font color: Auto Luận văn thạc sĩ Khoa học Phạm Thành Trường – CB160060 Phạm Thành Trường – CB160060 KIẾN NGHỊ Formatted: Font: Times New Roman - Sử dụng kháng huyết rubella thỏ lợn cho thử nghiệm vắc xin bán thành phẩm rubella, vắc xin thành phẩm phối hợp sởi – rubella (MR) - Nghiên cứu thêm yếu tố ảnh hưởng tới tính ổn định quy trình sản xuất kháng huyết 71 Luận văn thạc sĩ Khoa học Phạm Thành Trường – CB160060 Phạm Thành Trường – CB160060 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đặng Thị Thanh Huyền, Dương Thị Hồng, Nguyễn Thành Trung, Nguyễn Công Luật (2015), ““Đặc điểm dịch tễ học bệnh Rubella Việt Nam Formatted: Font: Not Italic năm 2008-2012”,” Tạp chí y học dự phòng số (168)2015 Số đặc biệt , tr 216 Formatted: Font: Italic - 225 Hoàng Thị Thanh Thủy (2011), Nghiên cứu tình hình đình thai nghén nhiễm rubella Bệnh viện Phụ sản Trung ương tháng đầu năm 2011,, Luận văn tốt nghiệp nội trú, Trường Đại học Y Hà Nội, Hà Nội Nhà xuất y học (2018), “Dược điển Việt Nam”, lần tái thứ 5, tập 2, tr Formatted: Font color: Auto PL394 -395 Trần Như Dương, Vũ Hải Hà, Phạm Quang Thái, Phạm Văn Khang, Nguyễn Thị giám sát bệnh viện Nhi trung ương, 2011-2016”, Tạp chí y học dự Formatted: Font: Not Italic Formatted: Font: Italic Triệu Thị Thanh Vân, Phạm Thị Thu Hằng, Nguyễn Thị Mai Duyên, Đỗ Phương Loan “Dịch tễ sinh học phân tử virus Rubella Việt Nam, 2008-2013”, Tạp Formatted: Font: Not Italic chí y học dự phòng số 10 (183)2016 Số đặc biệt , tr 27 - 35 Formatted: Font: Italic AKIRA SHISHIDO and MISAO OHTAWARA (1976), “ DEVELOPMENT OF ATTENUATED RUBELLA VIRUS VẮC XINS IN JAPAN” Japan Med Sci Biol., 29, 227-253, 1976 Akingbade D, Cohen BJ, Brown DW (2003), “Detection of Low-Avidity Immunoglobulin G in Oral Fluid Samples: New Approach for Rubella Diagnosis and Surveillance”, Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, Vol 10, No 1, pp 189- 190 Formatted: Font color: Auto Formatted: Font color: Auto Tiếng Anh Formatted: Font: Italic, Font color: Auto Thu Hương , Lê Hải Đăng “ Một số đặc điểm dịch tễ hội chứng rubella bẩm sinh phòng số 10 (183)2016 Số đặc biệt , tr 35 - 43 Formatted: Font color: Auto Almeida JD, Griffith AH (1980), “Viral infections and rheumatic factor”, 72 Luận văn thạc sĩ Khoa học Phạm Thành Trường – CB160060 Phạm Thành Trường – CB160060 Lancet, (8208–8209), pp 1361–13622 Amy Johnson and Brenda Ross (2007), “Perinatal infections”, John Hopkins Manual of Gynecology and Obstetrics, pp 136- 149 10 Bashayer Aseeri, Reem Abahussain, Safiah Al-mushawah, Norah Al-samih, Nadia Alruji (2016) “Rubella virus (German measles)” Kingdom of Saudi Arabia King Saud University College of Science 11 Ben Saleh A, Zaatour A, Pomery L (2003), “Validation of a modified commercial assay for the detection of rubella-specific IgG in oral fluid for use in population studies”, J Virol Methods, 114, pp 151–158 12 Best JM, Banatvala JE, Morgan-Capner P, et al (1989), “Fetal infection after maternal reinfection with rubella: criteria for defining reinfection”, Br Med J, 299, pp 773–775 13 Best JM, Castillo-Solorzano C, Spika JS, et al (2004), Reducing the global burden of congenital rubella syndrome, Report of theWHO Steering Committee on Research Related to Measles and Rubella Vắc xins and Vaccination, June, J Infect Dis 2005, 192(11), pp 1890 14 Best JM, O’Shea S, Tipples G, et al (2002), “Interpretation of rubella serology in pregnancy—pitfalls and problems”, Br Med J; 325: pp 47–48 15 Bosma TJ, Corbett KM, O’Shea S, et al (1995a), “PCR for detection of rubella virus RNA in clinical samples”, J Clin Microbio, 33, pp 1075–1079 16 Bottiger B, Jensen IP (1997), “Maturation of rubella IgG avidity over time after acute rubella infection”, Clin Diagn Virol, 8(2), pp 105–111 17 Bowden DS, Westaway EG (1984), “Rubella virus: structural and non structural proteins”, J, Gen, Virol, 65, pp 933-943 18 Bowden DS, Westaway EG (1985), “Changes in glycosylation of rubella virus envelope proteins during maturation”, J, Gen, Virol, 66, pp 201-206 19 Brookhouser PE, and Bordley JE (1973), “Congenital rubella deafness”, 73 Luận văn thạc sĩ Khoa học Phạm Thành Trường – CB160060 Phạm Thành Trường – CB160060 Arch, Otolaryngol, 98, pp 252–257 20 Canadian Council on Animal Care (2002) Guidelines on: antibody production ISBN: 0-919087-37-X 21 CDC (2005b), Achievements in public health: elimination of rubella and congenital rubella syndrome—United States 1969–2004, Morb Mortal Wkly Rep, 54, pp 279 22 CDC (2010), Progress toward control of rubella and prevention of congenital rubella syndrome - worldwide, MMWR Morb Mortal Wkly Rep, 15,59(40), pp 1307-1310 23 Chantler J, Wolinsky JS, Tingle A (2001), Rubella virus, In: Fields Virology (Fields BN, Knipe DM, Howley PM, editors), Philadelphia, Lippincott, Williams and Wilkins, pp 963 24 Cheong Ai Theng, Khoo Ee Ming (2008), “Prevalence of Rubella Susceptibility Among Pregnant Mothers in a Community- Based Antenatal Clinic in Malaysia: A Cross- Section Study”, Asia- Pacific Journal of Public Health, Vol 20, No 4, pp 340- 346 25 Cutts FT, Vynnycky E (1999), “Modelling the incidence of congenital rubella syndrome in developing countries”, Int J Epidemiol, 28, pp 1176 26 Cutts SE, Robertson JL, Diaz-Orterga et al (1997), Control of rubella and congenital rubella syndrome (CRS ) in developing countries, part : burden of disease from CRS, WHO Bulletin OMS Vol 75, 1997, pp 55- 68 27 Dominguez G, Wang C-Y, Frey TK (1990) “Sequence of the genome RNA of rubella virus: evidence for genetic rearrangement during togavirus evolution”, Virology, 177, pp 225 28 Dontigny L, Arsenault MY, Martel MJ et al (2008), “Rubella in Pregnancy”, J Obstet Gynecol Can, 30(2), pp 152- 158 29 Frey TK, Abernathy ES, Bosma TJ, et al (1998), “Molecular analysis of rubella virus epidemiology across three continents, North America, Europe and Asia, 1961–1997”, J Infect Dis, 178, pp 642–650 74 Field Code Changed Luận văn thạc sĩ Khoa học Phạm Thành Trường – CB160060 Phạm Thành Trường – CB160060 30 Frey TK, Wolinsky JS (1999), Rubella virus (Togaviridae), In: Encyclopedia of Virology (Granoff A, Webster RG, editors), San Diego: Academic Press, pp 1592 31 Frey TK (1994), Molecular biology of rubella virus, Adv, Virus Res, 44, pp 69-160 32 Gilles RG Monif, David AB (2005), “Rubella, Infections diseases in pregnancy”, Obstetrics and Gynecology, pp 252- 265 33 Halliday LC, Artwohl JE, Hanly WC, et al (2000) Physiologic and behavioral assessment of rabbits immunized with Freund’s Complete Adjuvant Contemporary Topics of Laboratory Animal Science 30(7): 8- 13 34 Hobman TC, Lundstrom ML, Mauracher CA, et al (1994), “Assembly of rubella virus structural proteins into virus-like particles in transfected cells”, Virology, 202(2), pp 574–585 35 Ho-Terry L, Cohen A (1982), “Rubella virion polypeptides: characterization by polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing and peptide mapping”, Arch, Virol, 72, pp 47-54 36 Ho-Terry L, Cohen A (1984), “The role of glycosylation on haemagglutination and immunological reactivity of rubella virus”, Arch, Virol, 79, pp 139-146 37 Hudson P, Morgan-Capner P (1996), “Evaluation of 15 commercial enzyme immunoassays for the detection of rubella-specific IgM”, Clin Diagn Virol, 5, pp 21–26 38 Icenogle JP, Frey TK, Abernathy E, et al (2006), “Genetic analysis of rubella viruses found in the United States between 1966 and 2004: evidence that indigenous rubella viruses have been eliminated”, Clin Infect Dis, 43(suppl 3) 39 Jia-Yee-Lee and D, Scott Bowden (2000), “Rubella Virus Replication and links to Teratogenicity”, Clinical Microbiology Reviews, October 2000, Vol 13, No 4, pp 571-587 75 Luận văn thạc sĩ Khoa học Phạm Thành Trường – CB160060 Phạm Thành Trường – CB160060 40 Katow S, Minahara H, Fukushima M, Yamaguchi Y (1997), “Molecular epidemiology of rubella by nucleotide sequences of the rubella virus E1 gene in three East Asian countries”, J Infect Dis, 176, pp 602 41 Koonin EV, Gorbalenya AE, Purdy MA, et al (1992), Computer-assisted assignment of functional domains in the nonstructural polyprotein of hepatitis E virus: delineation of an additional group of positive-strand RNA plant and animal viruses, Proc Natl Acad Sci USA, 89, pp 8259 42 Kuhn RJ, Zhang W, Rossmann MG, et al (2002), Structure of dengue virus: implications for flavivirus organization, maturation, and fusion, Cell, 108, pp 717 43 Law LM, Everitt JC, Beatch MD, et al (2003), “Phosphorylation of rubella virus capsid regulates its RNA binding activity and virus replication”, J Virol, 77, pp 1764 44 World Health Organization (1994) Requirements for measles, mumps and rubella vaccines and combined vaccine (live), WHO Technical Report Series, No 840, annex3 76 ... thực đề tài nghiên cứu: ? ?Nghiên cứu sản xuất kháng huyết rubella sử dụng cho kiểm định vắc xin Việt Nam? ?? với mục tiêu: − Sản xuất kháng huyết đặc hiệu với virus rubella − Ứng dụng kháng huyết đặc... Ứng dụng kháng huyết rubella thu kiểm định vắc xin rubella 6258 3.4.1 Ứng dụng kháng huyết rubella sản xuất từ lợn kiểm định vắc xin 6258 3.4.2 Ứng dụng kháng huyết sản. .. rubella Formatted 3.4 Ứng dụng kháng huyết rubella thu kiểm định vắc xin rubella5 4 3.4.1 Ứng dụng kháng huyết rubella sản xuất từ lợn kiểm định vắc xin 54 3.4.2 Ứng dụng kháng