Tiểu luận miễn dịch thực vật: quá trình nhận biết và sự tương tác protein R và MAMPPAMP effector, Các receptor nhận biết PAMPMAMPAvr protein. Các receptor này thường được phân nhóm thành (i) các receptor nhận biêt PAMPMAMP (đối với tính kháng không đặc hiệu) và (ii) các protein R (đối với tính kháng genforgen). Các receptor nhận biết các MAMPPAMP thường là các protein xuyên màng và có vùng lặp giàu leucin nằm phía bên ngoài tế bào. Tuy nhiên, cơ sở cho việc phân chia này không phải lúc nào cũng rõ ràng, vì vây người ta có thể gộp chung cả 2 nhóm thành protein kháng R.
Protein PAMP/MAMP Các receptor nhận biết PAMP/MAMP/Avr protein Các receptor thường phân nhóm thành (i) receptor nhận biêt PAMP/MAMP (đối với tính kháng khơng đặc hiệu) (ii) protein R (đối với tính kháng gen-for-gen) Các receptor nhận biết MAMP/PAMP thường protein xun màng có vùng lặp giàu leucin nằm phía bên tế bào Tuy nhiên, sở cho việc phân chia lúc rõ ràng, vây người ta gộp chung nhóm thành protein kháng R I.1 Protein Protein liên quan đến gây bệnh (PR protein) protein tạo gây bệnh tác nhân gây bệnh chủ yếu thuộc nhóm nấm vi khuẩn, virus, tuyến trùng Ngồi cơng trùng kích thích tạo PR protein Hiện có khoảng 17 nhóm (cịn gọi họ) PR protein khác nhau, ký hiệu từ PR1 đến PR17 (theo thứ tự phát Nhiều nhóm có hoạt tính kháng nấm Dưới đặc điểm số nhóm quan trọng : PR-1 Là nhóm protein có số lượng nhiều nhất; thường hình thành với hàm lượng cao sau bị nhiễm bệnh (có thể đạt tới 1-2% tổng lượng protein lá) Protein nhóm phát thấy tất loại kiểm tra Các protein có chức tương tự PR-1 phát thấy nhiều sinh vât khác nấm, côn trùng, đọng vật có xương sống (kể người) Mặc dù chức sinh học chế hoạt động nhóm chưa rõ protein PR-1 có hoạt tính kháng nấm invitro invivo Các protein PR-1 chia thành nhóm kiềm acid Trên thuốc lá, có 16 protein PR-1 khám phá, protein loại acid (PR-1a, -1b,-1c) protein (PR-1g) hình thành bị nhiễm Tobacco mosaic virus Trên lúa có 23 gen mã hóa protein PR-1 Trên ớt, biểu gen PR-1 loại kiềm cảm ứng TMV tạo tính kháng tolerance to P parasitica var nicotianae, Ralstonia solanacearum, P syringae pv tabaci PR-2 (β-1,3- glucanase) Là nhóm protein có mặt nhiều lồi cây, động vật vi sinh vật Glucanase chia thành nhóm: nhóm I glucanase có tính kiềm hình thành khơng bào; nhóm II III có tính acid protein ngoại bào Glucanase thuộc nhóm I có hoạt tính kháng nấm invitro invivo Glucanase thuộc nhóm II III có hoạt tính kháng nầm phối hợp với glucanase nhóm I chitinase Đặc tính kháng nấm glucanase khả phân hủy vách tế bào nấm (cấu tạo glucan) PR-3 (chitinase lớp I, II, IV, VI, VII), PR-8 (chitinase lớp III) PR-11 (chitinase lớp V) Các chitinase loại protein chiếm số lượng lớn thứ PR protein Các chitinase thực vật chia làm lớp (I, II VI) vào cấu trúc protein, tính đặc hiệu chất, chế xúc tác tính mẫn cảm với chất ức chế lớp lại xếp vào nhóm PR protein Các chitinase có hoạt tính kháng nấm cách xúc tác cho phản ứng thủy phân để cắt liên kết β1,4-glycoside N-acetyl-Dglucosamine (chitin, thành phần vách tế bào nấm) Cần ý phản ứng thủy phân tạo oligosacharid có vai trị elicitor cho phản ứng phòng thủ khác PR-4 (protein liên kết chitin) Hoạt tính kháng nấm protein nhóm PR-4 làdo khả liên kết với chitin vách tế bào nấm dẫn tới ức chế sinh trưởng nấm Loại PR-4 phổ biến legumin vicilin (chiếm tới 80% hàm lương protein hạt đậu) Vicilin chứng minh có khả ức chế sinh trưởng nảy mầm bào tử nhiều loại nấm Fusarium solani, F oxysporum, Collectotrichum musae, Phytophthora capsici, Neurospora crassa, Ustilago I - - - - - - - • • • maydis Vicilin biết có khả kháng trùng đậu (Callosobruchus maculatus) PR-5 (Thaumatin-like proteins) Osmotin thaumatin-like (TL) protein protein có tính kiềm có mức tương đồng chuỗi aa đáng kể với thaumatin (một protein có vị ngọt, phân lập từ Thaumatococcus danielli Osmotin TL tương tác với màng tế bào nấm hình thành lỗ thủng xuyên màng Hai loại protein có hoạt tính 1,3-glucanase, liên kết với actin Osmotin thuốc kích thích MAPK phá vỡ đường hướng dẫn truyền tín hiệu (dựa vào MAPK) nhằm tăng cường tính ổn định vách tế bào nấm TL protein có mặt nhiều lồi PR-6 Là họ protein ức chế protease Các protein PR6 ức chế protease nhóm aspartic, serine, cystein PR-12 (Defensins) PR-13 (thionins) Defensin thionin protein có trọng lượng phân tử nhỏ (~5 kD), kích thước khoảng 45-54 aa Các protein protein hoạt động màng, phát thấy tất nhóm sinh vật độc nấm Cơ chế gây độc nấm loại protein chưa rõ defensin chứng tỏ làm tăng vận chuyển ion K+ màng, tăng hấp thụ Ca+2 nấm Neurospora crassa Chất defensin Dm-AMP1 thược dược tương tác đặc hiệu với sphingolipid nấm men Sacharomyces cerevisiae PR-14 (Protein vân chuyển lipid-LTP) Các LTP protein nhỏ, có tính kiềm LTP vận chuyển phospholipid qua màng Phân tử LTP có cấu hình gồm xoang ghét nước chạy dọc phân tử Phân tử LTP tương tác với màng tế bào nấm tự gắn xuyên qua màng tế bào xoang ghét nước tạo lỗ dò màng tế bào nấm nấm chết Ngoài ra, LTP tờ Arabidopsis dã đươch chứng minh có khả vận chuyển các phân tử tín hiệu phản ứng SAR I.2 MAMP/PAMP Tính kháng khơng đặc hiệu hình thành dựa khả nhận biết các elicitor chung (general elicitor) tác nhân gây bệnh Hiện nay, elicitor gọi PAMP (Pathogen-Associated Molecular Pattern) Thuật ngữ PAMP nhà nghiên cứu miễn dịch động vật sử dụng dần bị thay thay thuật ngữ MAMP (Microbe Associated Molecular Pattern) người ta thấy vi sinh vật khơng gây bệnh có PAMP giống tác nhân gây bệnh Các PAMP/MAMP nhìn chung đa dạng chất hóa học, thường chuỗi peptide, glycoprotein, lipids oligosaccharides có nguồn gốc từ tác nhân gây bệnh không gây bệnh Các PAMP/MAMP hiển nhiên bảo thủ nhóm tác nhân gây hại Một số MAMP/PAMP chung tiếng là: Lypopolysacharid (LPS) LPS có nguồn gốc từ vi khuẩn gram (-) Xanthomonas, Pseudomonas…LPS cảm ứng để tạo cháy oxy hóa, hình thành enzyme kháng sinh Flagellin Là protein cấu tạo nên lông roi vi khuẩn gram (-) Mỗi lông roi bao gồm hàng ngàn tiểu phần flagellin Flagellin chứa motif nhân biết gồm 22 aa (đoạn fgl22) Flagellin cảm ứng tạo để hình thành callose phản ứng phịng thủ khác hình thành PR protein Harpin Harpin protein mã hóa gen hrp (viết tắt hypersensitive response and pathogenicity) vi khuẩn gram (-) Phần lớn loài vi khuẩn có cum gen hrp Cum lớn gồm 6-9 đơn vị phiên mã, đơn vị mã hóa 1-9 protein Các protein harpin nằm màng tế bào vi khuẩn, tham gia cấu tạo nên hệ thống tiết loại III vi khuẩn Hệ thống tiết loại III • • • vận chuyển Avr protein harpin vào tế bào Harpin cảm ứng để tạo phản ứng siêu nhạy/apoptosis phản ứng phòng thủ khác Chitin Chitin phân tử oligomer có nguồn gốc từ vách tế bào nấm Chitin cảm ứng hình thành phytoalexin lignin hóa tế bào Glucan Glucan có nguồn gơc từ vách tế bào nấm, đặc biệt nấm trứng Phytophthora Glucan cảm ứng hình thành phytoalexin Glycoprotein Glicoprotein có nguồn gốc từ vách tế bào nấm trứng Phytophthora Glycoprotein cảm ứng hình thành phytoalexin Các tác nhân vi sinh vật hình thành phân tử gọi mơ hình phân tử ký hiệu MAMP hay PAMP Tính kháng = tính kháng khởi động MAMP/PAMP Hai ví dụ MAMP/PAMP: 1.Flagellin; 2.Harpin Vd MAMP/PAMP 1: Flagellin: Là protein cấu tạo nên lông roi (flagella) vi khuẩn gram (-) Mỗi lông roi gồm hàng ngàn flagellin Flagellin chứa motif nhân biết gồm 22 aa (đoạn fgl22) Cảm ứng tạo callose, PR protein flg22 Ví dụ MAMP/PAMP 2: harpin Harpin protein mã hóa gen HRP vi khuẩn gram (-), nằm màng tế bào vi khuẩn, tham gia cấu tạo nên hệ thống tiết loại III Hệ thống tiết loại III vận chuyển Avr protein harpin vào tế bào Cảm ứng tạo phản ưng siêu nhạy - MAMP (Microbe-Associated Molecular Pattern): mơ hình phân tử có nguồn gốc từ vi sinh vật nói chung - PAMP (Pathogen-Associated Molecular Pattern): mơ hình phân tử có nguồn gốc từ tác nhân gây bệnh Một số ví dụ MAMP/PAMP: • Lipopolysacharide (LPS) vi khuẩn Gram (-) • Peptidoglycan vi khuẩn Gram (+) • Flagellin lơng roi vi khuẩn • Glucan, chitin vách tế bào nấm • Các Avr protein tác nhân gây bệnh (Avr=Avirulence)? II Nhận biết tương tác protein R PAMP/MAMP/Effector Sự nhận biết tương tác tuân theo chế trực tiếp gián tiếp trình bày chương trước Vai trò Effector (chất hiệu ứng): Như biết, effector phân tử có nguồn gốc từ tác nhân gây bệnh tác động lên tế bào ký chủ, nhờ tạo điều kiện cho nhiễm bệnh Đối với cây, nhận biết elicitor chung (MAMP/PAMP) hình thành tính kháng Tính kháng cịn gọi tính kháng khởi động MAMP/PAMP Tính kháng hiệu dẫn tới khơng bị bệnh Tuy nhiên, tác nhân gây bệnh khắc phục tính kháng cách tiết vào tế bào effector Một vi khuẩn gây bệnh (vd Pseudomonas syringae) q trình gây bệnh tiết vào tế bào thực vật từ 20 -30 effector khác thông qua hệ thống tiết loại III Tương tự, loại nấm biotroph tiết vào tế bào nhiều effector thơng qua vịi hút (haustorium) hình thành bên tế bào (vd nấm gỉ sắt lanh M lini tiết vào tế bào tới 21 loại effector khác nhau) Nhiều effector tác nhân gây bệnh có hoạt tính enzym, có vai trị biến đổi protein ký chủ nhằm tạo điều kiện cho gây bệnh làm khả nhận biết Một vai trò effector ức chế phản ứng phòng thủ thông qua nhận biết PAMP/MAMP Một số protein virus thực vật (Vd HP = Helper Component) potyvirus) có khả ức chế phản ứng phịng thủ thơng qua chế gene silencing xem effector virus Nếu hoạt động effector hiệu quả, bị nhiễm bệnh Các effector tác nhân gây bệnh nghiên cứu nhiều Avr protein Nếu có gen R nhận biết Avr protein lớp phản ứng kháng thứ hình thành gọi tính kháng khởi động effector Tính kháng khởi động effector hiển nhiên đặc hiệu thường tuân theo quan hệ gen-đối-gen Hình Nhận biết tương tác protein R PAMP/MAMP/Effector (Chisholm et al., 2006) III Dẫn truyền tín hiệu miễn dịch thực vật Phản ứng phòng thủ tạo điều khiển mạng lưới đường hướng dẫn truyền tín hiệu chồng chéo lên Nhiều phân tử tham gia đường hướng dẫn truyền tín hiệu 3.1 Đường hướng salicyclic acid (SA) Salicyclic acid (SA) phytohormon, có vai trị quan trọng phát triển, quang hợp, hô hấp… thực vật SA phân tử tín hiệu nội sinh tham gia cảm ứng tính kháng tạo thực vât Vai trị SA dẫn truyền tính kháng chứng minh số thí nghiệm: • Xử lý SA thuốc dẫn tới giảm triệu chứng bị nhiễm TMV tích lũy nhiều PR protein (thí nghiệm White, 1970) • Lây nhiễm TMV thuốc dẫn tới hàm lượng SA tăng cục (tại vị trí lây nhiễm) hệ thống (tồn cây) • Cây Arabidopsis chuyển gen NahG (naphthalene hydroxylase G) vi khuẩn Pseudomonas putida (là gen mã hóa salicylate hydroxylase, enzyme chuyển SA thành - dạng bất hoạt catechol) biểu tính mẫn cảm cao nhiều loại tác nhân gây bệnh khác nấm, vi khuẩn virus • Cây chứa đột biến khả tích lũy SA eds4, eds5 (enhanced disease susceptibility), sid1, sid2 (SA induction-deficient), pad4 (phytoalexin-deficient) biểu tính mẫn cảm cao với tác nhân gây bệnh SA tương tác với catalase – enzyme xúc tác cho phân hủy H2O2 thành H2O O2 H2O2 phân tử hoạt động phía thượng lưu q trình dẫn truyền tín hiệu Phía hạ lưu đường hướng dẫn truyền tín hiệu (phía sau SA) protein gọi NPR1 (non-expressor of PR1 protein) cần cho dẫn truyền SA Sản phẩm cuối đường hướng dẫn truyền SA loại PR protein (xem 3), quan trọng protein nhóm PR1 Đường hướng dẫn truyền SA thường tác nhân gây bệnh nhóm biotroph gây (bài 3) Nhìn chung tác nhân gây bệnh sinh trưởng gian bào nhân lên mô nhiều ngày trướ gây chết hoại mô 3.2 Đường hướng dẫn truyền JA ET Jasmonic acid (JA) ethylen (ET) phytohormon Cả JA ET chứng minh có vai trị tính kháng bệnh ví dụ sau: • Cây Arabidopsis mang đột biến khả hình thành JA fad3/fad7/fad8 (3 đột biến gen fatty acid desaturase) khả tiếp nhận JA coi1 (coronatine insensitive1) kháng JA jar1 (jasmonic acid resistant1) biểu tính mẫn cảm dối với loạt tác nhân gây bệnh nấm Alternaria brassicicola, Botrytis cinerea, Pythium, vi khuẩn Erwinia carotovora • Cây Arabidopsis mang đột biến trơ với ET ein2 (ethylene insensitive2) biểu tính mẫn cảm với nấm B cinerea vi khuẩn E carotovora • Xử lý JA ET dẫn đến biểu hiên gen PDF1-2 (mã hóa protein phịng thủ defensin) Thi2-1 (mã hóa protein phịng thủ thionin), hel (hevein-like protein) chib (chitinaseB) Các gen xem dấu hiệu phổ biến đường hướng dẫn truyền JA/ET Đường hướng JA/ET có nhiều điểm khác với đường hướng SA: (1) JA/ET hình thành chủ yếu nhóm necrotroph nấm Alternaria brassicicola, Botrytis cinerea, Pythium, vi khuẩn Erwinia carotovora Các tác nhân giêt chết nhanh chóng tế bào để hấp thu dinh dưỡng (xem 2); (2) tích lũy JA ET hình thành tác nhân gây bệnh, hình thành từ tổn thương côn trùng 3.3 Giao tiếp chéo (cross talk) đường hướng SA JA/ET Đã có nhiều chứng cho thấy đường hướng SA JA/ET khơng hồn tồn độc lập với mà có tương tác với Cả đường hướng có ảnh hưởng thuận nghịch nhìn chung, mối quan hệ nghịch (đối kháng) phổ biến Ví dụ Arabidopsis mang gen kháng eds1 pad4 (giảm tích lũy SA) làm tăng khả biểu đường hướng JA/ET Quan hệ đối kháng cần xem xét ứng dụng thực tế tạo SAR để chống bệnh theo đường hướng SA SAR theo đường hướng JA/ET bị ức chế dẫn tới dễ bị nhiễm côn trùng gây hại 3.4 Dịng thác ion đốt cháy oxy hóa Trên màng tế bào ký chủ có receptor ngoại bào (ví dụ FLS2) Ngay sau ký chủ nhận biết có mặt tác nhân gây bệnh màng tế bào, có thay đổi dòng ion vào/ra tế bào qua kênh ion dẫn tới thay đổi cân K+/H+ màng (dòng Ca2+ H+ vào tế - bào tăng, dòng K+ Cl- khỏi tế bào tăng) Phản ứng lại thay đổi hoạt hóa protein liên kết màng kinase, phosphatase, phospholipase protein G Các kinase hoạt hóa NADPH oxidase để chuyển O2 thành lớp oxy hoạt hóa (ROS= reactive oxygen classes) H2O2, O2-, HO2 Ngoài ra, kinase hoạt hóa nitric oxydase để tổng hợp nitric oxide (NO) sử dụng lượng từ NADPH Các lớp oxy hóa khử (đặc biệt H2O2) NO ảnh hưởng đến tính kháng cách: • ROS, đặc biệt H2O2, hoạt động màng/vách ROS cảm ứng q trình lignin hóa vách tế bào liên kết hợp chất vách tế bào (crosslinking) ROS oxy hóa hợp chất đặc biệt lipid màng tế bào, ví dụ tạo thành lipid hdroperoxide chất độc tế bào ROS oxy hóa hợp chất phenolic thành chất quinon độc với tế bào Hậu tế bào bị chết nhanh chóng (phản ứng siêu nhạy HR) Cần ý trình cảm ứng phản ứng siêu nhạy có vai trị NO Người ta chứng minh cân bàng NO/ H2O2 cần thiết để cảm ứng phản ứng siêu nhạy • H2O2 NO tham gia dẫn truyền tín hiệu cho đường hướng dẫn truyền tín hiệu phịng thủ khác Ví dụ H2O2 cảm ứng đường hướng MAPK (xem phần đường hướng MAPKi) cảm ứng để tổng hợp phenylalanin ammonia lyase (PLA), enzyme cần thiết cho trình sinh tổng hợp SA (xem phần đường hướng SA) Hình Dịng thác ion dẫn truyền tín hiệu miễn dịch thực vật 3.5 Đường hướng MAPK (Mitogen Activated Protein Kinases) Đường hướng MAPK đường hướng dẫn truyền chủ chốt tính kháng bệnh Đây đường hướng chung sinh vật nhân thật cách dẫn truyền tín hiệu ngoại bào thơng qua receptor bề mặt Đường hướng MAPK dựa vào nhận biết thông qua PAMP/MAMP Sự nhận biết receoptor ký chủ PAMP/MAMP vi sinh vật (Vd: flg22, HrpZ, EF-Tu vi khuẩn, Pep 13, NPP1, glucan nấm trứng, chitin ergosterol nấm thật) dẫn tới dòng thác dẫn truyền tín hiệu tế bào gọi đường hướng dẫn truyền MAPK (Mitogen Activated Protein Kinases) MAPK protein kinase đặc hiệu serin/threonin có nghĩa phosphorin hóa nhóm OH serin threonin Một dịng thác MAPK nhìn chung chuỗi MAPKKK=>MAPKK=>MAPK cho phép truyền dấu hiệu ngoại bào thông qua receptor thành loạt phản ứng nội bào Ví dụ gen Arabidopsis mã hóa 20 MAPKs Sự hoạt hóa dịng thác MPK kích hoạt yếu tố phiên mã WRKY nhân tế bào dẫn tới kích hoạt q trình phiên mã nhiều gen phịng thủ (WRKY họ protein có khả liên kết với promoter gen kháng) Flagellin loại PAMP chung nghiên cứu nhiều số PAM/MAMP vi khuẩn hại thực vật Flagellin protein cấu trúc lông roi vi khuẩn Flagellin chứa đoạn 22 amino acid bảo thủ gọi fgl22 Fgl22 nhận biết receptor tế bào thực vật FLS2 FLS2 receptor kinase xuyên màng với đoạn lặp giàu leucin (LRR) nằm phía ngồi màng tế bào (chịu trách nhiệm nhận biết) vùng có hoạt tính kinase nằm tế bào chất Ngay sau FLS2 nhận biết có mặt fgl22, vùng kinase khởi động đường hướng MAPK cách hoạt hóa kinase tế bào AtMEKK1 => AtMKK4/5 => AtMPK3/6, dẫn tới khởi động yếu tố phiên mã hoạt động trong nhân (Vd yếu tố WRKY) cuối tổng hợp hợp chất tạo tính kháng (vd PR protein) Đường hướng dẫn truyền tín hiệu MAPK IV Tài liệu tham khảo - Hà Viết Cường, 2011, giáo trình miễn dịch thực vật, Học viện nơng nghiệp Việt Nam, Nhà xuất Đại học Nông nghiệp I ... Avr protein tác nhân gây bệnh (Avr=Avirulence)? II Nhận biết tương tác protein R PAMP/MAMP /Effector Sự nhận biết tương tác tuân theo chế trực tiếp gián tiếp trình bày chương trước Vai trò Effector. .. sau SA) protein gọi NPR1 (non-expressor of PR1 protein) cần cho dẫn truyền SA Sản phẩm cuối đường hướng dẫn truyền SA loại PR protein (xem 3), quan trọng protein nhóm PR1 Đường hướng dẫn truyền... Các effector tác nhân gây bệnh nghiên cứu nhiều Avr protein Nếu có gen R nhận biết Avr protein lớp phản ứng kháng thứ hình thành gọi tính kháng khởi động effector Tính kháng khởi động effector