Nghiên cứu bán tổng hợp tetrahydrocurcumin curcurmin trắng và khả năng ứng dụng trong mỹ phẩm và thực phẩm chức năng

Xuất phát từ những lý do trên, em tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu bán tổng hợp tetrahydrocurcumin curcumin trắng và khả năng ứng dụng trong mỹ phẩm và thực phẩm chức năng” Mục đ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-

VŨ NGỌC HOÀNG

NGHIÊN CỨU BÁN TỔNG HỢP TETRAHYDROCURCUMIN (CURCUMIN TRẮNG) VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG TRONG MỸ PHẨM VÀ THỰC

PHẨM CHỨC NĂNG

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Hà Nội – 2018

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-

VŨ NGỌC HOÀNG

NGHIÊN CỨU BÁN TỔNG HỢP TETRAHYDROCURCUMIN (CURCUMIN TRẮNG) VÀ KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG TRONG MỸ PHẨM VÀ THỰC

PHẨM CHỨC NĂNG

LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1 PGS.TS NGUYỄN THỊ MINH TÚ

2 TS NGUYỄN MAI CƯƠNG

Hà Nội – 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn này là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS Nguyễn Thị Minh Tú và TS Nguyễn Mai Cương Các số liệu và kết quả trong luận văn là trung thực và chưa được công bố trong bất kỳ tài liệu nào

Tôi xin cam đoạn mọi sự giúp đỡ trong quá trình hoàn thành luận văn

đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được ghi rõ nguồn gốc

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong luận văn này

Hà Nội, tháng năm 2018 Học viên

Vũ Ngọc Hoàng

Xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã khích lệ, động viên và giúp đỡ em vượt qua mọi khó khăn để hoàn thành luận văn này

Hà Nội, tháng năm 2018 Học viên

Vũ Ngọc Hoàng

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH ẢNH ix

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu chung về chi Nghệ Curcuma 3

1.2 Curcumin 4

1.2.1 Đặc tính lý hóa của curcumin 4

1.2.2 Hoạt tính sinh học của curcumin 6

1.3 Dẫn xuất Tetrahydrocurcumin (THC) 9

1.3.1 Đặc tính lý hóa của THC 9

1.3.2 Hoạt tính sinh học của THC 9

1.3.2.1 Tác dụng chống ôxi hóa 11

1.3.2.2 Tác dụng kháng viêm 15

1.3.2.3 Hoạt tính chống ung thư 16

1.3.2.4 Các hoạt tính khác 17

1.3.3 Ứng dụng của THC 18

1.3.4 Các phương pháp bán tổng hợp THC 18

1.3.5 Tình hình xuất - nhập khẩu THC 20

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

2.1 Vật liệu nghiên cứu 21

2.1.1 Nguyên liệu 21

2.1.2 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu 21

2.1.2.1 Hóa chất nghiên cứu 21

2.1.2.2 Thiết bị nghiên cứu 21

2.2 Phương pháp nghiên cứu 22

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của các thông số công nghệ tinh chế curcuminoid từ hàm lượng 95% lên 98% 22

2.2.1.1 Thiết kế thí nghiệm: Quy trình tinh chế curcuminoid từ hàm lượng 95% lên 98% 22

2.2.1.2 Ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất phản ứng 23

2.2.1.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ kết tinh đến hiệu suất phản ứng 23

2.2.1.4 Ảnh hưởng của thời gian kết tinh đến hiệu suất phản ứng 23

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của các thông số công nghệ đến quy trình bán tổng hợp THC (hàm lượng  90%) 23

2.2.2.1 Thiết kế thí nghiệm: Quy trình bán tổng hợp THC (hàm lượng  90%) 23

2.2.2.2 Nghiên cứu lựa chọn xúc tác phản ứng phù hợp cho quy trình bán tổng hợp THC 25

2.2.2.3 Khảo sát lựa chọn dung môi tối ưu cho phản ứng 25

2.2.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của áp suất đến hiệu suất phản ứng 25

2.2.2.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất phản ứng 26

2.2.2.6 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến hiệu suất thu nhận THC 26

2.2.2.7 Nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ xúc tác/nguyên liệu đến hiệu suất thu nhận THC 26

2.2.2.8 Nghiên cứu phương pháp thu hồi và tái sử dụng xúc tác 26

2.2.2.9 Nghiên cứu các điều kiện kết tinh THC thô 27

2.2.3 Quy trình tinh chế tetrahydrocurcumin đạt hàm lượng trên 98% 27

2.2.4 Phương pháp phân tích 27

2.2.4.1 Phương pháp đo điểm chảy 27

2.2.4.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng: 27

2.2.4.3 Các phương pháp phân tích phổ 27

2.2.5 Phương pháp tính hiệu suất thu hồi sản phẩm 28

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Xây dựng quy trình tinh chế curcuminoid hàm lượng 95% lên 98% 29

3.1.1 Ảnh hưởng của hệ dung môi kết tinh đến hiệu suất và hàm lượng curcuminoid 29

3.1.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến hiệu suất kết tinh 33

3.2 Xây dựng quy trình bán tổng hợp THC  90% 35

3.2.1 Lựa chọn xúc tác phản ứng phù hợp cho quy trình bán tổng hợp 35

3.2.2 Lựa chọn dung môi tối ưu cho phản ứng 37

3.2.3 Ảnh hưởng của áp suất đến hiệu suất phản ứng 38

3.2.4 Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất phản ứng 39

3.2.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến hiệu suất thu nhận THC 40

3.2.6 Ảnh hưởng của nồng độ xúc tác đến hiệu suất thu nhận THC 41

3.2.7 Thu hồi và tái sử dụng xúc tác 42

3.2.8 Các điều kiện kết tinh THC thô 43

3.2.9 Xây dựng quy trình thu nhận THC thô từ curcuminoid ≥ 98% 45

3.3 Quy trình làm sạch THC thô sau kết tinh 47

3.3.1 Ảnh hưởng của lượng than hoạt tính đến hàm lượng THC kết tinh 47

3.3.2 Xác định cấu trúc của sản phẩm THC kết tinh 49

3.4 Đánh giá chất lượng sản phẩm và khả năng ứng dụng trong mỹ phẩm và thực phẩm chức năng 51

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

PHỤ LỤC 58

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DAC: diacetyl curcumin DHC: dihydrocurcumin HHC: hexahydrocurcuminHPLC: Sắc ký hiệu năng caoNaC: natri curcuminatOHC: octahydrocurcuminTEC: triethyl curcuminTHC: TetrahydrocurcuminTLC: Sắc ký bản mỏng

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Danh mục các hóa chất đã sử dụng trong nghiên cứu 21

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của % MeOH đến hiệu suất kết tinh lần 1, hiệu suất kết

tinh lần 2 và hiệu suất kết tinh tổng

29

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của % aceton đến hiệu suất kết tinh lần 1, hiệu suất kết

tinh lần 2 và hiệu suất kết tinh tổng

31

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của % ethyl axetat trong n-hexan đến hiệu suất kết tinh

lần 1, hiệu suất kết tinh lần 2 và hiệu suất kết tinh tổng

33

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hiệu suất kết tinh lần 1, hiệu suất kết tinh

lần 2 và hiệu suất kết tinh tổng

34

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của thời gian tới hiệu suất kết tinh 1, hiệu suất kết tinh

lần 2 và hiệu suất kết tinh tổng

34

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của xúc tác tới hiệu suất thu nhận sản phẩm 36

Bảng 3.7: Tính chất cơ bản của Ni-Raney sau khi hoạt hóa 36

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất thu nhận sản phẩm 37

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của áp suất tới hiệu suất thu nhận sản phẩm 38

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất thu nhận sản phẩm 40

Bảng 3.11 Ảnh hưởng của tỉ lệ xúc tác/nguyên liệu đến hiệu suất thu nhận

Bảng 3.13 Ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất kết tinh 43

Bảng 3.14 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất kết tinh 44

Bảng 3.15 Ảnh hưởng của lượng than hoạt tính đến quá trình làm sạch 48

Hình 1.8 Hoạt tính chống oxi hóa của curcuminoid và tetrahydrocurcuminoid

Hình 1.9 Khả năng ức chế của THC, curcumin và BDMC đối với gốc DPPH 15 Hình 1.10 Tình hình nhập khẩu THC của một số nước trên thế giới trong 3 năm

Hình 2.2: Quy trình tinh chế curcuminoid hàm lượng từ 95% lên 98% 22 Hình 2.3 Xây dựng quy trình bán tổng hợp THC (hàm lượng  90%) 24

Hình 3.3: TLC của sản phẩm kết tinh lại trong axetone 80% 32 Hình 3.4: TLC của sản phẩm kết tinh lại trong ethyl acetate/n-hexane:7/3 33

Hình 3.6: Hình ảnh SEM của xúc tác Ni-Raney trước và sau khi hoạt hóa 43 Hình 3.7 TLC của hỗn hợp phản ứng trong các dung môi khác nhau 37 Hình 3.8 TLC của hỗn hợp phản ứng tại áp suất 3,5 – 5 bar 38 Hình 3.9: Ảnh hưởng của thời gian đến phản ứng tạo sản phẩm 39

Hình 3.15 TLC của hỗn hợp phản ứng tại điều kiện tối ưu 47 Hình 3.16 TLC của sản phẩm sau tảy màu ở các tỉ lệ than hoạt tính khác nhau 48

Hình 3.18 TLC của các phân đoạn thu được khi chạy sắc ký cột 51 Hình 3.19 Enol:5-hydroxy-1,7-bis-(4-hydroxy-3-methoxy-phenyl)-heptan-3-one 52

MỞ ĐẦU

Từ xa xưa, củ nghệ đã được sử dụng phổ biến ở một số nước Châu Á như một thứ gia vị chính giúp điều hương, tạo mùi vị và màu sắc hấp dẫn cho thực phẩm Không những thế, nghệ còn được biết đến như một loại thuốc quý dùng để trị mụn nhọt, làm liền sẹo, làm lành vết thương … và đặc biệt dùng để chữa bệnh có liên quan đến dạ dày Ngày nay, cùng với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, người ta

đã phát hiện ra nhóm nhất màu curcuminoid – tuy chỉ chiếm tỉ lệ nhỏ nhưng là nhóm hoạt chất chính tạo nên các tác dụng sinh học quan trọng của củ nghệ Trong những năm gần đây, cùng với xu hướng quay trở về sử dụng các sản phẩm từ thiên nhiên, việc phát triển những hoạt chất có nguồn gốc thảo dược ngày càng trở thành mối quan tâm lớn Trong đó, nhóm chất màu curcuminoid được chiết xuất từ thân rễ

của cây Nghệ vàng Curcuma longa đã thu hút nhiều sự quan tâm của các nhà khoa

học bởi các tác dụng sinh học quan trọng Curcumin là thành phần chính được tìm thấy trong thân cây nghệ vàng, ngoài ra còn có demethoxycurcumin, bisdemethoxycurcumin Curcumin đã được nghiên cứu và chứng minh có tác dụng sinh học như chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng virus, kháng viên, chống ung thư, làm lành vết thương, làm liền sẹo,

… Mặc dù, curcumin có nhiều tác dụng quan trọng, tuy nhiên lại có nhược điểm là khó tan trong nước, độ ổn định kém, bị chuyển hóa nhanh chóng khi sử dụng theo đường uống; do đó sinh khả dụng của curcumin thấp Mặt khác, curcumin lại có màu vàng và khó rửa sạch nên nhu cầu sử dụng curcumin bị hạn chế, đặc biệt, trong

mỹ phẩm Với những hạn chế của curcumin thì việc sử dụng curcumin trong các chế phẩm dùng ngoài da và mỹ phẩm dần được thay thế bằng tetrahydrocurcumin (THC), một chất bán tổng hợp từ curcumin THC là hoạt chất có tiềm năng ứng dụng lớn trong bào chế mỹ phẩm bởi tác dụng kháng viêm, chống ôxi hóa mạnh và tính chất không màu của nguyên liệu Đồng thời, THC được coi là chất chuyển hóa cuối cùng của curcumin trong cơ thể, do đó nếu sử dụng THC thay thế thì có thể khắc phục được nhược điểm sinh khả dụng kém của curcumin Chính vì hiệu quả điều trị, giá trị kinh tế nếu được bào chế thích hợp và xuất phát từ nhu cầu cho sản phẩm đầu ra được thị trường quan tâm, THC được rất nhiều các nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu nhiều và hiện có một vài nghiên cứu phát triển quy trình bán tổng hợp THC phục vụ cho quy mô sản xuất Năm 2009, THC đã được

nhóm nghiên cứu của Trần Khắc Vũ tại Đại học Bách khoa Hà Nội, bán tổng hợp

sử dụng xúc tác Zn-NiCl2 kết hợp sóng siêu âm Tuy nhiên, kết quả mới chỉ dừng ở nghiên cứu thăm dò quy mô phòng thí nghiệm, hiệu suất không cao, chưa thể ứng dụng trong sản xuất Sau đó, nhóm nghiên cứu bán tổng hợp các hoạt chất có hoạt tính sinh học của Viện Hóa học Công nghiệp Việt Nam đã tiến hành nghiên cứu tổng hợp THC qua đề tài cấp bộ của Bộ Công Thương đã được nghiệm thu năm

2013 Xuất phát từ những lý do trên, em tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu

bán tổng hợp tetrahydrocurcumin (curcumin trắng) và khả năng ứng dụng trong mỹ phẩm và thực phẩm chức năng”

Mục đích của đề tài:

Xây dựng quy trình bán tổng hợp THC

Nội dung nghiên cứu:

- Nội dung 1: Xây dựng quy trình tinh chế curcuminoid hàm lượng 95% lên

98%

- Nội dung 2: Xây dưng quy trình bán tổng hợp THC  90%

- Nội dung 3: Xây dựng quy trình tinh chế THC  98%

- Nội dung 4: Đánh giá chất lượng sản phẩm và khả năng ứng dụng trong mỹ

phẩm và Thực phẩm chức năng

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về chi Nghệ Curcuma

Từ thời xa xưa cây họ Gừng (Zingiberaceae) đã được sử dụng làm gia vị

trong thực phẩm và làm thuốc trong Y học cổ truyền Ấn Độ, Trung Quốc, Việt Nam

… Trong đó có một số loài thuộc chi Nghệ (Curcuma) như C longa (Nghệ vàng),

C aromatica (Nghệ dại) và C xanthorrhiza (Nghệ Java) Trong đông y, vị thuốc có

tên khương hoàng - Rhizoma curcuma longae - chính là thân rễ của nghệ vàng,

được thái lát, hấp trong 6 - 12 giờ, sau đó để ráo nước rồi phơi nắng và sấy khô Khương hoàng có vị đắng, tính bình, có tác dụng hành khí, hoạt huyết, làm tan máu đọng và giảm đau, chữa viêm loét dạ dày, tá tràng, viêm gan, vàng da, kinh nguyệt không đều Bột nghệ còn được dùng ngoài để chữa thấp khớp, tay, chân đau nhức, mụn nhọt, ghẻ Tương tự, từ lâu trong dân gian con người đã biết kết hợp nghệ với mật ong hấp vào nồi cơm ăn hàng ngày vào 10 giờ sáng, 10 giờ tối hoặc lúc dạ dày đói nhất chữa viêm loét dạ dày, giúp thông ứ, hành huyết…, dùng khoảng 3 - 6 tháng sẽ thấy hiệu quả Nghệ tươi giã nát, lọc lấy nước uống có thể chữa ngộ độc bã đậu [3]

Một số chất được phân lập từ các loài Curcuma là các chất có hoạt chất sinh

học quý (Hình 1.1) Ví dụ, curcumol (1), một sesquiterpene tách ra từ C

aromatica, thể hiện hoạt tính cao trong điều trị ung thư cổ tử cung [20] Tuy

nhiên, phần lớn dược tính có khả năng trị bệnh của các loài Curcuma nằm ở các

curcuminoid, là các polyphenol và là chất tạo màu vàng cho củ nghệ Chất màu curcuminoid chiếm 0,3%, là tinh thể nâu đỏ, ánh tím, không tan trong nước, tan trong rượu, ete, cloroform, dung dịch có huỳnh quang màu xanh lục Màu sắc của curcuminoid biến đổi theo môi trường pH, trong axit có màu đỏ tươi, trong kiềm

có màu đỏ máu rồi ngả tím Hiện nay, đã có hơn 2000 bài báo về các tác dụng sinh học và tính chất hóa học của các curcuminoid [8, 10, 30]

Các hợp chất curcuminoid trong C longa và các loài Curcuma khác chủ yếu

là curcumin (2), demethoxycurcumin (DMC) (3) và bisdemethoxycurcumin (BDMC) (4) Trong số này, curcumin được nghiên cứu nhiều nhất và thể hiện một

loạt các tác dụng sinh học như chống viêm, chống oxi hóa, chống HIV, phòng

chống nguy cơ ung thư, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư đường tiêu hóa

O H

O O

OH

OMe MeO

O O

OH

Curcumol (1) Curcumin (2)

Demethoxycurcumin (3) Bisdemethoxycurcumin (4)

Hình 1.1 Một số chất có hoạt tính sinh học quý đƣợc

phân lập từ các loài Curcuma

1.2 Curcumin

Curcumin là thành phần chính của Curcuminoid trong củ nghệ Curcuma

longa Linn Từ thế kỷ XIX, trong phần chất rắn kết tinh từ cao dịch chiết của củ

nghệ vàng, người ta đã phân lập được các dẫn xuất feruloylmetan có màu vàng cam

là curcumin và các chất tương tự

1.2.1 Đặc tính lý hóa của curcumin

O H

7 1' 2' 3' 4' 5' 6'

Màu sắc: Vàng cam tươi

Tính tan: Tan trong axeton, metanol, etanol, etylaxetat, tan trong dung dịch kiềm nhưng không tan trong nước ở pH trung tính và axit Để hòa tan curcumin trong nước người ta phải sử dụng các chất hoạt động bề mặt như natri dodecyl sulfat, gelatin, polysacharid, polyetylenglycol, cyclodextran Trong dung dịch,

curcumin tồn tại ở trạng thái cân bằng giữa dạng keto và dạng enol Cấu trúc dạng enol ổn định hơn về mặt năng lượng ở pha rắn và dạng dung dịch [14]

Bằng cách hòa tan curcumin trong các dung dịch đệm phosphate ở pH từ

1-11 và phân tích trên thiết bị HPLC, Tonnesen và các cộng sự (1985) đã xác định được các dạng tồn tại của curcumin trong dung dịch và góp phần giải thích cơ chế solvat hóa curcumin ở các pH khác nhau [46]

+ pH < 1: Curcumin tồn tại ở dạng H4A+, dung dịch có màu đỏ:

O H

R1

OH

R2 OH

O

R2 OH

O

-pH 8,5: HA2- có dạng:

O H R1

O

R2 O

O

-pH 9: A3- có dạng:

O R1

O

R2 O

O

-

O H

O

OH

R2 R1

OH

O H

R1

OH

R2 OH O

Các hợp chất curcumin nhìn chung tương đối bền ở môi trường axit (pH<1)

Ở trong dung dịch nước có pH > 8,5, chỉ sau khoảng 30 giờ curcumin bị thủy phân thành axit ferulic và feruloylmetan – hợp chất sẽ bị thủy phân tiếp tục thành vanilin

và axeton theo sơ đồ dưới đây [50]

1.2.2 Hoạt tính sinh học của curcumin

Nhiều công trình nghiên cứu thử nghiệm ở các nước trên thế giới đã khẳng định từ lâu rằng hoạt chất curcumin có tác dụng ức chế tế bào ung thư vào loại mạnh Các khối u da, tuyến vú, khoang miệng, thực quản, dạ dày, ruột, đại tràng, phổi và gan đã bị dập tắt bởi curcumin [8, 10] Năm 2000 trong chương trình phát triển ứng dụng curcumin làm thuốc chống ung thư, Viện nghiên cứu Quốc gia Mỹ (NCI) đã thực hiện một số thống kê so sánh khả năng bị nhiễm bệnh ung thư và tử vong của các nhóm cộng đồng có trình độ phát triển xã hội tương đương ở Mỹ (không sử dụng curcumin) và Ấn Độ (có sử dụng curcumin)[5] Các kết quả thống

kê trên cho thấy việc sử dụng curcumin như là một loại thực phẩm chức năng hoặc

sử dụng hỗ trợ trong điều trị đã làm giảm rất nhiều tỷ lệ mắc phải vì các bệnh ung thư Đặc biệt, các nghiên cứu lâm sàng cũng chứng tỏ curcumin không chỉ là loại thuốc hoàn toàn không độc đối với tim, phổi và thận [30] mà còn ức chế sự phát triển của tế bào ung thư

Ngày nay với sự phát triển mạnh mẽ của các hợp chất thiên nhiên đặc biệt là các ngành sinh học phân tử, hoạt tính của curcumin đã được làm sáng tỏ bởi các nghiên cứu về cơ chế tác dụng của các hợp chất này đối với các enzym cũng như đối với các tác nhân miễn dịch và các tác nhân gây bệnh trong cơ thể sinh vật Khả năng chống oxi hóa của curcumin trong cơ thể sinh vật dựa vào tác dụng ức chế các enzym peroxy hóa lipit và các enzym thuộc nhóm HIF, hoạt động của các enzym này gây cản trở sự vận chuyển oxy huyết [8, 10] Ngoài ra curcumin còn có khả năng kích thích hoạt tính của enzym hemeoxygenaza điều khiển hoạt động trao đổi oxy của hồng cầu

Tuy nhiên, do cấu trúc nội tại của phân tử curcumin và do khả năng hòa tan kém trong nước, curcumin chỉ được hấp thụ một cách hạn chế vào cơ thể [5, 23] Hoạt lực phòng và trị bệnh của curcumin, vì vậy, không được phát huy một cách tối

đa nhất

Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy các dẫn xuất và những hỗn hợp chế phẩm của curcumin hoặc thể hiện hoạt tính cao hơn, đa dạng hơn hợp chất gốc (các dẫn xuất Hydrazinocurcumin là những hợp chất có tiềm năng trong phòng và điều trị các bệnh về tê liệt và thoái hóa hệ thần kinh: Parkinson, Alzeheimer, Huntington) [4] hoặc giúp tăng cường khả năng hấp thụ bộ khung cấu trúc curcumin vào cơ thể nhờ tính tan trong nước được cải thiện rõ rệt (một số dẫn xuất curcumin glucosid có

độ hòa tan trong nước cao hơn hợp chất gốc hàng trăm cho tới hàng chục triệu lần; chế phẩm hỗn hợp Curcumin-Piperin làm tăng độ hấp thụ curcumin lên hàng chục lần)[43]

Ở Việt Nam, ứng dụng khả năng phòng, trị bệnh của curcumin mới chỉ dừng

ở mức hoặc sử dụng trực tiếp hỗn hợp nói trên hoặc bổ sung nó vào một số loại thực phẩm chức năng với mục đích giúp tăng cường sức đề kháng của cơ thể, ngăn ngừa ung thư, đau dạ dày, chống lão hóa… Chỉ mới gần đây, khi nghiên cứu về một dạng

“Super Curcumin” (Một chế phẩm kết hợp Curcumin- Piperin) của các nhà khoa học Ấn Độ được biết tới, ứng dụng của curcumin tại Việt Nam được nâng lên ở mức ưu việt hơn với sản phẩm Linh Can Khang Đây là sự kết hợp hiệu quả giữa thành tựu khoa học thế giới và tinh hoa của thảo dược Việt Nam “Super Curcumin”

đã được kết hợp với các dược liệu quý khác (Cao Diệp Hạ Châu, rễ cây Hoàng Kỳ

và dược liệu Ngũ Vị Tử) để cho ra đời một sản phẩm hỗ trợ điều trị viêm gan toàn diện – một giải pháp mới hữu hiệu trong hỗ trợ điều trị viêm gan siêu vi B [43]

Bên cạnh đó, các dẫn xuất hydro hóa của curcumin (Hình 1.2) bao gồm dihydrocurcumin (DHC), hexahydrocurcumin (HHC), octahydrocurcumin (OHC)

và đặc biệt là THC đang thu hút rất nhiều sự chú ý của các nhà khoa học bởi những

hoạt tính sinh học mạnh hơn rất nhiều

O H

O O

OH

OMe MeO

O H

OH

OMe

O H

MeO

O

OH

OMe OH

O H

1.3 Dẫn xuất THC

THC là một trong những dẫn xuất hydro hóa của curcumin, được tạo thành khi

no hóa hai liên kết đôi trên mạch carbon trung tâm của curcumin bằng khí hydro ở điều kiện thích hợp với sự có mặt của chất xúc tác

1.3.1 Đặc tính lý hóa của THC

Công thức phân tử: C21H24O6

OH

2' 3'

4'

5' 6'

Khối lượng phân tử: 372 dvC

Danh pháp: 1,7-bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)heptane- 3,5-dione

Nhiệt độ nóng chảy: 98 – 99oC

Hình dạng: Tinh thể hình kim, màu trắng

Tính tan: Tan trong các dung môi hữu cơ phân cực như: axeton, metanol, etanol, etyl axetat…

Hình 1.3: Tetrahycrocurcumin ở dạng bột 1.3.2 Hoạt tính sinh học của THC

Biểu hiện in vivo của chất có hoạt tính sinh học phụ thuộc nhiều vào độ ổn định

của nó ở các giá trị pH sinh lý Độ ổn định của curcumin và THC ở các pH khác nhau

đã được nghiên cứu [33] Kết quả cho thấy THC rất ổn định trong môi trường đệm phosphate 0,1M tại các giá trị pH khác nhau Hơn nữa, THC còn ổn định hơn

curcumin trong môi trường đệm phosphate tại pH 7,2 ở 37oC (Hình 1.4) Những kết quả này, cùng với những nghiên cứu về tác dụng hóa lý của curcumin đối với cơ thể chuột, cho thấy rằng curcumin-glucuronoside, dihydrocurcumin-glucuronoside, THC-

glucuronoside và THC là các chất chuyển hóa chủ yếu của curcumin trong điều kiện in

ß-glucuronidase

UDP-glucuronosyl transferase ß-glucuronidase

UDP-glucuronosyl transferase ß-glucuronidase

THC được nhận dạng lần đầu tiên bởi Holder năm 1978 khi nghiên cứu sự trao đổi chất và sự bài tiết của curcumin trong cơ thể chuột [48] Từ đó, THC đã được chứng minh thể hiện hoạt tính phòng ngừa sinh lý và dược lý tương tự curcumin như chống oxi hóa, diệt gốc tự do, chống ung thư và ung thư di căn [19, 44] Một số nghiên cứu cũng đã chỉ ra rằng THC thể hiện nhiều các hoạt tính sinh học có lợi cho sức khỏe con người hơn curcumin (Hình 1.6) [51] Ngoài ra, trong chế độ ăn uống có sử dụng curcumin hoặc THC, lượng THC và các hợp chất của nó (như sulfates và glucuronides) được tìm thấy trong gan và huyết thanh lớn hơn so với curcumin Điều

đó chứng tỏ THC dễ dàng được hấp thụ qua đường tiêu hóa hơn [30] Curcumin cũng như dẫn xuất của nó, THC đã được chứng minh là có khả năng chống oxi hóa, kháng viêm, chống ung thư, chống bệnh tiểu đường , trong đó khả năng chống oxi hóa của THC được coi trọng nhất, đặc biệt trong lĩnh vực mỹ phẩm [13, 23]

Hình 1.6 Ảnh hưởng của THC đối với các bệnh liên quan đến con người [51] 1.3.2.1.Tác dụng chống ôxi hóa

Sự mất cân bằng oxi hóa (Oxidative stress) thường được gây ra bởi các gốc tự

do - sản phẩm của quá trình trao đổi chất của các tế bào bình thường Đó là các nhóm chất hoạt động có một electron chưa ghép đôi ở lớp ngoài cùng, dẫn đến sự biến đổi không rõ ràng của các chất béo, protein và axit nucleic, góp phần vào việc hình thành

một loạt bệnh khác nhau bao gồm lão hóa, tiểu đường, thoái hóa thần kinh, và ung thư [37-38] Cấu trúc của THC bao gồm hai nhóm phenolic hydroxy và một nhóm β-diketone rất đặc trưng cho phân tử chất chống oxi hóa (Hình 1.7) Năm 1996, Sugiyama và cộng sự đã phát hiện rằng THC sinh ra bốn sản phẩm oxi hóa của nhóm β-diketone sau khi phản ứng với các gốc peroxyl [44] Điều này gợi ý rằng cấu trúc β-diketone giữ vai trò quan trọng trong hoạt tính chống oxi hóa của THC

Hoạt tính chống oxi hóa của THC đã được nghiên cứu trong cả in vivo lẫn in

vitro Các nghiên cứu đều chỉ ra rằng, THC có khả năng chống oxi hóa cao hơn

curcumin và các dẫn xuất khác Trong nghiên cứu in vitro [31] đánh giá tác dụng

chống ôxi hóa tương đối của các curcuminoid và các dẫn xuất hydro hóa tương ứng của chúng đối với axit linoleic trong hệ ethanol/nước, cũng như đối với màng hồng cầu thỏ và gan chuột, kết quả cho thấy hoạt tính chống oxi hóa của các dẫn xuất hydro hóa đều cao hơn các curcuminoid ban đầu, trong đó THC thể hiện hoạt tính mạnh nhất trong tất cả các thí nghiệm (Hình 1.8) Các tác giả kết luận rằng THC có thể đóng vai

trò quan trọng trong cơ chế chống ôxi hóa của curcumin in vivo Tương tự, trong một

nghiên cứu sau đó, nhóm tác giả đã tiếp tục chứng minh đặc tính chống ôxi hóa mạnh hơn của THC và giải thích được cơ chế tác dụng [44] THC thể hiện khả năng ức chế mạnh hơn curcumin trong mô hình lipid peroxidation trên màng hồng cầu gây ra bởi

tert-butylhydroperoxide Tác giả cho rằng khung β-diketone của THC thể hiện hoạt

tính chống ôxi hóa qua việc phân cắt liên kết C-C ở cacbon methylene giữa hai nhóm carbonyl trung tâm

Hình 1.8 Hoạt tính chống oxi hóa của curcuminoid và tetrahydrocurcuminoid trong các mô hình phòng thí nghiệm (A) Mô hình màng hồng cầu thỏ; (B) Mô hình

vi lạp thể gan chuột; (C) Mô hình tự oxi hóa axit linoleic được xác định bằng

phương pháp TBA và (D) phương pháp thiocyanate

Venkatesan và cộng sự [48] đã chứng minh rằng THC có hoạt tính cao hơn curcumin trong việc ngăn chặn nhóm nitrit gây ra quá trình oxi hóa của haemoglobin thành methaemoglobin và làm giảm lượng hồng cầu Thời gian cần để oxi hóa 50% haemoglobin thành methaemoglobin (t1/2) đối với mẫu trắng là 7,5 ± 0,7 phút Với sự

có mặt của THC, giá trị thời gian t1/2 này tăng lên 54,6 ± 0,5 phút – cao nhất trong các mẫu so sánh ở cùng nồng độ 5 (µM), trong khi t1/2 của curcumin chỉ đạt 39,7± 0,4 phút – tương đương với t1/2 của chất chống oxi hóa chuẩn α-tocopherol Nhóm tác giả giải thích rằng chính sự no hóa mạch cacbon trung tâm làm cho độ tan của THC tăng lên dẫn đến tăng hoạt tính Bên cạnh đó, THC cũng thể hiện hiệu lực mạnh hơn trong việc bảo vệ chống lại Fe – NTA (Ferric nitrilotriacetate), một tác nhân gây tổn thương thận

ở chuột THC ức chế đáng kể sự hình thành của 2-thiobarbituric acid, nonenal-modified proteins và 8-hydroxy-29-deoxyguanosine trong thận; trong khi curcumin chỉ ức chế đc sự tạo thành của 4-hydroxy-2-nonenal-modified proteins [23]

4-hydroxy-2-Năm 2007, các nhà khoa học Thái Lan [36] đã nghiên cứu so sánh khả năng diệt gốc tự do DPPH (1,1’-diphenyl-2-picrylhydrazyl) của curcumin và các dẫn xuất

Kết quả cho thấy, THC thể hiện hoạt tính cao nhất với giá trị IC50 = 18,7 (µM) Hoạt tính này giảm dần theo thứ tự THC > HHC = OHC >Trolox >Curcumin > DMC >> BDMC (Bảng 1.1 và hình 1.9) Đáng chú ý, khả năng diệt gốc tự do DPPH của các dẫn xuất hydro hóa cao hơn cả chất chống oxi hóa chuẩn trolox (dẫn xuất tan trong nước của vitamin E), trong khi hoạt tính của curcumin lại thấp hơn Kết quả này tương

tự nghiên cứu trước đó của Venkatesan và Rao [47] Nghiên cứu cũng đã chỉ ra rằng, THC có khả năng ức chế mạnh nhất đối với AAPH (2,2 - azobis (2-amidinopropane) (dihydrochloride) - tác nhân gây ra quá trình peoxit hóa lipidtrong quá trình oxi hóa axit linoleic và gây ra sự tiêu giảm tế bào hồng cầu Hiệu lực của THC gấp hơn bốn lần so với trolox trong việc ức chế sự tạo thành hệ diene liên hợp Lý giải cho những điều này, họ cho rằng chính sự có mặt của nhóm metoxyphenyl và đặc biệt là sự hydro hóa hệ nối đôi liên hợp trong mạch cacbon trung tâm đã làm tăng hoạt tính của curcumin lên một cách đáng kể Giá trị hoạt tính chống oxi hóa của THC và OHC là 3,4 và 3,1 trong khi của curcumin là 2,7 [47]

Bảng 1.1 Giá trị IC 50 của curcumin và các dẫn xuất

Chất chống oxi hóa IC50 (µM)

Curcumin DMC BDMC THC HHC OHC Trolox

35,1 53,4

> 200 18,7 21,6 23,6 31.1

Hình 1.9 Khả năng ức chế của THC, curcumin và BDMC đối với gốc DPPH

Trong một số nghiên cứu in vivo, Naito cùng cộng sự quan sát thấy rằng, khi

thêm THC (5000 ppm) vào chế độ ăn hàng ngày chứa 1% choloesterol đã ức chế đáng

kể sự tạo thành sản phẩm peroxit hóa HEL (Nε-(hexanoyl)lysine) trong mô gan thỏ [28] Bên cạnh đó, trong thí nghiệm tổn thương thận ở chuột bằng cách cho ăn chloroquine – tác nhân làm tăng quá trình lipid peroxidation và làm giảm nồng độ enzym chống oxi hóa [27], việc cho uống THC (80 mg/kg cơ thể) đã ức chế đáng kể chloroquine [34] Chế độ ăn chứa THC cũng ngăn chặn rõ rệt sự tạo thành các gốc superoxide (O2-) và hepatic malondialdehyde (MDA) – các tác nhân làm tăng huyết áp trong mô hình thí nghiệm trên chuột gây ra bởi Nω-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) [29] Ngoài ra, THC đã được chứng minh là ức chế tác dụng của tyrosinase tham gia quá trình tổng hợp melanin [39]

1.3.2.2 Tác dụng kháng viêm

Curcumin và bốn dẫn xuất bán tổng hợp từ curcumin bao gồm natri curcuminat (NaC), THC, diacetyl curcumin (DAC) và triethyl curcumin (TEC) được đánh giá tác dụng chống viêm trong mô hình gây phù chân chuột bằng carrageenin và mô hình gây viêm u hạt bằng dầu hạt bông trên chuột cống, có so sánh đối chiếu với thuốc kháng viêm phenylbutazone (PB) [26] Kết quả cho thấy các dẫn xuất của curcumin có tác dụng giảm độ phù nề chân chuột mạnh hơn curcumin trong các mô hình viêm cấp và bán cấp ở liều lượng thấp (< 30 mg/kg), ngoại trừ DAC không thể hiện hoạt tính Hiệu lực kháng viêm giảm theo thứ tự NaC >THC >C >PB >TEC Hiệu lực này thay đổi đáng kể khi dùng ở nồng độ cao Khả năng ức chế lớn nhất của hoạt tính kháng viêm

đạt được khi dùng THC là 56,6% ở liều lượng 30 mg/kg, giá trị này khi dùng curcumin

là 67%, nhưng ở liều lượng gấp đôi (60 mg/kg) Tuy nhiên, trong mô hình gây viêm u hạt bằng dầu hạt bông trên chuột cống, THC không thể hiện hoạt tính kháng viêm dù dùng ở liều cao 60 mg/kg, trong khi curcumin có khả năng ức chế 25% ở liều lượng 10 mg/kg [26]

Thêm vào đó, chế độ ăn chứa THC thể hiện hoạt tính kháng viêm cao hơn đáng

kể so với curcumin trong việc làm giảm nồng độ của Inos (inducible nitricoxide synthase) và COX-2(cycoloxygenase-2), hai enzym gây viêm ruột kết chuột [40]

1.3.2.3 Hoạt tính chống ung thư

Việc mất cân bằng oxi hóa có thể là cơ chế cho sự khơi mào của các bệnh ở người THC đã được chứng minh có hoạt tính chống oxi hóa mạnh trong các nghiên

cứu in vivo và in vitro, do đó nó có khả năng ngăn ngừa một số bệnh liên quan đến oxi

hóa Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng THC có hoạt tính chống ung thư, hiệu quả trong việc làm giảm ung thư trực tràng, xúc tiến sự tan vỡ của các tế bào bệnh bạch cầu, ức chế sự di căn của các khối u bướu ác tính [15, 19] So với curcumin, hoạt tính của

THC tuy kém hơn trong việc ức chế TPA (12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate) - tác

nhân thúc đẩy sự phát triển của các khối u ở da chuột, nhưng lại mạnh hơn trong việc

ức chế 1,2-dimethylhydrazine gây ung thư ruột kết ở chuột bằng cách hạn chế sự phân chia tế bào [15] Thêm vào đó, THC có khả năng tiêu diệt tế bào lập trình tuýp II nằm trong khối tế bào bệnh bạch cầu HL-60 ở người, trong khi curcumin không có tác dụng này [52] Nhiều nghiên cứu gần đây cũng chứng minh rằng, THC có thể tiêu diệt nhiều loại tế bào lập trình khác ở những điều kiện khác nhau [37]

Kundu và Surh đã chỉ ra sự viêm nhiễm có liên quan đến bệnh ung thư và đóng vai trò như lực phát động trong quá trình biến đổi tiền ác tính và ác tính [17] Do đó, với hoạt tính kháng viêm mạnh đối với hai enzym iNOS và COX-2, THC hiệu quả trong việc ức chế tác nhân AOM (azoxymethane) gây bệnh ung thư ruột kết ở chuột [19] Bên cạnh đó, THC cũng được chứng minh hiệu quả hơn curcumin trong việc làm giảm sự tạo thành ACF (aberrant crypt foci) và polyp ruột cũng như giảm đường truyền dẫn tín hiệu Wnt-1/β-catenin gây ra sự nhân lên của ung thư trực tràng [19]

Nghiên cứu của Ohtsu chỉ ra rằng, THC là một trong số các dẫn xuất của curcuminđược đánh giá là chất đối kháng thụ thể androgen tiềm năng đối với hai dòng

tế bào ung thư tuyến tiền liệt PC-3 và DU-145 ở người [11] Các tác giả cũng đã nghiên cứu mối liên hệ giữa cấu trúc - hoạt tính và chỉ ra rằng, khung bis (3,4-dimethoxyphenyl), hệ β-diketone liên hợp và tính đối xứng nội phân tử là những yếu

tố quan trọng liên quan đến hoạt tính kháng androgen Trong một nghiên cứu khác [54], THC thể hiện khả năng chống hình thành mạch máu mà không cần bất kỳ hoạt động gây độc tế bào nào đối với dòng tế bào ung thư biểu bì thuộc tế bào gan HepG2 ở người ngay cả ở liều cao nhất Hiệu lực này của THC thậm chí còn cao hơn curcumin

do hoạt tính chống oxi hóa mạnh hơn Do đó, THC có thể là một tác nhân đầy triển vọng cho việc chống hình thành mạch khối u trong tương lai

1.3.2.4 Các hoạt tính khác

Năm 2007, Kitani cùng cộng sự đã chứng minh rằng THC có khả năng kéo dài tuổi thọ của động vật [16] Nghiên cứu chỉ ra rằng việc áp dụng chế độ ăn chứa 0,2% THC đã làm tăng tuổi thọ của chuột lên 11,7% Tuy nhiên, cơ chế tác dụng vẫn chưa được rõ ràng Sau đó, Xiang cho rằng quá trình truyền tín hiệu bởi Sirt2/FOXO có thể

là một cơ chế then chốt trong tác dụng trên Giả thuyết này được hỗ trợ bởi khả năng

kéo dài tuổi thọ của ruồi giấm Drosophila sp [53] Cũng trong năm đó, Murugan và

Pari đã nghiên cứu ảnh hưởng của THC lên đường huyết, huyết tương insulin, và thành phần các axit béo của lipid tổng số trong gan, thận và não của chuột bị bệnh tiểu đường tuýp II gây ra bởi streptozotocin (STZ)-nicotinamide [23].Kết quả cho thấy, THC không những hiệu quả trong việc chữa tiểu đường và giảm mỡ máu, mà còn ngăn chặn sự biến đổi của các axit béo được tạo thành trong quá trình bị bệnh tiểu đường Hơn nữa, hiệu lực tác dụng của THC trong các thí nghiệm này thậm chí còn cao hơn curcumin khi dùng cùng liều lượng

THC cũng thể hiện rất tốt hoạt tính kháng khuẩn (đối với các khuẩn B.subtilis,

E.coli, S.auresus, Enterobacter aerogenes, P,mirabilis, K.pneumonia và Pseudomonas aeruginosa) và kháng nấm (A.niger và C.albican), cao hơn so với các dẫn xuất hydro

hóa khác của curcumin như HHC và OHC [41] Bên cạnh đó, THC được chứng minh

có hoạt tính kháng virut cúm A, nhưng kém hơn curcumin [32]

Gần đây, Sangartit và cộng sự chỉ ra rằng THC có khả năng cải thiện chứng tăng huyết áp gây ra bởi cadmium (Cd), giảm xơ vữa động mạch và tổ chức lại thành

mạch máu ở chuột thông qua việc nâng cao sinh khả dụng NO, làm suy giảm sự mất cân bằng oxi hóa và giảm sự tích lũy Cd ở các mô khác [38] Ngoài ra, THC còn thể hiện những tác dụng có lợi đối với các bệnh về thoái hóa thần kinh như Parkinson và Alzheimer [7] Giá trị IC50 của THC đối với tác nhân acetylcholinesterase gây ức chế hoạt động của chất truyền dẫn thần kinh acetylcholine cao gấp đôi so với curcumin [7]

1.3.3 Ứng dụng của THC

Các phản ứng dây chuyền gốc tự do thường xảy ra trong hầu hết các phản ứng thoái hóa sinh học Các gốc tự do trên bề mặt da được tạo do tia tử ngoại, hóa chất và các yếu tố stress, môi trường làm lão hóa da THC loại bỏ các gốc tự do và do vậy chống lại quá trình lão hóa [24] Thêm vào đó nó còn chống lại quá trình nhân lên của các gốc tự do THC cũng có tác dụng làm tăng tuổi thọ của các công thức dùng ngoài

sử dụng chất béo bằng việc ức chế quá trình ôxi hóa chất béo Với tác dụng chống viêm tốt kết hợp với chống ôxi hóa mạnh, THC trở nên hữu ích khi được sử dụng làm thành phần của các chế phẩm chống lão hóa và dùng ngoài nhằm duy trì sức khỏe và

sự mịn màng của da Tác dụng chống ôxi hóa của THC còn có thể làm chậm quá trình tạo sắc tố da và qua đó làm trắng da Cùng với tính chất không màu, THC rất hữu ích khi ứng dụng trong ngành công nghiệp y-dược phẩm, thực phẩm và mỹ phẩm để thay thế các chất chống oxi hóa tổng hợp hiện đang được sử dụng [36] Trong thực phẩm, THC được dùng làm chất chống oxi hóa Y học dùng THC trong việc hỗ trợ điều trị các bệnh tiểu đường, ung thư gan… Trong mỹ phẩm, với tác dụng làm trắng da và chống tia cực tím, THC có trong thành phần của kem dưỡng trắng da và kem chống nắng [18]

1.3.4 Các phương pháp bán tổng hợp THC

Thông thường, THC được điều chế thông qua phản ứng hydro hóa curcumin với sự có mặt của chất xúc tác Việc sử dụng các kim loại quý như Pt làm xúc tác chọn lọc cho phản ứng này đã được nghiên cứu từ lâu [13, 31, 33], tuy nhiên, hiệu suất phản ứng chưa cao Ví dụ, năm 1995 Huang và cộng sự [13] đã tiến hành hydro hóa curcumin trong hệ dung môi etyl axetat/axit axetic ở 50oC và 3,3 at trên xúc tác PtO2 Sau phản ứng, cất loại dung môi thu được cặn gôm màu vàng Hòa tan cặn trong iso propanol nóng và để kết tinh qua đêm ở 2 – 4oC Lọc, rửa chất rắn tạo thành, tinh chế bằng sắc ký cột silica gel thu được tinh thể THC màu trắng, tonc 98 – 99oC với hiệu suất ~ 30% Cùng thời gian đó, Osawa thực hiện phản ứng trong dung môi methanol ở

áp suất khí quyển hydro tại nhiệt độ phòng Sau phản ứng, THC được tinh chế bằng TLC điều chế cho hiệu suất 42,5% [31] Cũng với xúc tác PtO2,Adams và Voorhees

tiến hành phản ứng trong dung môi etanol hoặc axit axetic ở áp suất 2,0 kg/cm3, thời gian phản ứng 45 phút, thu được hỗn hợp sản phẩm với tỉ lệ THC :HHC :OHC = 2 :1:1

So với PtO2, xúc tác Pd trên chất mang cho hiệu suất THC cao hơn [11, 22, 41,

42, 45, 49] Ví dụ, khi tiến hành phản ứng hydro hóa curcumin ở 1 atm H2 tại nhiệt độ phòng trong dung môi MeOH, dùng 10% Pd/C làm xúc tác, THC được thu nhận với hiệu suất 71,6% [22] Trong khi đó, 5% Pd/BaSO4 xúc tác cho hiệu suất THC lên đến 78% ở áp suất 20 psi H2 trong dung môi acetone [42] Ngoài ra, theo nghiên cứu của Tangyuenyongwatana, sản phẩm của quá trình hydro hóa Curcumin trên xúc tác Pd/C gồm 65% THC và 30% HHC [45] Gần đây, Wagner đã thực hiện phản ứng hydro hóa curcumin theo hai phương pháp: dùng thiết bị phản ứng hydro hóa dòng liên tục (H-cube) và khử hóa trên xúc tác Pd/C dùng cyclohexene như là nguồn “cho” hydro Sau khi tinh chế thu được THC với hiệu suất ~ 60% [49]

Bên cạnh các kim loại quý, kim loại chuyển tiếp nhóm d cũng đã được sử dụng

làm xúc tác cho quá trình tổng hợp THC từ curcumin Akio Minura và cộng sự [6] đã tiến hành phản ứng trong khí quyển hydro, dung môi axeton ở 30oC, sử dụng 50% xúc tác Niken-Raney Sau 2h phản ứng, hỗn hợp sản phẩm được tinh chế bằng sắc ký cột Hiệu suất thu nhận THC 67%

Ngoài ra, Byeoung-Soo Park và cộng sự [35] lại tiến hành chiết và phân lập THC và các curcuminoid khác từ củ nghệ khô bằng phương pháp sắc ký cột silica gel

Từ 5kg bột nghệ khô thu được 38mg THC, 380mg Curcumin, 79mg DMC và 71mg BDMC Bên cạnh đó, THC còn được điều chế thông qua chuyển hóa của curcumin

dưới tác dụng của vi sinh vật [55] Các tác giả sử dụng chủng nấm men Pichia

kudriavzevii ZJPH0802 được phân lập từ đất làm xúc tác sinh học cho quá trình

chuyển hóa này ở 30oC trong 24h Sản phẩm sau khi tinh chế thu được THC (64,05%)

và HHC (12,58%)

Ở nước ta, theo tài liệu thu thập được thì chưa có công trình nghiên cứu nào công bố quy trình tổng hợp cũng như thử hoạt tính của THC Gần đây mới chỉ có nghiên cứu của Trần Khắc Vũ và cộng sự tiến hành khử hóa curcumin thành THC sử dụng xúc tác Zn-NiCl2 kết hợp sóng siêu âm, đăng trên tạp chí Khoa học và Công nghệ [1] Tuy nhiên, kết quả mới chỉ dừng ở nghiên cứu thăm dò quy mô phòng thí nghiệm, hiệu suất không cao, chưa thể ứng dụng trong sản xuất

Trung tâm Hóa thực vật – Viện Hóa học công nghiệp Việt Nam là nơi sản xuất curcuminoid với quy mô gần 2.000kg nguyên liệu/ mẻ Với sự chủ động về nguyên

liệu curcuminoid và theo một yêu cầu của đối tác, năm 2013 Trung tâm đã tiến hành nghiên cứu đề tài cấp bộ của Bộ Công Thương “Nghiên cứu công nghệ bán tổng hợp tetrahydrocurcumin (curcumin trắng) ứng dụng trong mỹ phẩm và công nghệ thực phẩm” Kết quả cho thấy tại áp suất 4 bar và 70oC trong thời gian 3h, sử dụng xúc tác Ni-Raney, hiệu suất chuyển hóa đạt 64,39% [2]

1.3.5 Tình hình xuất - nhập khẩu THC

Theo thống kê của Công ty Dịch vụ Dữ liệu và Công nghệ Zauba (Ấn Độ) về tình hình xuất - nhập khẩu THC trên thế giới trong 3 năm qua (từ tháng 5/2013 đến tháng 4/2016, Hình 1.10) [12], Ấn Độ là nước cung cấp chính THC với lượng xuất khẩu 26,765 tấn, thu về gần 1.3 triệu USD; Các Tiểu vương quốc Ả Rập Thống nhất đứng đầu trong nhóm các nước nhập khẩu THC (gần 3 tấn), sau đó đến Mỹ (1,2 tấn)

và Phillipin (0,6 tấn) Đáng chú ý, Việt Nam đứng thứ tư trong nhóm đó với 0,27 tấn THC nhập khẩu dưới dạng kem bôi trị sạm da, nám da và làm tăng sắc tố do viêm da

Hình 1.10 Tình hình nhập khẩu THC của một số nước trên thế giới trong 3 năm

qua (2013-2016)

CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu

Bột curcuminoid thô được trung tâm hóa thực vật, Viện hóa học công nghiệp Việt Nam chiết suất từ củ nghệ vàng hàm lượng lên đến 95%

2.1.2 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu

2.1.2.1 Hóa chất nghiên cứu

Bảng 2.1 Danh mục các hóa chất đã sử dụng trong nghiên cứu

ST

2.1.2.2 Thiết bị nghiên cứu

Đề tài sử dụng một số thiết bị phục vụ thí nghiệm chính sau:

- Bản mỏng Silicagel 60, TLC (Merck, CHLB Đức)

- Thiết bị sắc ký lỏng cao áp HPLC (Alliance 2695 – Water – Mỹ)

- Thiết bị phản ứng cao áp Parr Inst (Mỹ)

- Thiết bị đo điểm chảy Gallenkamp capillary

- Thiết bị Xevo – TMQS (Water, Mỹ)

- Thiết bị NMR Brucker AVAN 500 MHz

- Ngoài ra nghiên cứu còn sử dụng một số thiết bị và dụng cụ phòng thí nghiệm như: Cân điện tử 2 số (Trung Quốc), Ống đong 25mL, 50mL, 100mL, 1000ml (Trung Quốc), Pipet chia vạch 1mL, 5mL, 10mL (Trung Quốc), …

Hình 2: Thiết bị phản ứng cao áp Parr Inst.

Hình 2.1: Thiết bị phản ứng cao áp Parr Inst (Mỹ)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của các thông số công nghệ tinh chế curcuminoid từ hàm lượng 95% lên 98%

2.2.1.1 Thiết kế thí nghiệm: Quy trình tinh chế curcuminoid từ hàm lượng 95% lên 98%

Curcuminoid 95%

Kết tinh lần lại

Hình 1 Thiết kế nghiên cứu

Nước ót

Hình 2.2: Quy trình tinh chế curcuminoid hàm lượng từ 95% lên 98%

Thuyết minh quy trình: Curcuminoid hàm lượng 95% được kết tinh lại trong

các hệ dung môi khác nhau Quá trình kết tinh được thực hiện bằng cách hòa tan hoàn toàn 50g curcuminoid 95% trong lượng tối thiểu dung môi hữu cơ (methanol, ethanol, acetone, ethyl acetate) tại nhiệt độ sôi, có khuấy trộn, bổ sung nước cất hoặc n-hexane đến các tỉ lệ thích hợp Quá trình kết tinh được thực hiện tại 5o

C, trong 4h Sản phẩm sau kết tinh được lọc hút, sấy đến khối lượng không đổi tại 80oC Các thí nghiệm được tiến hành với 2 mẫu song song Hỗn hợp sản phẩm được phân tích sơ bộ trên TLC, hàm lượng curcumin được xác định bằng phương pháp HPLC Quá trình nghiên cứu được thực hiện dựa trên thiết kế nghiên cứu mô tả trong hình 2.2

2.2.1.2 Ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất phản ứng

Ảnh hưởng của hệ dung môi đến hiệu suất phản ứng được thực hiện trên ba hệ dung môi bao gồm: methanol: nước (tỉ lệ 50:50 ÷ 90:10), axeton: nước (tỉ lệ 50:50 ÷ 90:10); ethyl axetate:n-hexane (40:60 ÷ 80:20) Mỗi thí nghiệm được tiến hành tối thiểu 2 mẫu song song

2.2.1.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ kết tinh đến hiệu suất phản ứng

Ảnh hưởng của nhiệt độ kết tinh được thực hiện trong khoảng 0-20o

C Quá trình kết tinh được thực hiện như mô tả ở phần 2.2.1.2, sử dụng dung môi methanol 80%.Mỗi thí nghiệm được tiến hành tối thiểu 2 mẫu song song

2.2.1.4 Ảnh hưởng của thời gian kết tinh đến hiệu suất phản ứng

Ảnh hưởng của thời gian kết tinh được thực hiện trong khoảng 1-5h Quá trình kết tinh được thực hiện như mô tả ở phần 2.2.1.2, sử dụng dung môi methanol 80% Mỗi thí nghiệm được tiến hành tối thiểu 2 mẫu song song

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của các thông số công nghệ đến quy trình bán tổng hợp THC (hàm lượng  90%)

2.2.2.1 Thiết kế thí nghiệm: Quy trình bán tổng hợp THC (hàm lượng 

90%)

Thuyết minh quy trình: Các thí nghiệm được tiến hành trong thiết bị phản ứng

cao áp Parr Inst (Mỹ), khí N2 và H2 được cung cấp từ bình cấp khí dạng hóa lỏng dung tích 40 L Xúc tác, curcuminoid (98%) được nạp vào bình phản ứng cùng với dung môi phản ứng theo tỉ lệ xác định cho mỗi quy trình Thiết bị được đậy kín, khí N2được nạp vào khoảng không gian hở trong bình phản ứng cao áp để loại bỏ O2 Quá

trình này được thực hiện trong vòng 5 phút, áp suất khí 2 atm Đóng van N2, mở van cấp H2, thay thế khí N2 băng khí H2 trong thiết bị phản ứng, thực hiện trong 5 phút Đóng các van và nâng nhiệt độ tới giá trị xác định, điều chỉnh van cấp H2 để duy trì ổn định áp suất, phản ứng được theo dõi định kỳ 30 phút bằng TLC, sau khi phản ứng kết thúc, xả áp, hỗn hợp phản ứng được làm mát, tháo ra, xúc tác được lọc, tách, tái hoạt hóa để sử dụng lại Dịch lọc được cất loại dung môi, tinh chế bằng sắc ký cột hoặc kết tinh lại

Curcuminoid 98%

Hydro hóa

Kết tinh thô Thông số phản ứng ?

Tảy màu

THC: ≥ 90%

Lọc, thu hồi xúc tác

H-, 13 C-NMR

Dung môi kết tinh?

Lượng than hoạt tính?

Xúc tác

Hình 1 Thiết kế nghiên cứu

Hình 2.3 Xây dựng quy trình bán tổng hợp THC (hàm lượng  90%)

Để tạo THC cần phải tiến hành phản ứng hydro hóa curcumin (phản ứng khử) với sự có mặt của xúc tác Phản ứng dùng để khử hay bão hòa các chất hữu cơ, thường

là anken Phản ứng hydro hóa không sử dụng xúc tác chỉ xảy ra ở nhiệt độ rất cao (

>480oC) Hydro gắn vào các nối đôi và nối ba trong các hydrocacbon Như vậy, phản ứng khử gồm 3 thành phần tham gia: chất chưa no, hydro và xúc tác Phản ứng được thực hiện ở các nhiệt độ và áp suất khác nhau phụ thuộc vào chất tham gia phản ứng

và hoạt tính của xúc tác Phản ứng có tính chọn lọc đối với các nối đôi ngoài vòng thơm

2.2.2.2 Nghiên cứu lựa chọn xúc tác phản ứng phù hợp cho quy trình bán tổng hợp THC

Thông qua các tài liệu tham khảo, chúng tôi lựa chọn 4 loại xúc tác PtO2, Raney-Nickel, Pd/C, Zn-NiCl2 cho qua trình bán tổng hợp THC Đây là những loại xúc tác cơ bản, có sẵn trên thị trường và tương đối rẻ tiền

Các phản ứng được thực hiện trong thiết bị phản ứng cao áp, 50 g nguyên liệu curcumin, trong 1000 ml dung môi phản ứng (trừ xúc tác Zn-NiCl2)

+ Đối với xúc tác PtO2, phản ứng được thực hiện tai 3,4 bar, trong hệ dung môi ethyl acetate/acetic acid ở 50oC, lượng xúc tác sử dụng 7%

+ Đối với xúc tác Pd/C, phản ứng được tiến hành trong điều kiện 5% Pd/C, dung môi MeOH, 2,7 bar trong thời gian 3h

+ Đối với xúc tác Raney-Nickel, các phản ứng được tiến hành tại 4 bar, 700C trong 3h tại tỉ lệ xúc tác/nguyên liệu 2/10

+ Đối với xúc tác Zn-NiCl2, phản ứng được tiến hành trong 3 h, tỉ lệ Zn/NiCl2/curcumin: 1:6:1,5 trong 250 ml dung môi ethanol 80% trong bình 500 ml với

sự hỗ trợ của sóng siêu âm

Hỗn hợp sau phản ứng được lọc, cất loại dung môi, sản phẩm được tinh chế bằng cột sắc ký silica gel cỡ hạt 230-400 mesh (4 cm × 30 cm), sử dụng hệ dung môi n-hexan/ethyl acetate (40:60) Phân đoạn chứa THC được gom chung và cất loại dung môi Sản phẩm thu được là dạng THC tinh khiết.Mỗi thí nghiệm được tiến hành tối thiểu 2 mẫu song song

2.2.2.3 Khảo sát lựa chọn dung môi tối ưu cho phản ứng

Trong phản ứng hydro hóa, dung môi sử dụng được lựa chọn dựa trên khả năng hòa tan curcumin, dựa trên tiêu chí này, chúng tôi tiến hành khảo sát với dung môi methanol, ethanol, acetone và ethyl acetate Phản ứng được thực hiện tại 4 bar, 70oC, 3

h, trong 500 ml dung môi, dung môi phản ứng được lựa chọn dựa trên phân tích TLC sau 3h tiến hành phản ứng Quá trình tinh chế và thu nhận sản phẩm được tiến hành như mô tả trong mục 2.2.2.1.Mỗi thí nghiệm được tiến hành tối thiểu 2 mẫu song song

2.2.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của áp suất đến hiệu suất phản ứng

Các thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của áp suất phản ứng đến hiệu suất tổng hợp THC được tiến hành tại áp suất 1-7 bar tại 70oC trong 3h, tỉ lệ xúc tác/nguyên liệu

sử dụng là 2/10 Phản ứng được tiến hành trong 1L dung môi acetone Quá trình phản ứng và tinh chế sản phẩm được thực hiện như mô tả trong phần 2.2.2.1 Mỗi thí nghiệm được tiến hành tối thiểu 2 mẫu song song

2.2.2.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất phản ứng

Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất phản ứng được theo dõi dựa trên TLC Phản ứng được tiến hành tại 2,5 bar, 70oC, tỉ lệ xúc tác/nguyên liệu: 2/10 Dịch phản ứng được lấy ra sau mỗi 30 phút để phân tích Mỗi thí nghiệm được tiến hành tối thiểu

2 mẫu song song

2.2.2.6 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng đến hiệu suất thu nhận THC

Phản ứng được khảo sát trong khoảng nhiệt độ 30 – 90oC, tại 3,5 bar và 2,5h Quá trình phản ứng được theo dõi bằng TLC sau mỗi 30 phút Sau khi kết thúc, dung dịch chứa sản phẩm được lọc bỏ xúc tác, cất loại dung môi dưới áp suất giảm và tinh chế như đã mô tả Hiệu suất của quá trình được tính dựa trên lượng sản phẩm tinh khiết thu được so với nguyên liệu đầu vào Mỗi thí nghiệm được tiến hành tối thiểu 2 mẫu song song

2.2.2.7 Nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ xúc tác/nguyên liệu đến hiệu suất thu nhận THC

Để tối ưu hóa hàm lượng xúc tác sử dụng, đạt hiệu suất cực đại tại tỉ lệ xúc tác nhỏ nhất, giảm chi phí quá trình tổng hợp THC, phản ứng được tiến hành khảo sát trong khoảng xúc tác/nguyên liệu 1/10 – 5/10 Các thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của áp suất phản ứng đến hiệu suất tổng hợp THC được tiến hành tại áp suất 3,5 bar tại

70oC trong 2,5h Thí nghiệm được theo dõi trên TLC sau mỗi 30 phút Quá trình thu nhận và tinh chế THC được thực hiện như mô tả ở mục 2.2.2.1.Mỗi thí nghiệm được

tiến hành tối thiểu 2 mẫu song song

2.2.2.8 Nghiên cứu phương pháp thu hồi và tái sử dụng xúc tác

Xúc tác sau phản ứng được thu hồi, rửa sạch bằng dung môi acetone 3 để làm sạch bề mặt với sự trợ giúp của sóng siêu âm Phần xúc tác này được tái sử dụng cho các phản ứng tiếp theo Các thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của xúc tác tái sử dụng đến hiệu suất thu nhận THC được tiến hành tại áp suất 3,5 bar, 70o

C trong 2,5h, tỉ lệ xúc tác/nguyên liệu 3/10 trong 1L dung môi acetone chứa 50 g curcumin Thí nghiệm

được theo dõi trên TLC sau mỗi 30 phút Quá trình thu nhận và tinh chế THC được

thực hiện như mô tả ở trên Mỗi thí nghiệm được tiến hành tối thiểu 2 mẫu song song

2.2.2.9 Nghiên cứu các điều kiện kết tinh THC thô

Hỗn hợp thu được sau khi hydro hóa curcumin được loại bỏ xúc tác, cô cất tại

áp suất giảm để loại hoàn toàn dung môi acetone Cặn cô quay được hòa tan trở lại trong dung môi hoặc hệ dung môi kết tinh tại nhiệt độ sôi, có sinh hàn hồi lưu trong 10 phút tại các tỉ lệ chất tan/dung môi: 1/5 – 1/30 Hỗn hợp được giảm nhiệt độ về nhiệt

độ phòng Quá trình kết tinh được thực hiện tại 5o

C trong vòng 18-20h Sau kết tinh, tinh thể được lọc hút, rửa lại bằng 50 ml dung môi kết tinh (ở 5oC) 1 lần, sau đó sấy khô Hiệu suất của quá trình kết tinh được dựa trên lượng sản phẩm thô thu được

2.2.3 Quy trình tinh chế THC đạt hàm lượng  98%

Để nâng cao hàm lượng THC, quá trình tảy màu sử dụng than hoạt tính được áp dụng Tổng số 50g THC thô được hòa tan hoàn toàn trong 300 ml ethanol Than hoạt tính được bổ sung vào dung dịch với tỉ lệ: 0,5-5% (w/w) Hỗn hợp được đun sôi hồi lưu trong 5 phút Phần dung dịch lọc được cất loại dung môi Hiệu suất thu hồi và màu sắc sản phẩm được sử dụng để đánh giá hiệu quả của quá trình

2.2.4 Phương pháp phân tích

2.2.4.1 Phương pháp đo điểm chảy

Nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm được đo trên máy Gallenkamp capillary

2.2.4.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng:

 TLC: Bản mỏng Silica gel 60 F254 (Merck, CHLB Đức)

Nguyên tắc: Dựa trên sự tương tác khác nhau giữa các thành phần trong hỗn hợp với dung môi và pha tĩnh, do độ phân cực khác nhau

Hệ dung môi triển khai: dichlomethane/methanol: 95/5 (bước sóng 254 và 365 nm)

và n-hexan: etyl axetat = 2:3 (v/v) (bước sóng sử dụng để quan sát ảnh hưởng của một

số yếu tố đến hiệu suất phản ứng và xác định độ tinh khiết của sản phẩm

2.2.4.3 Các phương pháp phân tích phổ

- HPLC: cột RP-C18, hạt nhồi 3,5 µm, đường kính 4,6mm, chiều dài 150mm Pha động MeOH/H2O: 86/14 (v/v) Thời gian chạy mẫu 30 phút/mẫu sử dụng detector PDA ở bước sóng 265nm trên thiết bị HPLC (Waters-Mỹ)

- Phổ MS đo trên máy Xevo-TQMS, hãng Waters-mỹ, nguồn ion hoá ESI, nhiệt độ khí nebunizer 325oC, áp suất khí 500lit/h, điện áp ion hoá 4,2Kv

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H, 13C-NMR) của sản phẩm được đo trên máy NMR Brucker AVAN 500 MHz Độ dịch chuyển hóa học được tính bằng ppm so với chất nội chuẩn tetramethylsilane (TSM)

Các phương pháp phổ được thực hiện tại Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

và phòng phân tích kiểm nghiệm của Viện nghiên cứu ứng dụng các hợp chất thiên nhiên

2.2.5 Phương pháp tính hiệu suất thu hồi sản phẩm

Hiệu suất thu hồi sản phẩm (H) được tính theo công thức:

Trong đó:

m1: Sản phẩm thu được ở lần kết tinh thứ nhất (g)

m2: Sản phẩm thu được ở lần kết tinh thứ hai (g)

50: Lượng nguyên liệu đầu vào (g)

H1, H2, Ht: Hiệu suất kết tinh lần 1, 2 và hiệu suất kết tinh tổng (%)

H1tb: Hiệu suất kết tinh trung bình lần 1