LUẬN ÁN TIẾN SĨ - THƯ VIỆN QUỐC GIA VIỆT NAM

Nghiªn cøu sù ph©n bè cña gen tham gia ph©n hñy 2,4-D trong ®Êt nhiÔm chÊt diÖt cá chøa dioxin b»ng hai kü thuËt SSCP fingerprint vµ MPN-PCR.. X¸c ®Þnh c¸c ®o¹n.[r]

(1)

VÀ ĐÀO TẠO VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC -

NGUYỄN BÁ HỮU

NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG VI SINH VẬT VÀ MỘT SỐ GEN LIÊN QUAN ĐẾN KHẢ NĂNG PHÂN HỦY 2,4,5-T VÀ DIOXIN

TRONG ĐẤT NHIỄM CHẤT ĐỘC HÓA HỌC

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số : 62 42 40 01

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

(2)

Cơng trình hồn thành tại: Viện Cơng nghệ sinh học

Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam

Người hướng dẫn khoa học:

1 PGS TS Đặng Thị Cẩm Hà, Viện Công nghệ sinh học

2 PGS TS Nông Văn Hải, Viện Công nghệ sinh học

Phản biện 1: GS TS Đặng Đình Kim,

Viện Cơng nghệ mơi trường, Viện KH & CN Việt Nam

Phản biện 2: GS TS Nguyễn Thành Đạt, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội

Phản biện 3: GS TS Phạm Văn Ty,

Trường Đại học khoa học Tự nhiên-Đại học Quốc gia Hà Nội

Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Nhà nước,

Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học & Công nghệ Việt Nam,

18-Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội

vào hồi 30 ngày 22 tháng năm 2010

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Quốc gia

(3)

1 Nguyễn Bá Hữu, Nghiêm Ngọc Minh, Đặng Thị Cẩm Hà 2006 Xác định nhóm vi khuẩn khử clo Dehalococcoides trong xử lý tẩy độc đất nhiễm chất dioxin Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 4(4): 519-526

2 Nguyễn Bá Hữu, Đặng Thị Cẩm Hà 2007 Xác định gien mã hóa dioxygenaza

của chủng xạ khuẩn phân hủy dibenzofuran Rhodococcus sp HDN3 phân lập từ đất nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin Đà Nẵng Tạp chí Khoa học Cơng nghệ 45 (2): 61-67

3 Nguyễn Bá Hữu, Đặng Thị Cẩm Hà 2007 Xác định gien mã hóa dioxygenaza từ chủng vi khuẩn phân hủy dibenzofuran Terrabacter sp DMA phân lập từ đất nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin Đà Nẵng Tạp chí Sinh học 29 (3): 83-89

4 Ngun Bá Hữu, Đàm Thúy Hằng, Nghiêm Ngọc Minh, Đặng Thị CÈm Hµ

2007 Xác định cấu trúc tập đồn vi khuẩn khử loại clo Dehalococcoides trong mẫu bùn hồ khu vực nhiễm chất diệt cỏ/dioxin sân bay Đà Nẵng kỹ thuật PCR-DGGE Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển nông thôn 16: 41-45

5 Nguyễn Bá Hữu, Đặng Thị Cẩm Hà 2007 Nghiên cứu số đặc điểm sinh học phân tử ba chủng vi khuẩn sử dụng 2,4-D phân lập từ đất nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin Đà Nẵng Tạp chí Sinh học 29(4): 80-85

6 Nguyễn Bá Hữu, Đặng Thị Cẩm Hà, Dietmar H Pieper 2007 Xác định cấu trúc tập đoàn vi khuẩn đất nhiễm chất độc hóa học Đà Nẵng dựa phân tích đa hình cấu trúc sợi đơn gen 16S rRNA Tạp chí Công nghệ sinh học 5(1): 123-132

7 Nguyễn Bá Hữu, Đặng Thị Cẩm Hà, Nông Văn Hải, Dietmar H Pieper 2007

Tính đa dạng cấu trúc tập đồn vi khuẩn q trình xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin qui mô nhỏ tr−ờng Tạp chí Cơng nghệ sinh học 5(2): 255-264

8 Nguyễn Bá Hữu, Đặng Thị Cẩm Hà 2007 Xác định đoạn gen mã hóa

dioxygenase chủng vi khuẩn Paenibacillus sp Ao3 phân hủy dibenzofuran phân lập từ bùn ao thuộc khu đất nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin Đà Nẵng Tạp chí Cơng nghệ sinh học 5(3): 391-396

9 Nguyễn Bá Hữu, Đặng Thị Cẩm Hà, Nông Văn H¶i, Dietmar H Pieper 2007

Xác định đa dạng vi nấm đất nhiễm chất độc hóa học Đà Nẵng dựa phân tích đa hình cấu trúc sợi đơn gen 18S rRNA Tạp chí Cơng nghệ sinh học

5(4): 513-521

10 Nguyễn Bá Hữu, Đặng Thị Cẩm Hà 2008 Nghiên cứu biến động cấu trúc tập đoàn vi sinh vật trình xử lý đất bị nhiễm chất diệt cỏ chứa đi-ô-xin qui mô tr−ờng công nghệ phân hủy sinh học Tạp chí Sinh học 30 (1): 55-61

11 Nguyễn Bá Hữu, Đặng Thị Cẩm Hà 2008 Nghiên cứu phân bố gen tham gia phân hủy 2,4-D đất nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin hai kỹ thuật SSCP fingerprint MPN-PCR Tạp chí Cơng nghệ sinh học 6(1): 127-132

12 Nguyễn Bá Hữu, Đàm Thúy Hằng, Đặng Thị Cẩm Hà 2008 Xác định đoạn

gen m· hãa enzyme chun hãa chÊt diƯt cá tõ ba chđng vi khuẩn phân hủy dibenzofuran Tạp chí Công nghệ sinh học 6(2): 257-264

13 Nguyễn Bá Hữu, Đàm Thúy Hằng, Đặng Thị Cẩm Hà 2008 Khả phân hủy

diaryl ether số hợp chất vòng thơm khác ba chủng vi khuẩn phân lập từ đất nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin Đà Nẵng Tạp chí Công nghệ sinh học

6(4A): 829-835

14 Nguyễn Bá Hữu, Đàm Thúy Hằng, Đặng Thị Cẩm Hà 2008 Xác định đa dạng

vi khuÈn bïn hå khu vực nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin sân bay Đà Nẵng kỹ thuật PCR-DGGE Tạp chí Khoa học công nghệ 46(6): 59-65

15 Nguyen Ba Huu, Dang Thi Cam Ha 2008 Change of microbial community

(4)

Mở ĐầU 1 Tính cấp thiết đề tài

Từ 1961-1971, quân đội Mỹ rải trăm triệu lít chất độc hóa học xuống nhiều vùng miền Trung Nam Việt Nam (Stellman đtg, 2003) Hiện nay, đất trầm tích khu vực bãi nhiễm sân bay Đà Nẵng bị ô nhiễm nặng 2,4-D (2,4-dichlrophenoxyacetic acid); 2,4,5-T (2,4,5-trichlrophenoxyacetic acid) dioxin Khử độc đất nhiễm dựa công nghệ phân hủy sinh học đ−ợc quan tâm giá rẻ thân thiện với môi tr−ờng Cơng nghệ đ−ợc nghiên cứu phịng thí nghiệm áp dụng qui mơ pilot sân bay Đà Nẵng Các nghiên cứu tr−ớc phân lập đ−ợc số chủng vi sinh vật sử dụng chất diệt cỏ chứa dioxin hợp chất t−ơng tự, nhiên ch−a có nghiên cứu chi tiết thành phần loài vi sinh vật gen chức tham gia chuyển hóa chất độc hóa học đất nh− bùn hồ khu vực sân bay Đà Nẵng Do hạn chế ph−ơng pháp dựa nuôi cấy nên kỹ thuật sinh học phân tử đ−ợc nhiều nghiên cứu sử dụng nhằm thu đ−ợc kết gần với đa dạng thực vi sinh vật tự nhiên Các nhà nghiên cứu nhận thấy, kết hợp ph−ơng pháp vi sinh vật truyền thống dựa ni cấy, ph−ơng pháp sinh hóa sinh học phân tử nghiên cứu đa dạng vi sinh vật thu đ−ợc kết xác

Công nghệ phân hủy sinh học đ−ợc áp dụng khử độc đất nhiễm Đà Nẵng Biên Hòa dựa kích thích quần xã vi sinh vật địa tham gia vào trình phân hủy chất độc Do vậy, liệu quần xã vi sinh vật khu vực bãi nhiễm nh− biến động quần xã vi sinh vật trình xử lý cần thiết cho nhà nghiên cứu công nghệ nhằm nâng cao hiệu khử độc hợp chất đa vòng thơm chứa clo có dioxin

Trên sở khoa học ý nghĩa thực tiễn đ−ợc trình bày trên, Luận án đ−ợc thực với mục đích nội dung sau:

2 Mục đích nghiên cứu

(5)

3 Néi dung nghiªn cøu

a Nghiên cứu đa dạng vi sinh vật đất, hồ bị ô nhiễm công thức xử lý khử độc;

b Nghiên cứu đa dạng gen tfdA mẫu đất nhim;

c Nghiên cứu đa dạng vi khuẩn kỵ khí tùy tiện vi khuẩn khử loại clo

Dehalococcoides bïn hå khu vùc b·i nhiÔm;

d Nghiên cứu biến động quần xã vi khuẩn cơng thức xử lý đất nhiễm chất độc hóa học;

e Phân lập, nghiên cứu số đặc điểm sinh học định tên số chủng vi khuẩn sử dụng 2,4-D, dioxin chất t−ơng tự;

f Xác định có mặt gen mã hóa dioxygenase gen tftA (cadA) liên quan đến phân hủy 2,4,5-T số chủng vi khuẩn

4 Những đóng góp luận án

a Đây cơng trình nghiên cứu sâu Việt Nam đa dạng vi sinh vật đất bùn hồ nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin khu bãi nhiễm sân bay Đà Nẵng

b Đã ứng dụng thành công kỹ thuật sinh học phân tử: phân tích đa hình cấu trúc sợi đơn (SSCP) điện di gel với dải nồng độ chất biến tính (DGGE) đoạn gen tfdA, 16S rRNA 18S rRNA để đánh giá quần xã vi khuẩn nấm đất bùn hồ nhiễm nh− công thức tẩy độc đất nhiễm phân hủy sinh học, xác định số l−ợng đoạn gen tfdA đất nhiễm áp dụng BOX-PCR MPN-PCR để phân biệt khác vi sinh vật

c Phát đợc ba chủng vi khuẩn Paenibacillus sp Ao3, Terrabacter

sp DMA Rhodococcus sp HDN3 sử dụng dibenzofuran hợp chất t−ơng tự, chủng HDN3 sử dụng đ−ợc dibenzo-p-dioxin 2-chlorodibenzo-p-dioxin nh− nguồn carbon l−ợng Nhóm vi khuẩn kị khí Sedimentibacter đ−ợc phát cơng thức xử lý khử độc cơng nghệ “chơn lấp tích cực”

d Xác định đ−ợc đoạn gen giống ahDO chủng vi khuẩn Ao3 hai đoạn

(6)

tham gia b−ớc phân hủy hợp chất vòng thơm Đồng thời phát đ−ợc gen tfdA tftA(cadA) chủng vi khuẩn kể chủng vi khuẩn Arthrobacter sp DNB19 sử dụng 2,4-D PAH Sự phát gen sở chứng minh trình chuyển gen chức vi sinh vật khu vực bãi nhiễm Đà Nẵng

5 Bè cơc cđa ln án: Luận án gồm 149 trang Mở đầu: trang

Chơng I Tổng quan tài liệu: 45 trang

Chơng II Vật liệu phơng pháp: 12 trang

Chơng III Kết thảo luận: 66 trang (11 bảng 31 hình) Kết luận kiến nghị: trang

Tài liệu tham khảo: 18 trang gồm: 21 tµi liƯu tiÕng ViƯt, 182 tµi liƯu tiÕng Anh

CHƯƠNG TổNG QUAN TI LIệU

1.1. Phân hủy sinh học 2,4-D; 2,4,5-T, dioxin chất tơng tự

1.1.1 Phân hủy sinh học 2,4-D 2,4,5-T

Các công bố tập trung chủ yếu vào phân hủy hiếu khí 2,4-D 2,4,5-T vi khuẩn Phân hủy 2,4-D thành 2,4-DCP (2,4-dichlorophenol) enzym dioxygenase phụ thuộc -ketoglutarate đợc mÃ hóa gen tfdA Gen tfdA cã ë vi khuÈn β vµ γ-proteobacteria, chia thành lớp thờng nằm plasmid Một sè TfdA cịng chun hãa 2,4,5-T ë møc thÊp Gen

tfdA vi khuẩn α-proteobacteria đ−ợc đặt tên tfdAα

(7)

1.1.2 Ph©n hđy sinh học dioxin hợp chất tơng tự

Phân hủy sinh học dioxin hợp chất t−ơng tự điều kiện hiếu khí đ−ợc nghiên cứu kỹ chủng vi khuẩn Sphingomonas sp RW1 b−ớc chuyển hóa có tham gia enzym dioxygenase Oxy hóa kép xảy vị trí bên 1,2; 2,3 3,4 vị trí góc 4,4a Oxy hóa kép vị trí góc đ−ợc quan tâm phá vỡ đ−ợc cấu trúc mặt phẳng nguyên nhân gây độc dioxin Phân hủy dioxin điều kiện kỵ khí dẫn đến loại bớt khử hoàn toàn clo dioxin Các nghiên cứu phân hủy dioxin hợp chất t−ơng tự vi nấm chủ yếu tập trung nấm đảm Hiện có thử nghiệm sân bay Đà Nẵng lập kết hợp kích thích sinh học “chơn lấp tích cực” để khử độc đất nhiễm dioxin “Chơn lấp tích cực” dựa kết hợp lập, hấp phụ kích thích vi sinh vật địa đ−ợc áp dụng xử lý 3.384 m3 đất nhiễm chất độc hóa học sân bay Biên Hòa Các nghiên cứu tr−ớc Việt Nam khảo sát số l−ợng định loại đ−ợc số chủng vi sinh vật im núng

1.2. Đa dạng vi sinh vật phơng pháp nghiên cứu

Cỏc nghiờn cứu đa dạng vi sinh vật đất khai thác tớnh a dng

chủng loài gen chức vi sinh vật nh trực tiếp tõ

đất Mỗi kỹ thuật có −u, nh−ợc điểm riêng Sự kết hợp số kỹ

thuật đem lại cách đánh giá tổng quát đa dạng vi sinh vật Đa

dạng vi sinh vật đ−ợc đánh giá mức thấp sử dụng ph−ơng pháp phụ thuộc nuôi cấy Chỉ xấp xỉ 1% vi khuẩn (Davis đtg, 2005) số nhỏ vi nấm ni cấy đ−ợc phịng thí nghiệm (Hawksworth, 2001) Các ph−ơng pháp sinh học phân tử đ−ợc sử dụng để có hiểu biết đầy đủ đa dạng vi khuẩn vi nấm Các kỹ thuật DGGE, SSCP,

MPN-PCR, BOX-PCR xác định trình tự gen đ−ợc tiến hành nhằm

tìm hiểu đa dạng vi sinh vật gen chức mẫu đất, bùn

nhiễm chất độc hóa học nh− cơng thức khử độc Đà

Nẵng Bên cạnh đó, phân lập, định loại số chủng vi khuẩn xác định

sù cã mỈt cđa mét sè gen chøc tham gia vào trình phân hủy

chất độc cung cấp thêm liệu tính đa dạng vi sinh vật đất

(8)

CHƯƠNG VậT LIệU V PHƯƠNG PHáP 2.1 Vật liệu công thức xử lý

- mẫu đất bãi nhiễm (HDN1-HDN9), 10 mẫu bùn hồ A bị ảnh h−ởng trực tiếp n−ớc từ bãi nhiễm (A1-A10), mẫu bùn hồ B (B1-B2) mẫu bùn hồ C (C1) bị ảnh h−ởng trực tiếp n−ớc từ bãi nhiễm chất độc hóa học sân bay Đà Nẵng

- công thức xử lý lập kích thích sinh học 0,5m3 (0,5DN1 đến 0,5DN4) công thức đối chứng cô lập 0,5m3 (0,5DN5) Đất đ−ợc lấy điểm trộn cho vào thùng 0,5DN

- Đất vị trí bãi nhiễm có nồng độ chất độc hóa học khác đ−ợc cho vào cơng thức xử lý lập kích thích sinh học 1,5m3 (1,5DN1;1,5DN2; 1,5DN3; 1,5DN4 1,5DN5)

- 10 m3 100 m3 đất vị trí khác bãi nhiễm đ−ợc xử lý “chơn lấp tích cực” đ−ợc ký hiệu 10DNT 100DNT

- Mẫu công thức xử lý đ−ợc thu thập thời điểm Ba đợt đầu đợt cách khoảng tháng, đợt thứ t− cách đợt thứ ba khoảng 30 tháng - Các sinh phẩm hóa chất dùng nghiên cứu cung cấp hãng, Mo Bio, Invitrogen, Abgene, Promega, Fermentas, Fluka, Biorad, Applied Biosystems v.v

- ThÝ nghiÖm đợc thực Viện Công nghệ sinh học, Phòng nghiên cứu phân hủy sinh học - Trung tâm nghiên cứu bệnh truyền nhiễm Helmholtz, Cộng hòa liên bang Đức phòng kỹ nghệ sinh học-Đại học Công giáo Louvain, Vơng quốc Bỉ

2.2 Phơng pháp

- Ph−ơng pháp phân lập, nuôi cấy định loại vi khuẩn sử dụng dibenzofuran chất t−ơng tự

- Ph−ơng pháp phân tích đa dạng vi sinh vật đất, bùn hồ nhiễm cơng thức khử độc chất độc hóa học phân hủy sinh học: MPN-PCR, BOX-PCR, PCR-SSCP PCR-DGGE

- Ph−ơng pháp xác định đoạn gen tfdA, tftA(cadA) gen mã hóa enzym dioxygenase mẫu đất chủng vi khuẩn

(9)

CHƯƠNG KếT QUả Vμ THảO LUậN 3.1 Đa dạng vi sinh vật mẫu đất

3.1.1 Đa dạng vi khuẩn xác định kỹ thuật SSCP

Mẫu HDN4 HDN6 khơ hơn, có độ ô nhiễm cao có mức đa dạng vi khuẩn thấp so với mẫu khác (hình 3.1) Trình tự 46 dịng DNA thuộc lớp vi khuẩn Actinobacteria, Acidobacteria, α, β γ

-proteobacteria Vi khuẩn chi Burkholderia chiếm −u mẫu đất nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin Đà Nẵng Vi khuẩn sử dụng 2,4-D 2,4,5-T phân lập từ đất nhiễm chất độc da cam Florida (Mỹ) có quan hệ gần gũi với vi khuẩn chi Burkholderia (Rice đtg, 2005)

Hình 3.1. Điện di đồ SSCP mẫu đất nhiễm, số ghi bên phải băng DNA tên dòng đ−ợc xác định trình tự nucleotide

Trong nghiªn cứu phát đợc hai chi Rhodococcus

Micobacterium, số vi khuẩn đất Frateuria, Nevsia, Bradyrhizobium,

Azospirillum vµ vi khuÈn −a axÝt Acidocella, Acidiphillum vµ

(10)

Bảng 3.1 Mối quan hệ số dòng tách từ gel SSCP vi khuẩn cơng bố

Dßng Sè Genbank

Líp Vi khn gÇn gịi nhÊt

27HDN7 DQ991279 VK đất Acidobacteriaceae 1496-2 không nuôi cấy 30HDN8 DQ991282 Acidobacterium capsulatum 161 không nuôi cấy 31HDN9 DQ991283 Acidobacteriaceae WD257

32HDN9 DQ991284 VK đất rừng Acidobacterium không nuôi cấy 33HDN9 DQ991285 Vi khuẩn Ellin310

35HDN1 DQ991287 VK đất Acidobacterium 466-2 không nuôi cấy 41HDN3 DQ991292

Acidobacteria

Vi khuÈn RCP2-90 kh«ng nu«i cÊy 24HDN3 DQ991276 Mycobacterium sp 'Bavariae' 29HDN7 DQ991281 Micromonospora sp IM-1078 43HDN4 DQ991294 Rhodococcus fascians D188 45HDN4 DQ991295

Actinoba

c-teria

R opacus M213 26HDN5 DQ991278 Azospirillum sp TS7

28HDN7 DQ991280 Alpha proteobacterium A0839 34HDN9 DQ991286 Acidocella sp GS19h

38HDN2 DQ991289 Tistrella mobilis

47HDN5 DQ991296 Bradyrhizobium elkanii BR3262 50HDN8 DQ991298 Acidocella facilis ATCC 35904T 51HDN8 DQ991299 Acidocella sp St1-2

53HDN7 DQ991300

Alpha

proteobacteria

Acidiphilium aminolytica 101T

1HDN2 DQ991255 VK ch−a định loại Burkholderiaceae 005-D 2HDN3 DQ991256 VK ch−a định loại Burkholderiaceae 005-D 3HDN4 DQ991257 Delftia acidovorans B

4HDN1 DQ991258 VK ch−a định loại Burkholderiaceae 005-D 5HDN2 DQ991259 VK ch−a định loại Burkholderiaceae 005-D 6HDN3 DQ991260 VK ch−a định loại Burkholderiaceae 005-D 7HDN5 DQ991261 VK ch−a định loại Burkholderiaceae 005-D 8HDN7 DQ991262 VK phân hủy 2,4-D Burkholderiaceae TFD6 9HDN8 DQ991263 VK ch−a định loại Burkholderiaceae 005-D 10HDN9 DQ991264 VK ch−a định loại Burkholderiaceae 005-D 11HDN2 DQ991265 Burkholderia cepacia LMG 12615

12HDN3 DQ991266 B glathei Hg

14HDN5 DQ991267 Burkholderia sp S2.1

15HDN5 DQ991268 B caryophylli ATCC 25418T 16HDN5 DQ991269 B caryophylli ATCC 25418T 19HDN6 DQ991271 B caryophylli ATCC 25418T 18HDN6 DQ991272 Burkholderia sp A6.2

20HDN7 DQ991273 Burkholderiasp A6.2 22HDN8 DQ991274 B caryophylli ATCC 25418T 23HDN9 DQ991275 B graminis C4D1MT

25HDN4 DQ991277

Beta proteobacteria

B kururiensis KP23T

17HDN5 DQ991270 Gammaproteobacterium Ellin5264 36HDN1 DQ991288 VK vùng rễ nho wr0008 không nuôi cấy 39HDN2 DQ991290 VK đất 7-03 đề kháng với Arsenic 7-03 40HDN2 DQ991291 Gamma proteobacteriumMN 154.3 42HDN3 DQ991293 VK vùng rễ nho wr0008 không nuôi cấy 48HDN5 DQ991297

Gamma

proteobacteria

(11)

3.1.2 Đa dạng vi nấm xác định kỹ thuật PCR-SSCP

HDN1 HDN2 HDN3 HDN4 HDN5 HDN6 HDN7 HDN8 HDN9

Hình 3.2. Điện di đồ SSCP phân tích đa dạng quần xã vi nấm mẫu đất nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin

Bảng 3.2. Quan hệ dòng từ gel SSCP vi nấm đại diện

Dßng M· sè

GenBank

NÊm gÇn gịi nhÊt

1HDN2 DQ986919 Capnobotryella renispora UAMH 9870 5HDN7 DQ986920 Anguillospora furtiva CCM F-20483 6HDN7 DQ986921 Anguillospora furtiva CCM F-20483 7HDN2 DQ986922 Cladosporium staurophorum STE-U 3687

8HDN9 DQ986923 C taurophorum STE-U 3687, Cudoniella clavus BM18#13, 9HDN3 DQ986924 Dòng eukaryote RT3n2 không nuôi cÊy

10HDN7 DQ986925 Phacidium coniferarum CBS320.53 11HDN1 DQ986926 Setosphaeria monoceras CBS 154.26 12HDN8 DQ986927 Aspergillus fumigatus ALI 57

13HDN1 DQ986928 Talaromyces leycettanus CBS 398.68 14HDN3 DQ986929 Penicillium commune IBT 15141 15HDN2 DQ986930 Hymenoscyphus ericae UAMH 8873 16HDN6 DQ986931 Phacidium coniferarum CBS320.53 17HDN2 DQ986932 Exophiala sp NH3-6

18HDN7 DQ986933 Phacidium coniferarum CBS320.53 19HDN9 DQ986934 Tetrachaetum elegans 30-426 20HDN3 DQ986935 Nectria lugdunensis CBE98

21HDN4 DQ986936 Cordyceps sinensis RE2-4-3, N lugdunensis CBE98 22HDN6 DQ986937 Fusarium oxysporum 26-1, N lugdunensis CBE98 23HDN2 DQ986938 Coniochaeta ligniaria C8

24HDN3 DQ986939 Ophiostomatales sp C6, Coniochaeta ligniaria C8 25HDN9 DQ986940 Ophiostomatales sp C6

26HDN7 DQ986941 Phacidium coniferarum CBS320.53 27HDN9 DQ986942 Togninia minima CBS213.31

36HDN5 DQ986943 Lewia infectoria IMI 303186 44HDN5 DQ986944 Phacidium coniferarum CBS320.53

(12)

Các mẫu HDN4, HDN5, HDN6 HDN8 nằm gần khu vực bãi nhiễm có nồng độ chất độc hóa học cao mẫu tình trạng khơ nên có đa dạng vi nấm thấp (hình 3.2) Các chi nấm trội mẫu đất nhiễm gồm Penicillium, Aspergillus, Fusarium, Cladosporium,

Coniochaeta, Phacidium, Anguillospora, Nectria, Tetrachaetum (bảng 3.2) Các chất diệt cỏ thuốc trừ sâu có ảnh h−ởng đến quần xã vi nấm Đa dạng loài nấm giảm sau 10 năm quan sát đất nhiễm chất da cam kho chứa Mississippi (Mỹ) loài nấm phổ biến thuộc chi Penicillium, Mucor Fusarium (Young, 2006)

Các nghiên cứu tr−ớc phân lập đ−ợc vi nấm sử dụng chất độc từ đất nhiễm sân bay Đà Nẵng chủ yếu thuộc chi Aspergillus (Hoàng Thị Mỹ Hạnh đtg, 2004, Đặng Thị Cẩm Hà đtg, 2005)

3.1.3 Đa dạng gen tfdA m hóa enzym phân hñy 2,4-D

Bảng 3.3. Xác định số l−ợng đoạn gen tfdA đất nhiễm chất độc hóa học

HDN1 HDN2 HDN3 HDN4 HDN5 HDN6 HDN7 HDN8 HDN9

3,67 x 105

1,31 x 105 1,11 x 105 1,06 x 105 5,78 x 105 5,99 x 106 2,85 x 105 5,27 x 105 5,99 x 106

tauD-(0157:H7, BA000007)

0.05 tfdA-(S1.2, AY554195) 17HDN5 18HDN4 19HDN7 11HDN4 12HDN5 13HDN6 14HDN7 10HDN1

tfdA-(JMP134 pJP4, NC_005912) 1HDN7 3HDN1 4HDN2 6HDN5 21HDN2 24HDN9 20HDN1 tf dA cl as s I 26DHN2 25HDN1 30HDN9 27HDN3 28HDN5

tfdA-(RASC, U25717) tfd

A class I I tfdA-(CS1, AF181982) tfdA-(CS2, AF182758) tfdA-(P230, AF176240) tfdA-(TV1, U65531) tfdA-(P4a, AF377325) tfdA-(B1.13, AY554185) tfdA-(ESZ 4002, U32188) tfdA-(2A pIJB1, AF029344)

tf dA cl as s I II

tfdAα-(BTH, AB074493) tfdAα-(HW12, AB074491) tfdAα-(HW13, AB074492) 39HDN3

38HDN2

tf

dA

α

tauD-(0157:H7, BA000007)

0.05 tfdA-(S1.2, AY554195) 17HDN5 18HDN4 19HDN7 11HDN4 12HDN5 13HDN6 14HDN7 10HDN1

tfdA-(JMP134 pJP4, NC_005912) 1HDN7 3HDN1 4HDN2 6HDN5 21HDN2 24HDN9 20HDN1 tf dA cl as s I tfdA-(S1.2, AY554195) 17HDN5 18HDN4 19HDN7 11HDN4 12HDN5 13HDN6 14HDN7 10HDN1

tfdA-(JMP134 pJP4, NC_005912) 1HDN7 3HDN1 4HDN2 6HDN5 21HDN2 24HDN9 20HDN1 tf dA cl as s I tf dA cl as s I 26DHN2 25HDN1 30HDN9 27HDN3 28HDN5

A class I I 26DHN2 25HDN1 30HDN9 27HDN3 28HDN5

A class I I tfd A class I I tfdA-(CS1, AF181982) tfdA-(CS2, AF182758) tfdA-(P230, AF176240) tfdA-(TV1, U65531) tfdA-(P4a, AF377325) tfdA-(B1.13, AY554185) tfdA-(ESZ 4002, U32188) tfdA-(2A pIJB1, AF029344)

tf dA cl as s I II tfdA-(CS1, AF181982) tfdA-(CS2, AF182758) tfdA-(P230, AF176240) tfdA-(TV1, U65531) tfdA-(P4a, AF377325) tfdA-(B1.13, AY554185) tfdA-(ESZ 4002, U32188) tfdA-(2A pIJB1, AF029344)

tf dA cl as s I II tf dA cl as s I II

tfdAα-(BTH, AB074493) tfdAα-(HW12, AB074491) tfdAα-(HW13, AB074492) 39HDN3

38HDN2

tf

dA

α

tfdAα-(BTH, AB074493) tfdAα-(HW12, AB074491) tfdAα-(HW13, AB074492) 39HDN3 38HDN2 tf dA α tf dA α

H×nh 3.3. Phân tích đa dạng đoạn gen

tfdA đất

(13)

Số l−ợng đoạn gen tfdA g đất nhiễm từ 1,06 x 105 đến 5,99 x 106 số l−ợng cao 5,99 x 106 mẫu HDN6 HDN9 (bảng 3.3) de Lipthay đtg (2001) sử dụng kỹ thuật MPN-PCR t−ơng tự thấy rằng, số l−ợng gen tfdA đạt 102/ml n−ớc sau có bổ sung 2,4-D Các đoạn gen tfdA lớp I II chiếm −u gen tfdAα chiếm tỷ lệ nhỏ đất nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin (hình 3.3) Kết phù hợp với đa dạng vi khuẩn mẫu đất nhiễm chất độc hóa học

3.2 Đa dạng vi khuẩn mẫu bùn hồ 3.2.1 Đa dạng vi khuẩn kỵ khí tùy tiƯn

C¸c mÉu bïn hå A cã mức đa dạng vi khuẩn lớn so với hai hồ B C Trình tự số băng DNA mẫu bùn hồ có quan hệ gần gũi với nhiều dòng vi khuẩn không nuôi cấy nhãm

Alphaproteobacteria, Chlorobi, Chloroflexi, Sulfuricurvum, Fusobacteria

và Nitrospiraceae (hình 3.4) Ngồi ra, số dịng khác có t−ơng đồng cao với dòng vi khuẩn ch−a đ−ợc xỏc nh

3.2.2 Đa dạng vi khuẩn khử loại clo Dehalococcoides

A6a A1m A7m

Sulfuricurvum kujienseYK-1

A9l

100

A5d

Uncultured Fusobacteria clone GalB35

B2s B2q

Uncultured bacterium clone Amb_16S_854 16S

A3l B2b A3f

Uncultured bacterium clone ODP1227B19.11

A2v A8t

Uncultured Chlorobiclone Sh765B-AG-111 Uncultured bacterium clone KM35B-318

A1c

Uncultured bacterium clone MD2896-3m.37

83

100

63 84

Uncultured α-proteobacteriumclone ADK-SGh02-7

0.05

A6a A1m A7m

Sulfuricurvum kujienseYK-1

A9l

100

A5d

Uncultured Fusobacteria clone GalB35

B2s B2q

Uncultured bacterium clone Amb_16S_854 16S

A3l B2b A3f

Uncultured bacterium clone ODP1227B19.11

A2v A8t

Uncultured Chlorobiclone Sh765B-AG-111 Uncultured bacterium clone KM35B-318

A1c

Uncultured bacterium clone MD2896-3m.37

83

100

63 84

Uncultured α-proteobacteriumclone ADK-SGh02-7

0.05

Hình 3.4. Phân tích đa dạng vi khuẩn mẫu bùn hồ khu vực nhiễm CĐHH kỹ thuËt DGGE M-thang DNA Smart 200 bp

(14)

A1 A2 A3 A4 A5 M A6 A7 A8 A9 A10 M B1 B2 C1

Hệ

số

Hình 3.5. Điểm phân tử đoạn gen mÃ hãa 16S rRNA vi khuÈn

Dehalococcoides trªn gel DGGE vµ quan hƯ di trun nhãm vi khn

Dehalococcoides mẫu bùn hồ khu vực nhiễm chất độc hóa học Các vi khuẩn Dehalococcoides đ−ợc tìm thấy mẫu trầm tích nhiễm dioxin Tuy nhiên, vi khuẩn Dehalococcoides đ−ợc phân lập Các mẫu bùn hồ A có đa dạng vi khuẩn khử loại clo lớn so với hai hồ B C (hình 3.5) Kết phù hợp với kết mục 3.2.1 Hệ số t−ơng đồng di truyền nhóm vi khuẩn Dehalococcoides mẫu bùn từ 28 đến 87,5%

3.3 Biến động cấu trúc quần xã vi khuẩn thử nghiệm khử độc đất nhiễm chất độc hóa học

3.3.1 Xác định cấu trúc quần xã vi khuẩn công thức 0,5DN bằng kỹ thuật SSCP

Cơng thức 0,5DN4 0,5DN5 có độ đa dạng thấp cơng thức khác (hình 3.6) Hai cơng thức 0,5DN2 0,5DN3 có tỷ lệ cân đối nguồn carbon khác nên có lẽ thúc đẩy sinh tr−ởng nhiều nhóm vi sinh vật Thơng qua nuôi cấy, phân lập đ−ợc loại vi khuẩn (Đặng Thị Cẩm Hà đtg, 2005) Trên gel SSCP, s lng bng DNA

nhiều vi khuÈn thuéc líp gåm Alphaproteobacteria,

Betaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Clostridia, Actinobacteria,

(15)

1-1 1-2 1-3 2-1 2-2 2-3 3-1 3-2 3-3 4-1 4-2 4-3 5-1 5-2 5-3

Sphingomonassp KA1

45-0,5DN5-2Pseudomonas citronellolisDSM 50332

T

Pseudomonas aeruginosaLMG 1242T

83-0,5DN4-3 79-0,5DN1-350-0,5DN1-2

63-0,5DN3-1 54-0,5DN3-2 55-0,5DN3-2

Pseudomonas stutzeriDSM 5190T

61-0,5DN1-1

Pseudomonas putidaATCC 17390

65-0,5DN3-2 68-0,5DN2-1

115-0,5DN4-3

114-0,5DN4-3γ-proteobacteriumPI_GH1.1.A2

Frateuriasp WJ69

76-0,5DN5-2Escherichia coli5.4

Citrobacter sedlakii10-0,5DN3-1 CDC 4696-86 11-0,5DN4-1

16-0,5DN1-3 19-0,5DN1-1 18-0,5DN3-3

Salmonella enterica Typhimurium 65946 67-0,5DN1-1aquatic bacterium STS_EndoC_05

71-0,5DN1-2 74-0,5DN3-2

uncultured gamma proteobacterium clone UN92

γ -p rot eo b a ct er ia 3-0,5DN3-1

8-0,5DN2-3 Delftiasp AN3

1-0,5DN5-1Comamonas denitrificansP17 5-0,5DN1-2

23-0,5DN5-315-0,5DN5-2

Pandoraea pulmonicolaCCUG 38759

Burkholderia vietnamensisAMMD

22-0,5DN4-3

Burkholderiasp SILP5

35-0,5DN5-2 Alcaligenes xylosoxidansA1 20-0,5DN4-1126-0,5DN4-3

82-0,5DN3-369-0,5DN3-1 31-0,5DN2-2 25-0,5DN3-1

Alcaligenes defragrans24-0,5DN2-1 TG26 34-0,5DN4-237-0,5DN2-3

21-0,5DN3-3

Alcaligenessp Ho-11 26-0,5DN4-1 94-0,5DN1-2 121-0,5DN1-1

Dysgonomonas shahii100-0,5DN3-2 CCUG 4357 112-0,5DN3-3

86-0,5DN2-1Uncultured bacterium clone BC15.1.26

β -p ro te ob act er ia ct ero id es

87-0 5DN2-1Clostridium sp PO

88-0,5DN2-1Lactobacillus plantarumRO7 122-0,5DN1-1

Clostridium populetiATCC 35295

48-0,5DN4-1 Rhodococcussp YK2 64-0,5DN5-1

Rhodococcus zopfiiDSM 44108

70-0,5DN5-1

Rhodococcus opacusSAO101

Corynebacterium acetoacidophilumCIP 103773

84-0,5DN1-1

Acidocellasp GS19h 105-0,5DN5-2

Acidocellasp St1-2 116-0,5DN5-3

Acetobacter acetiuncultured eubacterium WD236ZIMB 043 42-0,5DN5-3

36-0,5DN5-2

Sphingomonas sp oral clone FI012 27-0,5DN5-1 0.02 α -pr ot eob ac te ri a A ctin o -ba ct er ia Clostridia Clostridia Bacilli

T

83-0,5DN4-3 79-0,5DN1-350-0,5DN1-2

63-0,5DN3-1 54-0,5DN3-2 55-0,5DN3-2

61-0,5DN1-1

65-0,5DN3-2 68-0,5DN2-1

115-0,5DN4-3

Frateuriasp WJ69

16-0,5DN1-3 19-0,5DN1-1 18-0,5DN3-3

71-0,5DN1-2 74-0,5DN3-2

γ -p rot eo b a ct er ia

T

83-0,5DN4-3 79-0,5DN1-350-0,5DN1-2

63-0,5DN3-1 54-0,5DN3-2 55-0,5DN3-2

61-0,5DN1-1

65-0,5DN3-2 68-0,5DN2-1

115-0,5DN4-3

Frateuriasp WJ69

16-0,5DN1-3 19-0,5DN1-1 18-0,5DN3-3

71-0,5DN1-2 74-0,5DN3-2

γ -p rot eo b a ct er ia 3-0,5DN3-1

23-0,5DN5-315-0,5DN5-2

22-0,5DN4-3

82-0,5DN3-369-0,5DN3-1 31-0,5DN2-2 25-0,5DN3-1

21-0,5DN3-3

β -p ro te ob act er ia ct ero id es 3-0,5DN3-1

23-0,5DN5-315-0,5DN5-2

22-0,5DN4-3

82-0,5DN3-369-0,5DN3-1 31-0,5DN2-2 25-0,5DN3-1

21-0,5DN3-3

β -p ro te ob act er ia ct ero id es

70-0,5DN5-1

84-0,5DN1-1

36-0,5DN5-2

Sphingomonas sp oral clone FI012 27-0,5DN5-1 0.02 α -pr ot eob ac te ri a A ctin o -ba ct er ia Clostridia Clostridia Bacilli

70-0,5DN5-1

84-0,5DN1-1

36-0,5DN5-2

Sphingomonas sp oral clone FI012 27-0,5DN5-1 0.02 0.02 α -pr ot eob ac te ri a A ctin o -ba ct er ia Clostridia Clostridia Bacilli

Hình 3.6. Phân tích đa dạng vi

khuẩn công thức 0,5DN kỹ thuật SSCP phát sinh lồi dịng tách từ gel SSCP chủng vi khuẩn đại

diện 1-1, 1-2 đến 5-3, t−ơng ứng

với ba đợt lấy mẫu

3.3.2 Cấu trúc quần xã vi khuẩn công thức 1,5DN xác định bằng kỹ thuật SSCP

Các công thức 1,5DN4 1,5DN5 có độ đa dạng vi khuẩn thấp Cơng thức 1,5DN1 có độ đa dạng vi khuẩn lớn nhất, mẫu đất công thức xử lý đ−ợc lấy mép bãi nhiễm có nồng độ chất ô nhiễm thấp mẫu bãi Mẫu 1,5DN5 đ−ợc xác định có mức nhiễm độc cao Thông qua nuôi cấy phân lập đ−ợc loại vi khuẩn thật loại xạ khuẩn công thức 1,5DN (Đặng Thị Cẩm Hà đtg, 2008) Tuy nhiên, số l−ợng băng DNA nhiều hẳn gel SSCP thuộc lớp vi khuẩn

Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, Gammaproteobacteria,

Deltaproteobacteria, Acidobacteria, Bacteroides, Sphingobacteria vµ

(16)

1-1 1-2 1-3 2-1 2-2 2-3 3-1 3-2 3-3 4-1 4-2 4-3 5-1 5-2 5-3

0.02

Comamonassp MBIC 3885

54-1,5D1-3 132-1,5D1-367-1,5D5-1

68-1,5D2-2Alcaligenessp 151 Denitrobacter permanens 73-1,5D5-1

77-1,5D5-2 83-1,5D3-280-1,5D5-3 139-1,5D5-3138-1,5D5-3

Paucimonas lemoigneiLMG 2207T

86-1,5D4-3B caryophylliATCC 25418

T

Burkholderiasp MN182.2

69-1,5D5-3

β-proteobacteria

Frateuria aurantiaIFO13333

118-1,5D5-291-1,5D2-1

122-1,5D3-3Pseudomonas stutzeriDSM 5190

T

94-1,5D5-1Pseudomonassp P400Y-1 123-1,5D4-3111-1,5D3-3

Pseudomonassp XLDN4-9

104-1,5D1-381-1,5D1-1 E coli

γ-proteobacteria

Bdellovibrio bacteriovorus119-1,5D1-3 BRP4

Trichlorobacter thiogenesATCC BAA-34

135-1,5D3-3

δ-proteobacteria

Bacillus cohniiML-A10

60-1,5D1-1Bacillus badius TUT1006 55-1,5D1-2Bacillus sp 171544 58-1,5D1-2

Bacilli

136-1,5D5-3

137-1,5D5-3Sphingomonassp S-2 α-proteobacteria

Unknown Actinomycete MC27 102-1,5D5-3

Acidobacterium capsulatum161

Acidobacteria

Dysgomonas shahiiCCUG43457

117-1,5D2-2 61-1,5D3-1Bacteroidessp 22C

57-1,5D3-1 106-1,5D2-1113-1,5D1-1

114-1,5D4-1 126-1,5D1-1 128-1,5D4-1

Uncultured Flexibactersp clone TSL-25 127-1,5D1-1 65-1,5D1-1 Bacteroides Sphingobacteria 0.02 0.02

54-1,5D1-3 132-1,5D1-367-1,5D5-1

77-1,5D5-2 83-1,5D3-280-1,5D5-3 139-1,5D5-3138-1,5D5-3

T

69-1,5D5-3

β-proteobacteria

54-1,5D1-3 132-1,5D1-367-1,5D5-1

77-1,5D5-2 83-1,5D3-280-1,5D5-3 139-1,5D5-3138-1,5D5-3

T

69-1,5D5-3

β-proteobacteria

118-1,5D5-291-1,5D2-1

T

104-1,5D1-381-1,5D1-1 E coli

γ-proteobacteria

118-1,5D5-291-1,5D2-1

T

104-1,5D1-381-1,5D1-1 E coli

γ-proteobacteria

135-1,5D3-3

δ-proteobacteria

135-1,5D3-3

δ-proteobacteria

Bacilli

136-1,5D5-3

137-1,5D5-3Sphingomonassp S-2 α-proteobacteria 136-1,5D5-3

137-1,5D5-3Sphingomonassp S-2 α-proteobacteria

Unknown Actinomycete MC27 102-1,5D5-3

Acidobacteria Unknown Actinomycete MC27

102-1,5D5-3

Acidobacteria

57-1,5D3-1 106-1,5D2-1113-1,5D1-1

114-1,5D4-1 126-1,5D1-1 128-1,5D4-1

Uncultured Flexibactersp clone TSL-25 127-1,5D1-1

65-1,5D1-1

Bacteroides Sphingobacteria

57-1,5D3-1 106-1,5D2-1113-1,5D1-1

114-1,5D4-1 126-1,5D1-1 128-1,5D4-1

Uncultured Flexibactersp clone TSL-25 127-1,5D1-1

65-1,5D1-1

Bacteroides Sphingobacteria

Hình 3.7. Phân tích đa d¹ng vi

khuẩn cơng thức 1,5DN tẩy độc đất nhiễm CĐHH kỹ thuật SSCP phát sinh lồi dịng tách từ gel SSCP chủng vi khuẩn đại diện 1-1, 1-2

đến 5-3, t−ơng ứng với ba đợt lấy

mÉu

3.3.3 Cấu trúc quần xã vi khuẩn công thức 0,5DN 1,5DN xác định kỹ thuật DGGE

(17)

Actinobacteria, Acidobacteria, Bacteroides vi khuẩn ch−a xác định vị

trÝ phân loại (hình 3.8) Vi khuẩn a axít, vi khuẩn líp

Alphaproteobacteria, Acidobacteria vi khuẩn chiếm −u Trong công thức xử lý thấy chi vi khuẩn Burkholderia, Alcaligenes

Comamonas thuộc họ Burkholderiaceae Ngồi ra, phát dịng t−ơng đồng cao với vi khuẩn Corynebacterium và Chlorobi Nh− vậy, kỹ thuật SSCP DGGE sử dụng cặp mồi thu đ−ợc số kết đa dạng vi khuẩn t−ơng tự

I II III IV V M VI VII VIII IX X M

Frateuriasp EC-K130 100

100

38-0,5DN5-4 75

Spirochaetessp SA-8

Uncultured bacterium clone S41 Uncultured Chlorobibacterium clone LC3-28

Burkholderia vietnamiensisTVV75T

20-0,5DN2-415-0,5DN4-4

Pandoraea pulmonicolaLMG 18106 99

96 24-0,5DN3-4

Burkholderiasp JS150

89

100 12-1,5DN4-4

Castellaniella denitrificansNKNTAU 9-0,5DN3-4Alcaligenessp Ho-11

63 61

83 100

26-0,5DN4-4

Comamonas testosteroniATCC 11996T

90 100 97 72 0,02 B etap rot eo bac te ria

Fulvimonas soliLMG 19981T

33-0,5DN1-439-1,5DN4-4

Uncultured bacterium clone KD8-80 90

100 96

14-1,5DN5-413-0,5DN4-4

Salinisphaerasp ARD M17 100

30-1,5DN1-4Gamma proteobacteriaMN 154,3 100

100 17-1,5DN2-4

Uncultured proteobacterium clone EV221H2111601SAH20 91 G am m ap rot eob ac te ria

Acidisphaerasp NO-15 37-0,5DN5-4

Rhodopila globiformisDSM 161 36-0,5DN5-418-0,5DN5-4

Acidiphilium cryptumATCC 33463 10-0,5DN5-4 100 61 100 A lph ap ro te oba cte ria

8-1,5DN4-4Uncultured BateroidalesKF-Gitt2-47 bacterium 4-0,5DN3-4

Dysgonomonas mossiiCCUG 43457T

98 100

100 Bacteroides

5-1,5DN3-4

Uncultured bacterium clone 1-2A 100

100 Unclassified bacteria

35-0,5DN5-4

100 Acidobacteria

23-1,5DN2-4

Corynebacterim glutamicumNCIMB 10025 100

75 Actinobacteria

32-1,5DN3-4 Unclassified bacteria

Frateuriasp EC-K130 100

100

38-0,5DN5-4 75

Spirochaetessp SA-8

Uncultured bacterium clone S41 Uncultured Chlorobibacterium clone LC3-28

20-0,5DN2-415-0,5DN4-4

96 24-0,5DN3-4

89

100 12-1,5DN4-4

63 61

83 100

26-0,5DN4-4

90 100 97 72 0,02 B etap rot eo bac te ria

20-0,5DN2-415-0,5DN4-4

96 24-0,5DN3-4

89

100 12-1,5DN4-4

63 61

83 100

26-0,5DN4-4

90 100 97 72 0,02 0,02 B etap rot eo bac te ria

33-0,5DN1-439-1,5DN4-4

100 96

14-1,5DN5-413-0,5DN4-4

100 17-1,5DN2-4

33-0,5DN1-439-1,5DN4-4

100 96

14-1,5DN5-413-0,5DN4-4

100 17-1,5DN2-4

98 100

100 Bacteroides

98 100

100 Bacteroides

5-1,5DN3-4

35-0,5DN5-4

100 Acidobacteria

35-0,5DN5-4

100 Acidobacteria

23-1,5DN2-4

75 23-1,5DN2-4 Actinobacteria

75 Actinobacteria

32-1,5DN3-4 Unclassified bacteria 32-1,5DN3-4 Unclassified bacteria

(18)

3.3.4 Biến động cấu trúc quần x∙ vi khuẩn thử nghiệm chơn lấp tích cực qui mơ 10 m3 100 m3

Acinetobacter22-10DNT-2sp LUH4616

24-100DNT-2

Enterobacter sakazakiiJCM1233

100

14-10DNT-2 98

P citronellolisTERIDB3

Pseudomonassp YG-1

53-10DNT-3 100

58-100DNT-3 36-100DNT-1 54-10DNT-359-100DNT-3

55-10DNT-3Azotobacter beijerinckiiICMP 8673

74

92

75

P resinovoransCA06

1-10DNT-346-100DNT-2 Pseudomonas43-10DNT-1sp K50

44-10DNT-1P stutzeriDSM 10701 100

P stutzeriMW56

P stutzeri24a13

98

87

P stutzeriP stutzeriDSM 50238A15 28-100DNT3 32-10DNT-3 39-100DNT-3 35-100DNT-1 33-10DNT-3 96 96 79 100 100 99 100 γ -prot eo b act eria 62-10DNT-1 5-10DNT-2

6-10DNT-3B benzoevorans NCIMB 12555 8-10DNT-3

10-10DNT-3

11-100DNT-3Bacillus solfatarensisSol1 100 75 87 0.02 Bacil li 70-100DNT-1 Flavobacterium ferrugineum ATCC 13524 67-100DNT-1

Flavobacterium-like sp oral clone

77-100DNT-1 76-100DNT-1 100 100 Flavo-bacteria Sphingo-bacteria 65-10DNT-2 100 63-10DNT-1 75-10DNT-1

Sedimentibacter saalensisZF2

68-10DNT-1 74-10DNT-1

Clostridium sp LTR1

78-10DNT-1

72-10DNT-1Soehngenia saccharolyticaBOR-Y 79-10DNT-1

93

Clostridiumsp BN II

100

97 100

18-10DNT-1

Alcaligenes faecalis5659-H

100 100 C lo st rid ia β -proteo-bacteria

24-100DNT-2

100

14-10DNT-2 98

53-10DNT-3 100

58-100DNT-3 36-100DNT-1 54-10DNT-359-100DNT-3

74

92

75

P stutzeriMW56

P stutzeri24a13

98

87

P stutzeriP stutzeriDSM 50238A15 28-100DNT3 32-10DNT-3 39-100DNT-3 35-100DNT-1 33-10DNT-3 96 96 79 100 100 99 100 γ -prot eo b act eria

24-100DNT-2

100

14-10DNT-2 98

53-10DNT-3 100

58-100DNT-3 36-100DNT-1 54-10DNT-359-100DNT-3

74

92

75

P stutzeriMW56

P stutzeri24a13

98

87

P stutzeriP stutzeriDSM 50238A15 28-100DNT3 32-10DNT-3 39-100DNT-3 35-100DNT-1 33-10DNT-3 96 96 79 100 100 99 100 γ -prot eo b act eria 62-10DNT-1 5-10DNT-2

10-10DNT-3

11-100DNT-3Bacillus solfatarensisSol1 100 75 87 0.02 Bacil li 62-10DNT-1 5-10DNT-2

10-10DNT-3

11-100DNT-3Bacillus solfatarensisSol1 100 75 87 0.02 0.02 Bacil li 70-100DNT-1 Flavobacterium ferrugineum ATCC 13524 67-100DNT-1

77-100DNT-1 76-100DNT-1 100 100 Flavo-bacteria Sphingo-bacteria 70-100DNT-1 Flavobacterium ferrugineum ATCC 13524 67-100DNT-1

77-100DNT-1 76-100DNT-1 100 100 Flavo-bacteria Sphingo-bacteria 65-10DNT-2 100 63-10DNT-1 75-10DNT-1

68-10DNT-1 74-10DNT-1

78-10DNT-1

93

100

97 100

18-10DNT-1

100 100 C lo st rid ia β -proteo-bacteria 65-10DNT-2 100 63-10DNT-1 75-10DNT-1

68-10DNT-1 74-10DNT-1

78-10DNT-1

93

100

97 100

18-10DNT-1

100 100 C lo st rid ia β -proteo-bacteria M 1-1 1-2 1-3 M 2-1 2-2 2-3 M

H×nh 3.9. Phân tích đa dạng vi khuẩn phát sinh chủng loài dòng tách từ gel SSCP 1-1, 1-2 1-3 tơng ứng mẫu 10DNT-1, 10DNT-2 10DNT-3 2-1, 2-2 2-3 tơng ứng mẫu 100DNT-1, 100DNT-2 vµ 100DNT-3 M-thang DNA chuÈn X (Roche)

Mức đa dạng vi khuẩn cao lần lấy mẫu hai qui mô xử lý Số l−ợng băng DNA gel SSCP cao so với chủng vi khuẩn đ−ợc phân lập (Đặng Thị Cẩm Hà đtg, 2005) Trình

tự 37 băng DNA đ−ợc xác định thuộc lớp vi khuẩn

Betaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Bacilli, Clostridia,

Sphingobacteria và Flavobacteria (hình 3.9) Nhóm vi khuẩn kÞ khÝ

(19)

chiếm −u đất nhiễm chất độc hóa học cơng thức 0,5DN 1,5DN Tuy nhiên, mẫu 10DNT 100DNT, nhóm vi khuẩn đại diện phần nhỏ quần xã vi khuẩn (hình 3.9) chiếm −u giai đoạn đầu “chôn lấp tích cực” Vi khuẩn

Pseudomonas lµ nhãm lín nhÊt quần xÃ vi khuẩn hai công thức 10DNT 100DNT số dòng gần gũi với loài P stutzeri

có khả phân hủy carbazol dioxin

3.3.5 Quần x vi khuẩn Dehalococcoides công thức xử lý

4-10DNT 2-10DNT

3-10DNT 5-10DNT 6-10DNT

Dehalococcoidessp TM-EtOH

1-10DNT

Dehalococcoidessp BHI80-15

Dehalococcoides ethenogenes195

Uncultured Dehalococcoidesclone DHC-kb1

Dehalococcoidessp WL

Dehalococcoidessp JN18_A96_B

Dehalococcoidessp CBDB1

Dehalococcoidessp FL2

Dehalococcoidessp H10

Hình 3.10. Phân tích quần xã vi khuẩn Dehalococcoides mẫu 10DNT quan hệ dòng tách từ gel DGGE với vi khuẩn đại diện

DNA tổng số mẫu đất (1,5DN1-1,5DN5; 0,5DN3; 0,5DN5, 10DNT 100DNT) đợt lấy mẫu thứ đ−ợc sử dụng để nhân đoạn 16S rDNA vi khuẩn Dehalococcoides Tuy nhiên, mẫu 10DNT thu đ−ợc sản phẩm PCR, điều kiện kỵ khí tốt công thức xử lý khác Sáu băng DNA mẫu 10DNT (hình 3.10) t−ơng đồng từ 98% đến 99% với hai chủng vi khuẩn Dehalococcoides (195 CBDB1) có khả khử loại clo dioxin/dibenzofuran

M 10DNT M

0.01

4-10DNT 2-10DNT

3-10DNT 5-10DNT 6-10DNT

1-10DNT

4-10DNT 2-10DNT

3-10DNT 5-10DNT 6-10DNT

1-10DNT

4-10DNT 2-10DNT

3-10DNT 5-10DNT 6-10DNT

1-10DNT

lococcoidessp JN18_A30_B

Deha

lococcoidessp JN18_A30_B

Deha

(20)

3.4 Đặc điểm sinh học số chủng vi khuẩn phân lập từ đất bùn nhiễm chất độc hóa học

3.4.1 Phân lập xác định khả phân hủy dioxin hợp chất t−ơng tự ba chủng vi khuẩn

Các PCDD/F dioxin đặc biệt 2,3,7,8-TCDD đánh dấu phóng xạ đ−ợc sử dụng phịng thí nghiệm đặc biệt nên DBF DD hai chất mơ hình đ−ợc sử dụng để nghiên cứu Hai chủng vi khuẩn HDN3 DMA đ−ợc phân lập từ mẫu đất hỗn hợp từ bãi nhiễm chủng vi khuẩn Ao3 đ−ợc phân lập từ bùn hồ A (khu vc mu A1-A3)

3.4.1.1 Định loại chñng vi khuÈn Ao3

P subsp larvae DSM7030 (AB073205)

Bacillus ehimensis IFO15659

P koreensis KCTC2393

B.viscosus ATCC 51155

100

P elgii SD17 (AY090110)

95

P validus ATCC29948 (X60617)

P validus JCM9077 (AB073203)

Paenibacillus sp HM1 (AY283261)

Paenibacillus sp Ao3 (EF208754)

Paenibacillus sp YK5 (AB091334)

P naphthalenovorans DSM3AF353681)

91 100 100 100 92

Thermobacillus xylanilyticus XET (AJ005795)

0.01

Terr abac

ter sp Y

K3 (AB0 7045 9) Terrab acter

sp DM A (EF065 608) J lim osus DSM 11140 T (Y08 539) Jani bac ter sp Y

Y-1

(AB 0894

80)

J terr aeJC

M 10 705

T (AF1

76948) J brevisDSM 13953T (AJ310085)

Terra bacter sp.D BF63 (AB00456 4) Terr abac ter

sp Y K1

(AB 0704

57)

Tetrasphaera japonica

ACM 5116T

(AF125092)

Terrabacter tumescens

DSM 20308T

(X83812)

Terracoccu s luteus

DSM 44267T (Y11928) 0.005 Terr abac ter sp Y

K3 (AB0 7045 9) Terrab acter

sp DM A (EF065 608) J lim osus DSM 11140 T (Y08 539) Terr abac ter sp Y

K3 (AB0 7045 9) Terrab acter

sp DM A (EF065 608) J lim osus DSM 11140 T (Y08 539) Jani bac ter sp Y

Y-1

(AB 0894

80)

J terr aeJC

M 10 705

T (AF1

76948) J brevisDSM 13953T (AJ310085)

sp Y K1 (AB 0704 57) Jani bac ter sp Y

Y-1

(AB 0894

80)

J terr aeJC

M 10 705

T (AF1

76948) J brevisDSM 13953T (AJ310085)

sp Y K1

(AB 0704

57)

ACM 5116T

(AF125092)

DSM 20308T

(X83812)

DSM 44267T

(Y11928)

0.005

ACM 5116T

(AF125092)

DSM 20308T

(X83812)

DSM 44267T (Y11928) 0.005 0.005 A B

Hình 3.11. Cây phát sinh chủng loại chủng Ao3 (A) DMA (B) chủng vi khuẩn đại diện dựa so sánh gen mã hóa 16S rRNA

Chủng Ao3 có tế bào hình que, kÝch th−íc 0,53 - 0,6 μm x 1,67 - 2,8

μm) Trình tự đoạn gen 16S rRNA chủng Ao3 t−ơng đồng 96% với chủng thuộc chi Paenibacillus nh− HM1, JCM9077 YK5 (hình 3.11A) Dựa đặc điểm hình thái trình tự đoạn gen 16S rRNA, chủng Ao3 thuộc chi Paenibacillus đ−ợc đặt tên Paenibacillus sp Ao3

3.4.1.2 Định loại chủng vi khuẩn DMA

(21)

Janibacter limous DSM 11140T, 97,5% với Terrabacter sp YK7 (hình 3.11B) Vi khuẩn chi Janibacter Terrabacter có mức t−ơng đồng cao so sánh trình tự gen 16S rRNA (Lang đtg, 2003) Dựa đặc điểm hình thái trình tự đoạn gen 16S rRNA, chủng DMA đ−ợc xếp vào chi Terrabacter và có tên Terrabacter sp DMA

3.4.1.3 Định loại chủng vi khuẩn HDN3

Chủng HDN3 có tế bào hình cầu nhám, kích th−ớc 0,27-0,53 μm Trình tự đoạn gen 16S rRNA chủng HDN3 t−ơng đồng 98,4% với chủng R rhodochrous ATCC 271T 94% với chủng SAO101 Vi khuẩn

chi Rhodococcus sư dơng dioxin gåm c¸c chđng SBUG 271, SAO101,

TUT581, YK2 HA01 (Hiraishi, 2003) Dựa đặc im hỡnh thỏi v

so sánh trình tự gen 16S rRNA, chủng HDN3 đợc xếp vào chi

Rhodococcus và có tên Rhodococcus sp HDN3

R.wratislaviensis NCIMB 13082T (Z37138)

R equi ATCC 6939T(X80603)

R erythropolis DFA9 (AB180237)

R erythreus DSM 43066T(X79289)

69 100

R rhodnii ATCC 35071T (X81935)

78

R rhodochrous ATCC 271T (X81921)

R pyridinovorans PDB9T (AF173005) Rhodococcus sp HDN3 (EF065609)

83

Rhodococcus ruber DSM43338T (X80625)

100

R zopfii ATCC51934T (X81934)

R coprophilus DSM 4334T (X80626)

62

Terrabacter sp.YK-3 (AB070459)

0.01

Hình 3.12. Cây phát sinh chủng loại chủng HDN3 chủng vi khuẩn

Rhodococcus i

diện

3.4.1.4 Khả sử dụng số chất vòng thơm khác

(22)

màu vàng Sinh tr−ởng chủng Rhodococcus sp HDN3 mơi tr−ờng muối khống chứa dioxin đạt cao sau gần tuần ni cấy (hình 3.13)

0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14

0 10 12 14 16

Ngày

OD 600 nm

Hình 3.13. Khả sinh trởng chủng

Rhodococcus sp

HDN3 môi trờng muối khoáng chứa dioxin

3.4.1.5 Khả phân hủy dibenzofuran cđa chđng vi khn DMA

vµ HDN3

Sau 24 chủng HDN3 phân hủy hoàn toàn mM DBF Chủng DMA phân hủy 71,54 % 100 % l−ợng DBF sau 24 48 nuôi cấy (bảng 3.4) Chủng vi khuẩn Paenibacillus sp YK5 phân hủy hoàn toàn mM DBF sau 34 ni cấy (Iida đtg, 2006)

Thêi gian DMA HDN3

(giê) DiƯn tÝch

peak

Ph©n hđy (%)

DiƯn tÝch peak

Ph©n hđy (%)

0 1.458.824 1.777.303

24 415.127 71,54 100

48 100

3.4.1.6 Xác định trình tự đoạn gen m∙ hóa enzym dioxygenase từ ba

chđng vi khuÈn Ao3, DMA vµ HDN3

(23)

dịng PCR C89 gen ahDO mã hóa tiểu đơn vị α hydrocarbon dioxygenase chủng Paenibacillus sp YK5 (hình 3.14A) Trình tự đoạn gen nhân lên từ chủng DMA t−ơng đồng 97% với gen dbfA1 mã hoá tiểu đơn vị alpha dioxygenase góc chủng vi khuẩn Rhodococcus sp DFA3,

Terrabacter sp DBF63, Rhodococcus sp YK2 (h×nh 3.14B)

Hình 3.14. Cây phát sinh chủng loại số trình tự mã hóa tiểu đơn vị enzym alpha dioxygenase trình tự nhân lên từ chủng Ao3 (A) chủng DMA (B) sử dụng cặp mồi DIOXY-F DIOXY-R

Đoạn gen nhân lên từ chủng HDN3 t−ơng đồng cao với gen dbfA1 mã hóa tiểu đơn vị alpha dioxygenase góc chủng Terrabacter sp DBF63 (99%) chủng Rhodococcus sp YK2 (98%) (hình 3.15) Các chủng vi khuẩn Paenibacillus sp YK5, Rhodococcus sp (DFA3 YK2)

A

bphA1-R erythropolis TA421 (D88021)

dxnA1-Sphingomonaswittichii RW1 (X72850)

phdA-Nocardioides sp KP7 (AB017794)

Terrabacter sp DMA (EF200064)

dbfA1-Terrabacter sp DBF63 (AB054975)

dbfA1- Rhodococcus sp DFA3 (AB181127)

dbfA1-Rhodococcus sp YK2 (AB070456)

carAa-Pseudomonas sp CA10 (D89064)

0.05

dbfA1-Terrabactersp DBF63 (AB095015) dbfA1-Rhodococcussp DFA3(AB181127) phdA-Nocardioidessp KP7 (AB031319) dodA-Rhodococcussp SA0101 (AB110633)

ahDO-Paenibacillussp YK5 clone C89 (AB201841) Paenibacillussp Ao3(AF203474)

ahDO-Paenibacillussp YK5 clone 942 (AB201839)

dbfA1-Terrabactersp DBF63 (AB095015) dbfA1-Rhodococcussp DFA3(AB181127) phdA-Nocardioidessp KP7 (AB031319) dodA-Rhodococcussp SA0101 (AB110633)

ahDO-Paenibacillussp YK5 clone C89 (AB201841) Paenibacillussp Ao3(AF203474)

ahDO-Paenibacillussp YK5 clone 942 (AB201839)

B

Hình 3.15 Cây phát sinh chủng loại số trình tự gen mã hố tiểu đơn vị enzym alpha dioxygenase trình tự nhân lên từ chủng HDN3 sử dụng cặp mồi DIOXY-F DIOXY-R

dfdA1-Terrabactersp.YK3 (AB075242)

phdA-Nocardioidessp KP7 (AB017794)

dbfA1-Terrabactersp DMA (EF200064)

dbfA1-Rhodococcussp DFA3 (AB181127)

dbfA1-Rhodococcussp YK2 (AB070456)

dbfA-Terrabatersp DBF63 (AB054975) Rhodococcussp HDN3(EF200065)

dxnA12-Sphingomonassp RW1 (X72850)

0.05

dfdA1-Terrabactersp.YK3 (AB075242)

phdA-Nocardioidessp KP7 (AB017794)

dbfA1-Terrabactersp DMA (EF200064)

dbfA1-Rhodococcussp DFA3 (AB181127)

dbfA1-Rhodococcussp YK2 (AB070456)

dbfA-Terrabatersp DBF63 (AB054975) Rhodococcussp HDN3(EF200065)

dxnA12-Sphingomonassp RW1 (X72850)

(24)

và Terrabacter sp DBF63 đ−ợc chứng minh có khả sử dụng DBF chất t−ơng tự

3.4.2 Một số đặc điểm sinh học gen tham gia chuyển hóa chất diệt cỏ từ chủng vi khuẩn sử dụng chất diệt cỏ DBF chất tương tự

3.4.2.1 Định loại hai chủng vi khuẩn DNB19 DNB20 sử dụng 2,4-D và PAH

Hai chủng vi khuẩn DNB19 DNB20 sử dụng 2,4-D PAH thuộc s−u tập giống nhóm thực đề tài liên quan đến xử lý chất độc hóa học, Viện Cơng nghệ sinh học Khuẩn lạc chủng vi khuẩn có màu vàng chanh Chủng DNB19 tạo vòng phân giải phenanthrene, anthracene fluoranthrene chủng DNB20 có vịng phân giải phenanthrene Hai chủng giống hệt băng DNA (hình 3.16A), trình tự đoạn gen 16S rRNA với chủng Arthrobacter sp (TM4_1 TM5_1) (hình 3.16B) Nh− vậy, chủng vi khuẩn DNB19 DNB20 thuộc chi Arthrobacter có tên Arthrobacter sp DNB19

Arthrobacter sp DNB20

Arthrobacter sp DNB19 (EF073264 )

Arthrobacter sp TM4_1 (DQ279378)

Arthrobacter sp TM5_1 (DQ279377)

Arthrobacter sp DNB20 (EF065610 )

Arthrobacter sp BWDY-45 (DQ314547)

A protophormiae SSCT48 (AB210984)

A mysorens LMG 16219T (AJ639831)

0.0002

Hình 3.16. Điện di đồ sản phẩm BOX-PCR (A) phát sinh chủng loại hai chủng DNB19, DNB20 số chủng đại diện chi Arthrobacter

DNB19 DNB20

A B

3.4.2.2 Sự tồn gen tfdA vµ tftA(cadA) ë chđng DNB19

Sản phẩm PCR nhân gen cadA từ chủng DNB19 t−ơng đồng 93% với gen cadA chủng Sphingomonas sp B6-10 (hình 3.17) Các nghiên cứu tr−ớc phát gen cadAB chi vi khuẩn Sphingomonas

(25)

gen cadA chủng Arthrobacter sp DNB19 t−ơng đồng 48% với TftA chủng vi khuẩn B phenoliruptrix AC1100

Trình tự sản phẩm nhân gen tfdA từ chủng DNB19 t−ơng đồng 94% với tfdA chủng vi khuẩn Burkholderia sp RASC, Burkholderia sp Ff54 (hình 3.17)

cadA-Sphingomonas sp TFD26 (AB119242)

cadA-Arthrobacter sp DNB19 (EF375719)

cadA-Sphingomonas sp B6-10 (AB119241)

cadA-Sphingomonas sp I602 (AB212781) VK không nuôi cấy HS01 (AB088553)

tfdA-Burkholderia sp RASC (U25717)

tfdA-Burkholderia sp. Ff54 (AB212780)

tfdA-Arthrobacter sp DNB19 (EF375720)

tfdA-Delftia sp P4a (AY078159)

tfdA-VK không nuôi cấy S1.2(AY554195)

tfdAα-Bradyrhizobiumsp HW13(AB074492)

tfdA-Ralstoniasp 80 (AY238497)

0.05

cadA-Bradyrhizobium sp HW13 (AB062679)

Hình 3.17. Mối quan hệ phát sinh chủng loại

gen tfdA vµ

cadA ë chđng

Arthrobacter

sp DNB19 vi khuẩn khác

3.4.2.3 Sự tồn gen tfdA tftA(cadA) ba chđng vi khn Ao3, DMA vµ HDN3

3.4.2.3.1 Trình tự đoạn gen tfdA

Đoạn gen tfdA chủng Ao3 DMA t−ơng đồng 98% với trình tự

tfdA chủng C negator JMP134 Đoạn gen tfdA chủng HDN3 t−ơng đồng 99% với đoạn gen tfdA chủng Burkholderia sp RASC (hỡnh 3.18A)

3.4.2.3.2 Trình tự đoạn gen giống cadA

ChØ chđng Ao3 vµ DMA thu đợc sản phẩm PCR nhân đoạn gen

cadA v đ−ợc xác định trình tự Trình tự nucleotide đoạn gen giống

cadA chủng Ao3 DMA t−ơng đồng cao với đoạn gen giống cadA

(26)

khả sử dụng 2,4-D sang vi sinh vật đất bình th−ờng khác (de Lipthay đtg, 2001)

tfdA- VK đất không nuôi cấy, dòng S1.2 (AY554195) tfdA-Paenibacillus sp Ao3 (EU373723)

tfdA-Terrabacter sp DMA (EU372721)

tfdA-Ralstonia sp M10-VN2-1W (AB299627)

tfdA-VK đất khơng ni cấy, dịng 34HDN1 (EF3600743)

tfdA-Wauteria sp JMP134 pJP4 (AY36503)

68 66 100

tfdA-Burkholderia sp RASC (U25717)

tfdA-Burkholderia sp Ff54 (AB212780) tfdA-Rhodococcus sp HDN3 (EU372722)

100

tfdA -Delftia sp P4a (AY078159)

100

tfdA-Arthrobacter sp DNB19 (EF375720)

100

0.02

A

cadA-Bradyrhizobium sp HW13 (AB062679)

cadA-Sphingomonas sp B6-10 (AB119241)

cadA-Sphingomonas sp I602 (AB212781)

cadA-Arthrobacter sp DNB19 (EF375719)

100

100 98

100

cadA-Paenibacillussp Ao3 (EU372719)

cadA-like gene-VK không ni cấy, dịng HS07 (AB088554)

cadA-Terrabactersp DMA (EU372720)

100

10

0.05

B

Hình 3.18. Cây phát sinh chủng loại gen tfdA (A) gen giống cadA (B) chủng vi khuẩn Ao3, DMA, HDN3 số chủng đại diện

Nh− vậy, kết nghiên cứu góp thêm chứng trao đổi vật liệu di truyền có gen tham gia phân hủy chất diệt cỏ vi khuẩn đất nhiễm chất độc hóa học sân bay Đà Nẵng

KÕT LUËN

1.Tại bãi nhiễm chất độc hóa học sân bay Đà Nẵng đất nhiễm mức độ thấp có đa dạng vi sinh vật cao Vi khuẩn đất nhiễm thuộc lớp Actinobacteria, Acidobacteria, α, β γ-proteobacteria vi khuẩn họ Burkholderiaceae chiếm −u Các chi vi nấm phổ biến gồm Penicillium, Aspergillus, Fusarium, Cladosporium, Coniochaeta,

Phacidium, Anguillospora, Nectria, Tetrachaetum Số lợng gen

tfdA đất nhiễm từ 1,06x105 đến 5,99x106 MPN/g đất gen tfdA

líp I vµ II chiÕm −u thÕ

2.Hồ A chịu ảnh h−ởng trực tiếp n−ớc từ bãi nhiễm có đa dạng vi khuẩn kỵ khí tùy tiện Dehalococcoides cao so với hồ B hồ C bị ảnh h−ởng Một số dòng vi khuẩn bùn hồ thuộc lớp α -proteobacteria, Chlorobi, Chloroflexi, Sulfuricurvum, Fusobacteria, Nitrospiraceae vi khuẩn ch−a xác định

(27)

Pseudomonas chiếm u công thức xử lý 0,5DN vµ 1,5DN Vi

khn líp Betaproteobacteria chiÕm tû lƯ thÊp vµ vi khn

Pseudomonas nhóm −u hai công thức 10DNT 100DNT Các vi khuẩn kỵ khí kỵ khí tùy tiện đ−ợc phát công thức 0,5DN 1,5DN chiếm −u hai công thức 10DNT 100DNT Đã phát đ−ợc dòng vi khuẩn khử loại clo Dehalococcoides cơng thức 10DNT

4.Ba chđng vi khuẩn sử dụng DBF Ao3, DMA HDN3 thuộc chi

Paenibacillus, Terrabacter Rhodococcus Ba chủng sử dụng đ−ợc số hợp chất vòng thơm Chủng HDN3 sử dụng dioxin 2-chlorodibenzo-p-dioxin nh− nguồn carbon l−ợng Chủng HDN3 DMA phân hủy hoàn toàn mM DBF sau 24 48 ni cấy Các đoạn gen mã hóa dioxygenase chủng Ao3, DMA HDN3 t−ơng đồng cao với gen ahDO dbfA1 mã hóa enzym dioxygenase vị trí góc chủng có vị trí phân loại

5.Đoạn gen tfdA chủng vi khuẩn Ao3 DMA thuéc líp I gen tfdA

và đoạn gen tfdA chủng vi khuẩn HDN3 thuộc lớp II gen tfdA Đoạn gen giống cadA chủng vi khuẩn Ao3 DMA t−ơng đồng 99% 86% với trình tự đoạn gen giống cadA dòng HS07 từ DNA mẫu bùn hoạt tính có bổ sung 2,4-D

6.Hai chđng vi khn DNB19 vµ DNB20 sư dơng 2,4-D vµ PAH giống hệt trình tự đoạn gen 16S rRNA, sản phẩm BOX-PCR thuộc chi

Arthrobacter Trình tự đoạn gen tfdA chủng DNB19 thuộc lớp II gen

tfdA Trình tự đoạn gen cadA chủng DNB19 t−ơng đồng cao với gen

cadA tõ chñng Sphingomonas sp B6-10 Tr×nh tù axÝt amin suy diƠn gen

cadA chủng DNB19 t−ơng đồng 48% với trình tự axít amin TftA chủng vi khuẩn phân hủy 2,4,5-T B phenoliruptrix AC1100

KiÕn nghÞ

- Tiếp tục nghiên cứu biến động vi nấm công thức khử độc phân hủy sinh học

- Phân loại bốn chủng vi khuẩn Ao3, DMA, HDN3 DNB19 đến loài d−ới loài