Thử nghiệm một số hợp chất chiết xuất từ thảo dược

Thử nghiệm một số hợp chất chiết xuất từ thảo dược

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINHBỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC* * * * * * *KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆPTHỬ NGHIỆM MỘT SỐ HỢP CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ THẢO DƯỢC TRONG PHÒNG TRỊ BỆNH ĐỐM TRẮNG DO VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon)Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌCNiên khóa: 2001 – 2005Sinh viên thực hiện: NGUYỄN ĐỨC THÀNHThành phố Hồ Chí MinhTháng 8/2005 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINHBỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC* * * * *THỬ NGHIỆM MỘT SỐ HỢP CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ THẢO DƯỢC TRONG PHÒNG TRỊ BỆNH ĐỐM TRẮNG DO VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon)Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:TS. Lý Thị Thanh Loan Nguyễn Đức ThànhThành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2005 LỜI CẢM TẠTrong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp, tôi đã gặp những khó khăn nhất định nhưng nhờ sự hướng dẫn và giúp đỡ của mọi người khóa luận đã được hoàn thành. Tôi xin chân thành cảm tạ: Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt quá trình học tập tại trường. TS Lý Thị Thanh Loan, ThS Nguyễn Hoàng Phượng Uyên đã hết lòng hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình thực tập tốt nghiệp. Các anh chị tại Trung tâm Quốc gia Quan trắc Cảnh báo Môi trường thuộc Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản 2 và các anh chị tại Trại Thực nghiệm Thủy sản Thủ Đức đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp. Ban Giám đốc và các anh chị công ty Nam Khoa. Các bạn bè thân yêu của lớp Công nghệ Sinh học 27 đã chia sẻ vui buồn trong quá trình học tập và giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập.iii TÓM TẮTNGUYỄN ĐỨC THÀNH, Đại học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh. Tháng 8/2005. “THỬ NGHIỆM MỘT SỐ HỢP CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ THẢO DƯỢC TRONG PHÒNG TRỊ BỆNH ĐỐM TRẮNG DO VIRUS GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon)”.Thời gian thực hiện từ tháng 03/2005 – 08/2005. Địa điểm: Trung tâm Quốc gia Quan trắc, Cảnh báo Môi trường và Phòng ngừa Dịch bệnh Thủy sản khu vực Nam Bộ, Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 2 (RIA 2).Đề tài được thực hiện trên đối tượng là virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) gây bệnh trên tôm sú (Penaeus monodon). Thí nghiệm được bố trí bằng cách trộn chung dịch chiết virus WSSV với các hợp chất chiết xuất từ thảo dược ở các nồng độ khác nhau, sau đó kiểm tra tác dụng của các hợp chất đối với virus WSSV. Sau khi sàng lọc, tiến hành thử nghiệm hiệu quả tác dụng của các hợp chất này lên virus WSSV bằng cách tiêm hỗn hợp dịch virus WSSV và hợp chất vào cơ thể tôm thí nghiệm. Đánh giá tác dụng của các hợp chất dựa vào kết quả Reatime PCR và tỷ lệ sống của tôm thí nghiệm.Kết quả đạt được sau khi thí nghiệm với các hợp chất ký hiệu D2, B, M:Ở các nồng độ thử nghiệm là 2,5 (mg/ml), 5 (mg/ml), 7,5 (mg/ml), 10 (mg/ml):Hợp chất M chưa đủ liều lượng để có thể tác dụng lên lớp vỏ protein của virus hoặc không có hiệu quả tác dụng đối với virus.Hợp chất B và D2 có tác dụng lên virus WSSV ở những nồng độ 2,5 (mg/ml), 5 (mg/ml), 7,5 (mg/ml), 10 (mg/ml).iv MỤC LỤCCHƯƠNG TRANGTrang tựaLời cảm tạ iiiTóm tắt viMục lục .vDanh sách các hình viiiDanh sách các bảng và sơ đồ .ixPHẤN 1 MỞ ĐẦU .11.1 Đặt vấn đề .11.2 Mục đích, yêu cầu .2PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .32.1 Tình hình dịch bệnh tôm trên thế giới 32.2 Tình hình nuôi và dịch bệnh tôm ở Việt Nam 42.3 Đặc điểm hệ thống miễn dịch của tôm sú 62.4 Khái quát về bệnh đốm trắng và virus gây hội chứng đốm trắng trên tôm sú .72.4.1 Tác nhân gây bệnh 72.4.2 Khu vực phân bố .72.4.3 Ký chủ 82.4.4 Điều kiện phát sinh và đường lây truyền .82.4.5 Cơ chế xâm nhập 92.4.6 Bệnh lý .92.5 Một số phương pháp dùng chẩn đoán bệnh đốm trắng hiện nay .102.5.1 Một số phương pháp phổ biến .102.5.2 Sơ lược về phương pháp PCR và Realtime PCR .102.6 Một số dạng hợp chất ở thực vật 112.6.1 Alkaloid 11v 2.6.2 Flavonoid 122.7 Một số công trình nghiên cứu và sử dụng thực vật trong phòng trị bệnh cho các đối tượng thuỷ sản 12PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 153.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 153.2 Vật liệu nghiên cứu .153.2.1 Vật liệu sinh học .153.2.2 Dụng cụ và hoá chất .153.2.2.1 Dụng cụ và hóa chất trong phòng thí nghiệm .153.2.2.2 Dụng cụ và hóa chất trong phòng thí nghiệm ướt .163.3 Phương pháp nghiên cứu .163.3.1 Phương pháp ly trích và thu dịch chiết virus 163.3.2 Phương pháp cảm nhiễm virus trên tôm 163.3.3 Phương pháp thu mẫu .163.3.4 Phương pháp PCR 163.3.4.1 Phương pháp PCR định tính .163.3.4.2 Phương pháp PCR định lượng 173.3.5 Phương pháp xác định một số yếu tố môi trường 173.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm .183.4.1 Sàng lọc các hợp chất chiết xuất từ thảo dượcđối với virus gây hội chứng đốm trắng 183.4.2 Thử nghiệm các hợp chất sàng lọc khi tiêm trực tiếp hỗn hợp dich virus và hợp chất vào tôm 19PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .204.1 Sàng lọc các hợp chất chiết xuất từ thảo dượcđối với virus gây hội chứng đốm trắng 204.1.1 Kết quả sàng lọc đối với hợp chất D2 204.1.2 Kết quả sàng lọc đối với hợp chất B .214.1.3 Kết quả sàng lọc đối với hợp chất M .23vi 4.2 Kết quả thử nghiệm sau khi tiêm trên tôm hỗn hợp virus WSSV và hợp chất D2, B ở các nồng độ khác nhau .234.2.1 Kết quả thử nghiệm hợp chất D2 .274.2.2 Kết quả thử nghiệm hợp chất B .29PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .31TÀI LIỆU THAM KHẢO .32vii DANH SÁCH CÁC HÌNHHÌNH TRANGHình 4.1 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại DNAWSSV từ hỗn hợp dịch chiết virus được ủ với hợp chất D2 trong thời gian 2 giờ 20Hình 4.2 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại DNAWSSV từ hỗn hợp dịch chiết virus được ủ với hợp chất B trong thời gian 2 giờ .21Hình 4.3 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại DNAWSSV từ hỗn hợp dịch chiết virus được ủ với hợp chất M trong thời gian 2 giờ .22H ình 4.4 Biểu đồ biễu diễn chu kỳ ngưỡng phản ứng Realtime PCR của hỗn hợp dịch virus WSSV và hợp chất D2 trước thí nghiệm 28H ình 4.4 Biểu đồ biễu diễn chu kỳ ngưỡng phản ứng Realtime PCR của hỗn hợp dịch virus WSSV và hợp chất D2 sau thí nghiệm .28H ình 4.5 Biểu đồ biễu diễn chu kỳ ngưỡng phản ứng Realtime PCR của hỗn hợp dịch virus WSSV và hợp chất B trước thí nghiệm 30H ình 4.6 Biểu đồ biễu diễn chu kỳ ngưỡng phản ứng Realtime PCR của hỗn hợp dịch virus WSSV và hợp chất B sau thí nghiệm .30viii [...]... nghiệp: Thử nghiêm một số hợp chất chiết xuất từ thảo dược trong phòng trị bệnh đốm trắng do virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) trên tôm sú (Penaeus monodon)” 2 1.2 Mục đích yêu cầu - Sàng lọc một số hợp chất chiết xuất từ thảo dược có tác dụng lên virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) - Thử nghiệm tác dụng của các hợp chất sàng lọc lên virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) trong điều kiện thí nghiệm. .. thuốc thử ở các nồng độ khác nhau 20 PHẦN 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1 Sàng lọc các hợp chất chiết xuất từ thảo dược đối với virus gây hội chứng đốm trắng Hiệu quả trực tiếp của các hợp chất B, M, D2 đối với virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) được thử nghiệm bằng cách cho 250 µl dịch chiết WSSV và 250 µl với mỗi hợp chất B, M, D2 ở các nồng độ khác nhau vào các eppendorf (1 ml) và ủ hỗn hợp. .. quả điện di sản phẩm khuếch đại DNAWSSV từ hỗn hợp dịch chiết virus được ủ với hợp chất D2 trong thời gian 2 giờ ở 28 30oC Ghi chú: Giếng 1: Mẫu hỗn hợp dịch virus và hợp chất D2 (2,5 mg/ml DMSO) Giếng 2: Mẫu hỗn hợp dịch virus và hợp chất D2 (5 mg/ml DMSO) Giếng 3: Mẫu hỗn hợp dịch virus và hợp chất D2 (7,5 mg/ml DMSO) Giếng 4: Mẫu hỗn hợp dịch virus và hợp chất D2 (10 mg/ml DMSO) 21 Giếng 5: Mẫu... lượng DNA của mẫu hỗn hợp dịch virus và hợp chất trước thí nghiệm và sau thí nghiệm 26 SƠ ĐỒ .TRANG Sơ đồ 3.1 Bố trí thí nghiệm sàng lọc các hợp chất chiết xuất từ thảo dược đối với virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) 18 Sơ đồ 3.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng tác dụng của virus WSSV trong cơ thể sống của tôm sau khi ủ hỗn hợp virus và thuốc thử ở các nồng độ khác nhau ... Các loại hóa chất thường dùng: • Cồn 95% dùng cố định mẫu • Hóa chất dùng trong quy trình khuếch đại DNA virus như NAOH - SDS, dung dịch PCR, các primer… • Hóa chất dùng trong phân tích mẫu nước như NaOH, KI, KMnO4, Na2S2O3, H2SO4, hồ tinh bột,… • DMSO dùng làm dung môi hoà tan các hợp chất thử • Các hợp chất chiết xuất từ thảo dược: B, D2, M 3.2.2.2 Dụng cụ và hoá chất trong phòng thí nghiệm ướt -... được của hợp chất D2 ở các nồng độ này với dịch virus thử nghiệm thì ta thấy yếu hơn Điều này cho thấy hiệu quả tác dụng của hợp chất D2 lên virus WSSV là khá tốt nhưng chưa cao 4.1.2 Kết quả sàng lọc đối với hợp chất B 1 2 3 4 5 6 7 M Hình 4.2: Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại DNAWSSV từ hỗn hợp dịch chiết virus được ủ với hợp chất B trong thời gian 2 giờ ở 28 - 30oC Ghi chú: Giếng 1: Mẫu hỗn hợp dịch... virus và hợp chất B (2,5 mg/ml DMSO) Giếng 2: Mẫu hỗn hợp dịch virus và hợp chất B (5 mg/ml DMSO) Giếng 3: Mẫu hỗn hợp dịch virus và hợp chất B (7,5 mg/ml DMSO) Giếng 4: Mẫu hỗn hợp dịch virus và hợp chất B (10 mg/ml DMSO) 22 Giếng 5: Mẫu đối chứng dương Giếng 6: Mẫu dịch virus thử nghiệm Giếng 7: Mẫu đối chứng âm Giếng M: Thang DNA chuẩn Kết quả điện di cho thấy trên bản gel sau khi điện di xuất hiện... như trường hợp của hợp chất D2 ở trên Nếu so sánh về mức độ sáng tối thì vạch sáng ở các giếng 1, 2, 3, 4 yếu hơn so với vạch sáng ở giếng đối chứng dương và dịch virus thử nghiệm Tuy nhiên so với hợp chất D 2 thì hợp chất B ở các nồng độ tương tự có độ sáng mạnh hơn Điều này cho thấy hiệu quả tác dụng của hợp chất B lên virus WSSV là cao hơn so với hợp chất D2 Mặt khác, độ sáng tăng dần từ nồng độ... các hợp chất chiết xuất từ thảo dược đối với virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) 3.4.2 Các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm ướt 19 Mục đích của bố trí thí nghiệm để biết được khả năng tác dụng của virus WSSV trong cơ thể sống của tôm sau khi ủ hỗn hợp virus và thuốc thử ở các nồng độ khác nhau Tôm sú khoẻ kích cỡ 8 – 12 g/con Lô đối chứng âm không tiêm virus WSSV Lô đối chứng dương tiêm dịch chiết. .. (WSSV) Các hợp chất thử được hòa tan trong dung môi DMSO ở các nồng độ khác nhau Dịch chiết virus WSSV Trộn lẫn dịch chiết virus và mỗi loại hợp chất thử đã được pha ở các nồng độ khác nhau Ủ hỗn hợp dịch virus và hợp chất thử trong khoảng 2 giờ ở nhiệt độ 28 – 30oC Kiểm tra sự hiện diện của virus WSSV bằng PCR định tính nhưng không dùng NaOH-SDS trong quá trình ly trích DNA Sơ đồ 3.1: Bố trí thí nghiệm . - Sàng lọc một số hợp chất chiết xuất từ thảo dược có tác dụng lên virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV). - Thử nghiệm tác dụng của các hợp chất sàng lọc. LÂM TP. HỒ CHÍ MINHBỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC* * * * *THỬ NGHIỆM MỘT SỐ HỢP CHẤT CHIẾT XUẤT TỪ THẢO DƯỢC TRONG PHÒNG TRỊ BỆNH ĐỐM TRẮNG DO VIRUS GÂY HỘI