Tuyển chọn chủng sinh b n axetylhexosaminidase ứng dụng cho thu nhận n axetyl d glucosamin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - BÙI THỊ THƢƠNG TUYỂN CHỌN CHỦNG SINH β-N-AXETYLHEXOSAMINIDASE ỨNG DỤNG CHO THU NHẬN N-AXETYL-D-GLUCOSAMIN LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS LÊ THANH HÀ Hà Nội - 2014 LỜI CAM ĐOAN Tôi Bùi Thị Thương xin cam đoan nội dung luận văn với đề tài “Tuyển chọn chủng sinh -N-axetylhexosaminidase ứng dụng cho thu nhận N- axetyl-D-glucosamin” cơng trình nghiên cứu sáng tạo tơi thực hướng dẫn PGS.TS Lê Thanh Hà Các số liệu, kết trình bày luận văn hồn tồn trung thực chưa cơng bố cơng trình khoa học khác LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, cố gắng nỗ lực thân, nhận ủng hộ, giúp đỡ tận tình thầy giáo, gia đình bạn bè Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Lê Thanh Hà, Th.S Dƣơng Thị Ngọc Quỳnh - Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội tận tình bảo tơi suốt q trình thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn tới thầy cô giáo thuộc Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm – Trường Đại học Bách khoa Hà Nội giảng dạy giúp đỡ tơi suốt q trình học tập thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè tạo điều kiện, quan tâm, động viên góp ý cho tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn! Học viên Bùi Thị Thƣơng Bùi Thị Thương Công nghệ sinh học MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG MỞ ĐẦU PHẦN TỔNG QUAN 11 1.1 Chitinase 11 1.1.1 Phân loại chitinase 11 1.1.2 Các nguồn thu nhận NAHase 14 1.1.3 Penicillium oxalicum 15 1.1.3.1 Đặc điểm hình thái sinh lý 15 1.1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh trưởng sinh tổng hợp chitinase 16 1.2 Chitin 20 1.2.1 Chitin tự nhiên 20 1.2.2 Cấu tạo, cấu trúc phân tử 21 1.2.3 Tính chất 23 1.2.4 Ứng dụng 25 1.3 N-axetyl-D-glucosamin (NAG) 25 1.3.1 Cấu tạo 26 Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật 2012-2014 Bùi Thị Thương Công nghệ sinh học 1.3.2 Tính chất 26 1.3.3 Phương pháp sản xuất NAG 27 1.3.3.1 Phương pháp hóa học 27 1.3.3.2 Phương pháp vi sinh vật 28 1.3.3.3 Phương pháp enzyme 29 1.3.4 Ứng dụng 31 PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 34 2.1 Nguyên liệu 34 2.2 Môi trƣờng 34 2.3 Hóa chất 36 2.4 Thiết bị 37 2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 38 2.5.1 Phương pháp chuẩn bị chitin huyền phù 38 2.5.2 Phương pháp ni cấy chìm 38 2.5.3 Phương pháp xác định hoạt độ NAHase 39 2.5.4 Phương pháp xác định hoạt độ chitinase 39 2.5.5 Phương pháp xác định hiệu suất thủy phân chitin huyền phù 40 2.5.6 Phương pháp TLC xác đinh phổ sản phẩm trình thủy phân 40 2.5.7 Phương pháp khảo sát yếu tố ảnh hưởng tới điều kiện lên men cho sinh tổng hợp NAHase cao 41 2.5.8 Phương pháp xác định sinh khối 43 2.5.9 Phương pháp thu nhận chế phẩm enzyme thô 43 Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật 2012-2014 Bùi Thị Thương Công nghệ sinh học 2.5.10 Xác định đặc tính chế phẩm enzyme thơ 44 2.5.11 Xác định ảnh hưởng điều kiện bảo quản chế phẩm enzyme thô 44 PHẦN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 46 3.1 Tuyển chọn chủng có khả sinh tổng hợp NAHase 46 3.2 Các yếu tố ảnh hƣởng tới trình sinh tổng hợp NAHase từ chủng P oxalicum 20B 47 3.2.1 Ảnh hưởng tỷ lệ cấp giống 47 3.2.2 Ảnh hưởng thời gian lên men 48 3.2.3 Ảnh hưởng pH lên men 49 3.3 Ảnh hƣởng nguồn dinh dƣỡng tới trình sinh tổng hợp NAHase từ chủng P oxalicum 20B 50 3.3.1 Ảnh hưởng nguồn nito 50 3.3.2 Ảnh hưởng nồng độ chitin 52 3.3.3 Ảnh hưởng nguồn phospho (tỷ lệ K2HPO4:KH2PO4) 53 3.3.4 Ảnh hưởng tỷ lệ MgSO4 55 3.4 So sánh hoạt độ NAHasetừ chủng P oxalicum 20B trƣớc sau tối ƣu điều kiện lên men 57 3.5 Nghiên cứu điều kiện ảnh hƣởng tới hoạt độ enzyme chế phẩm 58 3.5.1 Ảnh hưởng nhiệt độ thủy phân tới hoạt độ enzyme chế phẩm 59 3.5.2 Ảnh hưởng pH thủy phân tới hoạt độ enzyme chế phẩm 60 3.6 Nghiên cứu điều kiện bảo quản dịch enzyme thô theo hoạt độ NAHase 61 PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65 Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật 2012-2014 Bùi Thị Thương Công nghệ sinh học KẾT LUẬN 65 KIẾN NGHỊ 66 TÀI LIỆU THAM KHẢO 67 Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật 2012-2014 Bùi Thị Thương Công nghệ sinh học DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT KÝ HIỆU TÊN ĐẦY ĐỦ β-N-axetylhexosaminidase NAHase NAG N-axetyl-D-glucosamin p-nitrophenyl N-axetyl-β-D pNP-NAG glucosaminidase DJD Bệnh thối hóa khớp IBD Bệnh viêm ruột Neu5Ac Axit N-axetylneuraminic NSAID Non-Steroidal Anti – Inflammatory Drugs LD50 Lethal Dose HA Acid hyaluronic Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật 2012-2014 Bùi Thị Thương Cơng nghệ sinh học DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc không gian chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 12 Hình 1.2 Cấu trúc khơng gian chitinase thuộc họ Glycohydrolase 19 12 Hình 1.3 Chi Penicillium thành phần chổi (bộ máy mang bào tử trần) 16 Hình 1.4 1) Chitin; 2) Chitosan; 3) Cellulose 20 Hình 1.5 Cấu trúc hình học chitin 22 Hình 1.6 Các kiểu xếp mạch đại phân tử chitin 22 Hình 1.7 Cơng thức cấu tạo NAG 26 Hình 1.8 Sản xuất NAG biến đổi sinh học 28 Hình 3.1 Tuyển chọn chủng cho hoạt độ NAHase 46 Hình 3.2 Hình ảnh sắc ký TLC sản phẩm thủy phân chủng 47 Hình 3.3 Ảnh hưởng tỷ lệ cấp giống đến hoạt độ NAHase 48 Hình 3.4 Ảnh hưởng thời gian lên men đến hoạt độ NAHase 49 Hình 3.5 Ảnh hưởng pH lên men đến hoạt độ NAHase 50 Hình 3.6 Ảnh hưởng nguồn nito đến hoạt độ NAHase 51 Hình 3.7 Ảnh hưởng tỷ lệ chitin đến hoạt độ NAHase 53 Hình 3.8 Ảnh hưởng tỷ lệ K2HPO4, KH2PO4 đến hoạt độ NAHase 55 Hình 3.9 Ảnh hưởng tỷ lệ MgSO4 đến hoạt độ NAHase 56 Hình 3.10 Sắc ký đồ sản phẩm thủy phân dịch enzyme thô lên men tỷ lệ MgSO4 khác 57 Hình 3.11 Hoạt độ NAHase chủng P oxalicum 20B điều kiện trước sau khảo sát 58 Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật 2012-2014 Bùi Thị Thương Cơng nghệ sinh học Hình 3.12 Sắc ký đồ sản phẩm thủy phân dịch enzyme thô nhiệt độ khác 60 Hình 3.13 Sắc ký đồ sản phẩm thủy phân dịch enzyme thô pH thủy phân khác 61 Hình 3.14 Bảo quản dịch enzyme thơ theo hoạt độ NAHase 63 Hình 3.15 Sắc ký đồ sản phẩm thủy phân dịch enzyme thô bảo quản điều kiện khác sau 174 ngày bảo quản 64 Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật 2012-2014 Bùi Thị Thương Công nghệ sinh học TÀI LIỆU THAM KHẢO Dương Thị Ngọc Quỳnh, Đồng Thị Hương Trầm, Lê Thanh Hà (2013), Nghiên cứu điều kiện thủy phân thu N-acetyl-glucosamine chitinase thô từ Penicillium oxalicum 20B, Hội nghị khoa học cơng nghệ sinh học tồn quốc 2013 Nguyễn Thị Hà (2013), Tạp chí khoa học Trường Đại học Cần Thơ, Iss 27, pp 3239 Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn (2005), Sản xuất chế phẩm kỹ thuật y dược từ phế liệu thủy sản, Nhà xuất nông nghiệp thành phố Hồ Chí Minh, pp 19-44 Nguyễn Ngọc Tú (1994), Báo cáo hội nghị bỏng toàn quốc lần thứ A Shubakov, P S Kucheryavykh (2004), Chitinolytic Activity of Filamentous Fungi, Applied Biochemistry and Microbiology, Vol 40, Iss 5, pp 445-447 Ashry, E.S.H.E, Aly, M.R.E (2007), Synthesis and Biological Relevance of NAcetylglucosamine-containing Oligosaccharides, Pure Appl Chem, Vol 12, pp 2229– 2242 Binod P, Pusztahelyi T, Nagy V, Sandhya C, Szakacs G, Pocsi I, and Pandey A (2005), Production and purification of extracellular chitinases from Penicillium aceuleatum NRR 2129 under solid-state fermentation, Enzyme and Microbial Technology, Vol 36, Iss 7, pp 880-887 Binod P, Sandhya C, Suma P, Szakacs G, and Pandey A (2007), Fungal biosynthesis of endochitinase and chitobiase in solid state fermentation and their application for the production of N-acetyl-D-glucosamine from colloidal chitin, Bioresource Technology, Vol 98, Iss 14, pp 2742-2748 Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật 67 2012-2014 Bùi Thị Thương Công nghệ sinh học Bohlman, J.A.; Schisler, D.O.; Hwang, K.O.; Hennling J.P.; Trinkle, J.R.; Anderson, T.B.; Steinke, J.D.; Vanderhoff, A ( 2004), N-Acetyl-D-glucosamine and Process for Producing N-Acetyl-D-glucosamine, US Patent NO 6693188B2 10 Bough, W.A (1976), Chitosan-A polymer from seafood waste, for use in treatment of food processing wastes and activated sludge, Proc Biochem, Vol 11, Iss 1, pp 13 11 Chen, J.K.; Shen, C.R; Fang, B.S.; Huang, T.L.; Liu, C.L (2010), The N-Acetylglucosamine Obtained from Chitin with Chitinibacter tainanensis, Carbohydr Polym 12 Chen, R.H.; Hsu, C.N.; Chung, M.Y.; Tsai, W.L.; Liu, C.H (2008), Effect of Different Concentrations of Collagen, Ceramides, N-Acetyl Glucosamine, or Their Mixture on Enhancing the Proliferation of Keratinocytes, Fibroblasts and the Secretion of Collagen and/or the Expression of mRNA of Type I Collagen, J Food Drug Anal, Vol 16, pp 66–74 13 Chern, L.L.; Stackebrandt, E.; Lee, S.F.; Lee, F.L.; Chen, J.K.; Fu, H.M (2004), Chitinibacter tainanensis Gen nov sp nov., a Chitin-degrading Aerobe from Soil in Taiwan, Int J Syst Evol Microbiol, Iss 54, pp 1387–1391 14 Cohen-Kupiec, R.; Chet, I (1998), The Molecular Biology of Chitin Digestion, Curr Opin Biotechnol, Iss 9, pp 270–277 15 Crispinus A Omumasaba, Naoto Yoshidi, Kihachiro Ogawa (2001), Purification and characterization of a chitinase from Trichoderma viride, The Journal of Genaral anh Applied Microbiology, Vol 47, Iss 2, pp 53-61 16 D’Ambrosio, E.; Casa, B.; Bompani, R.; Scali, G.; Scali, M (1981), Glucosamine Sulfate: a Controlled Clinical Investigation in Arthrosis, Pharmatherpeutica, Iss 2, pp 504–508 17 DaizoKoga (2005), Application of Chitinase in Agriculture, Journal of Metals, Materials and Minerals, Vol 15, Iss 1, pp 33-36 Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật 68 2012-2014 Bùi Thị Thương Công nghệ sinh học 18 David G Hogenkamp, Yasuyuki Arakane, Karl J Kramer, Subbaratnam Muthukrishnan, Richard W Beeman (2008), Characterization and expression of the βN-acetylhexosaminidase gene family of Tribolium castaneum, Insect Biochemistry and Molecular Biology, Iss 38, pp 478-489 19 Deng, M.D.; Angerer, J.D.; Cyron, D.; Grund, A.D.; Jerrell, T.A., Jr.; Leanna, C.; Mathre, O.;Rossen, R.; Running, J.; Severson, D (2005), Process and Materials for Producing of Glucosamine and N-Acetylglucosamine, KR Patent NO 20050053534 20 Doi, R.H.; Kosugi, A.; Murashima, K.; Tamura, Y.; Han, S.O (2003), Cellulosomes from Mesophilic Bacteria, J Bacteriol, Iss 185, pp 5907–5914 21 Flessner, M.F.; Lofthouse, J.; Williams, A (2002), Chronic Alteration of SubPeritoneal Tissue and Peritoneal Transport, Adv Perit Dial, Vol 18, pp 12–14 22 Gooday, G.W (1990), The Ecology of Chitin Degradation, Microb Ecol, Vol 11, pp 387–430 23 Gubareva, L.V.; Kaiser, L.; Hayden, F.G ( 2000), Influenza Virus Neuraminidase Inhibitors, Lancet, pp 827–835 24 Hitoshi Sashiwa, Shizu Fujishima, Naoko Yamano, Norioki Kawasaki, Atsuyoshi Nakavama, Einosuke Muraki, Kazumi Hiraga, Kohei Oda, Sei-ichi Aiba (2002), Production of N-acetyl-D-glucosamine from α-chitin by crude enzymes from Aeromonas hydrophila H-2330, Carbohydrate research, Vol 337, pp 761-763 25 Houpt, J.B.; McMillan, R.; Wein, C.; Paget-Dellio, S.D (1999), Effect of Glucosamine Hydrochloride in the Treatment of Pain of Osteoarthritis of the Knee, J Rheumatol, Vol 26, pp 2423–2443 26 J H Kuk, W J Jung, G H Jo, Y C Kim, R D Park (2005), Production of Nacetyl-β-D-glucosamine from chitin by Aeromonas sp GJ-18 crude enzyme, Applied microbial and cell physiology, Vol 68, pp 384-389 Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật 69 2012-2014 Bùi Thị Thương Công nghệ sinh học 27 Jennifer L Guthrie, Sagal Khalif, Alan J Castle (2005), An improved method for detection and quantification of chitinase activities, Canadian Journal of Microbiology, Vol 51, Iss 6, pp 491-495 28 Karzed, K.; Domenjoz, R (1971), Effects of Hexosamine Derivatives and Uronic Acid Derivatives on Glycosaminoglycan Metabolism of Fibroblast Cultures, Pharmocology, Iss 5, pp 337–345 29 Katta, Suma, Sravani Ankati, and Appa Rao Podile (2013), Chitooligosaccharides are converted to N-acetylglucosamine by N-acetyl-β-hexosaminidase from Stenotrophomonas maltophilia, FEMS Microbiology Letters, Vol 348, Iss 1, pp 1925 30 Kim S.S., Kim S.H, Lee Y.M (1996), Preparation, Characterization, and Properties of β – chitin and N-acetylated β – chitin, J.Polymer Sci.: Part B: Polymer Physics, Vol 34, pp 2367-2374 31 Kurita, Keisuke (1993), Squid chitin as a potential alternative chitin source: Deaxetylation behavior and characteristic properties, J.Polymer Sci.: Part A: Polymer chemistry, Vol 31, pp 485-491 32 L.de Oliveira Franco, Rita de Cassia C Maia, Ana Lucia F Porto, Arminda Sacconi Messias, Kazutaka Fukushima, Galba Maria de Campos Takaki (2004), Heavy metal biosorption by chitin and chitosan isolated from Cunninghammella elegans, Brazilian Journal of Microbiology, Vol 35, Iss 33 Lee, E.A.; Pan, C.H.; Son, J.M.; Kim, S.I (1999 ), Isolation and Characterization of Basic Exochitinasefrom Leaf Extract of Rehmannia glutinosa, Biosci Biotechnol Biochem, Vol 63, pp 1781–1783 Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật 70 2012-2014 Bùi Thị Thương Công nghệ sinh học 34 Lee, K.Y.; Shibutani, M.; Takagi, H.; Arimura, T.; Takigami, S.; Uneyama, C.; Kato, N.; Hirose,M (2004), Subchronic Toxicity Study of Dietary N- Acetylglucosamine in F344 Rats, Food Chem.Toxicol, Vol 42, pp 687–695 35 Liu, Y.; Li, Z.; Liu, G.; Jia, J.; Li, S.; Yu, C (2008), Liquid Chromatography– Tandem Mass Spectrometry Method for Determination of N-Acetylglucosamine Concentration in Human Plasma, J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, Vol 862, pp 150–154 36 Lord, J.M (1985), Precursors of Ricin and Ricinus communis Agglutinin, Eur J Biochem, Vol 146, pp 411–416 37 Marcum, F.D.; Seanor, J.W (2007), Composition and Method for Treating Rheumatoid Arthritis, US Patent NO 38 Maru, I.; Ohnishi, J.; Ohta, Y.; Tsukada, T (1998), Simple and Large-Scale Production of N-Acetyl-neuraminic Acid from N-Acetyl-D-glucosamine and Pyruvate Using N-Acetyl-D-glucosamine 2-Epimerase and N-Acetyl-neuraminic Acid Lyase, Carbohydr Res, Vol 306, pp 575–578 39 Maru, I.; Ohnishi, J.; Ohta, Y.; Tsukada, Y (2002), Why Is Sialic Acid Attracting Interest Now? Complete Enzymatic Synthesis of Sialic Acid with N- Acetylglucosamine 2-Epimerase, J Biosci.Bioeng, Vol 93, pp 258–265 40 Matsumoto, Yoyi, et al (2004), Production of b-N-acetylhexosaminidase of Verticillium lecanii by solid state and submerged fermentations utilizing shrimp waste silage as substrate and inducer, Process Biochemistry, Vol 39, Iss 6, pp 665-671 41 Michiaki, M., Koji, K and Kazuo, K (1997), Effects of polyols and organic solvents on thermostability of lipase, J Chem Technol Biotechnol, Vol 70, Iss 188 Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật 71 2012-2014 Bùi Thị Thương Công nghệ sinh học 42 No, H.K., Park, N.Y., Lee, S.H, Hwang, H.J., Meyers, S.P (2002), Antibacterial Activities of Chitosans and Chitosan Oligomers with Diffirent Molecular Weights on Spoilage Bacteria Isolated from Tofu, Journal of Food Science, Vol 67, Iss 43 P V Suresh, P K Anil Kumar (2012), N-acetyl-D-glucosamine by thermoactive chitinase from soil mesophilic fungi, Original paper 44 Parameswaran Binod, Chandran Sandhya, Pradeep Suma, George Szakacs, Ashok Pandey (2007), Fungal biosynthesis of endochitinase and chitobiase in solidstate fermentation and their application for the productionof N-acetyl-D-glucosamine from colloidal chitin, Bioresource Technology, Vol 98, pp 2742-2748 45 Phakapob Setthakeset, Rath Pichyangkura, Anawat Ajavakom and Mongkol Sukwarranasinitt (2008), Preparation of N-acetyl-D-glucosamine Using Enzyme from Aspergillus sp, Journal of Metals, Materials and Minerals,, Vol 18, Iss 2, pp 53-57 46 Pichyangkura, R.; Kudan, S.; Kuttiyawang, K.; Sukwattanasinitt, M.; Aiba, S (2002), Quantitative Production of 2-Acetoamodo-2-D-glucose from Crystalline Chitin by Bacterial Chitinase, Carbohydr Res, Iss 337, pp 557–559 47 Rath Pichyangkura, Sanya Kudan, Kamontip Kuttiyawong, Mongkol Sukwattanasinitt, Sei-ichi Aiba (2005), Quantitative production of 2-acetamido-2deoxy-D-glucose from crystalline chitin by bacterial chitinase, Carbohydrate research, Vol 337, pp 557-559 48 Rosa Valeria daSilva Amorim, Wanderley de Souza, Kazutaka Fukushima, Galba Maria de Campos-Takaki (2001), Faster chitosan production by mucoralean strains in submerged culture, Brazilian Journal of Microbiology, Vol 32, Iss 49 Ryosuke, K.; Yoshiharu, M.; Kazuaki, K.; Kazuo, S (2002), Production of Naturaltype N-Acetyl-D-glucosamine, JP Patent NO 200281696 Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật 72 2012-2014 Bùi Thị Thương Công nghệ sinh học 50 Salvatore, S.; Heuschkel, R.; Tomlin, S.; Davies, S.E.; Edwards, S.; Walker-Smith, J.A.; French,I; Murch, S.H (2000), A Pilot Study of N-Acetyl Glucosamine, a Nutritional Substrate for Glycosaminoglycan Synthesis, in Paediatric Chronic Inflammatory Bowel Disease, Aliment Pharmacol Ther, Vol 14, pp 1567–1579 51 Sashiwa, H.; Fujishima, S.; Yamano, N.; Kawasaki, N.; Nakayama, A.; Muraki, E.; Aiba, S (2001), Production of N-Acetyl-D-glucosamine from β-Chitin by Enzymatic Hydrolysis, Chem Lett, Iss 31, pp 308–309 52 Sashiwa, H.; Fujishima, S.; Yamano, N.; Kawasaki, N.; Nakayama, A.; Muraki, E.; Hiraga, K.;Oda, K.; Aiba, S (2002), Production of N-Acetyl-D-glucosamine from αChitin by Crude Enzymes from Aeromonas hydrophila H2330, Carbohydr Res, Iss 337, pp 761–763 53 Se-Kwon Kim, Niranjan Raiapakse (2005), Enzymatic production and biological activities of chitosanoligosaccharit (COS), A review Cacbohydrate Polymer 62, pp 357-368 54 Seo, S.; King, J.M.; Prinyawiwatkul, W (2007), Simultaneous Depolymerization and Decolorization of Chitosan by Ozone Treatment, J Food Sci, Vol 72, pp C522– C526 55 Shashiwa H, Fujishima S, Yamano N, Kawashaki N, Nakayama A, Muraki E, Sukwattanasiniit M, Pichyangkura R, and Aiba SI (2003), Enzymatic production of Nacetyl-D-glucosaminidase from chitin Degradation study of N- acetylchitooligosacharide and the effect of mixing of crude enzymes, Carbonhydrate Polymers, Vol 51, Iss 4, pp 391-395 56 Shen, C.R.; Juang, J.H.; Tsai, Z.T.; Wu, S.T.; Tsai, F.Y.; Wang, J.J; Liu, C.L.; Yen, T.C (2010), Preparation, Characterization and Application of Superparamagnetic Iron Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật 73 2012-2014 Bùi Thị Thương Công nghệ sinh học Oxide Encapsulated with N-[(2-Hydroxy-3-trimethylammonium) propyl] Chitosan Chloride, Carbohydr Polym 57 Spellman, M.W.; Basa, L.J.; Leonard (1989), Carbohydrate Structures of Human Tissue Plasminogen Activator Expressed in Chinese Hamster Ovary Cells J Biol Chem, Vol 264, pp 14100–14111 58 Suginta, Wipa, et al (2010), Novel beta-N-acetylglucosaminidases from Vibrio harveyi 650: Cloning, expression, enzymatic properties, and subsite identification, BMC Biochemistry, Vol 11, Iss 1, pp 40 59 Thi, Nhung Nguyen, et al (2014), Structure and Activity of the Streptomyces coelicolor A3(2) β-N-Acetylhexosaminidase Provides Further Insight into GH20 Family Catalysis and Inhibition, Biochemistry 60 Watkins, W.M (1980), Biochemistry and Genetics of the ABO, H, Lewis and P Blood Group Systems, Adv Hum Genet, Vol 10, pp 135-136 61 Wu, A.M.; Wu, J.H.; Liu, J.H.; Chen, Y.Y.; Singha, B.; Chow, L.P.; Lin, J.Y (2009), Roles of Mammalian Structural Units, Ligand Cluster and Polyvalency in the Abrus precatorius Agglutinin and Glycoprotein Recognition Process, Mol Immunol, Iss 16, pp 3427–3437 62 Xia, G., Jin, C., Zhou, J., Yang, S., Zhang, S., Jin, C., 2001 A novel, chitinase having unique mode of action from Aspergillus fumigatus, and 4079–4085 YJ-407 Eur J Biochem 268 (2001), A novel chitinase having unique mode of action from Aspergillus fumigatus YJ-407, Eur J Biochem, Vol 268, pp 4079–4085 63 Xiao-Hong Huang, Yan-Dong Jin, Yi-Fan Huang, Wei-Chao Han and Wen Zhang (2013), Purification and properties of N-acetyl-β-D-glucosaminidase from bovine testicle, African Journal of Biotechnology, Vol 12, Iss 34, pp 5354-5360 Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật 74 2012-2014 Bùi Thị Thương Công nghệ sinh học 64 Xu, Q.; Liu, J (2006), Use of N-Acetyl D-glucosamine in Treatment of Organ Lesion Related to Toxicosis of Drugs or Chemicals, US Patent NO 65 Yoyi Matsumoto, Gerardo Saucedo-Castañeda, Sergio Revah, Keiko Shirai (2004), Production of β-N-acetylhexosaminidase of Verticillium lecanii by solid state and submerged fermentations utilizing shrimp waste silage as substrate and inducer, Process Biochemistry, Iss 39, pp 665-671 66 Zakaria M.B, Abdullnh M.P, Alimuniar A (1994), Chitosan – Its productional and potentials, Paper invited for presentation at the National Confefence on Production, Processing and Handling of Fish & Fishery Products 67 Zhan, W.S (2007), Process for Preparing Refined N-Acetyl-D-aminoglucose, CN Patent NO 1907993 Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật 75 2012-2014 Bùi Thị Thương Công nghệ sinh học PHỤ LỤC Xây dựng đƣờng chuẩn p-nitrophenyl Hình PL1 Phƣơng trình đƣờng chuẩn p-nitrophenyl OD 540 nm Xây dựng đƣờng chuẩn N-axetyl-D-glucosamin 1.8 1.5 1.2 0.9 0.6 0.3 y = 1.6793x - 0.0386 R² = 0.9992 0.2 0.4 0.6 0.8 Nồng độ NAG (mg/ml) Hình PL2 Phƣơng trình đƣờng chuẩn N-axetyl-D-glucosamin Tuyển chọn chủng có khả sinh NAHase cao Bảng PL1 Các chủng cho hoạt độ NAHase cao Chủng nghiên cứu Hoạt độ NAHase (U/ml) P oxalicum 20B 6,418 ± 0,06 Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật 76 2012-2014 Bùi Thị Thương Công nghệ sinh học Tritrodema 34A 1,173 ± 0,03 B licheniformis 23 0,020 ± 0,0 B licheniformis 213 0,021 ± 0,0 Các yếu tố ảnh hƣởng tới trình sinh tổng hợp NAHase từ chủng P oxalicum 20B Bảng PL2 Ảnh hƣởng tỷ lệ cấp giống đến hoạt độ NAHase chủng P oxalicum 20B Tỷ lệ cấp giống (%) Hoạt độ NAHase (U/ml) 10,11 ± 0,64 13,13 ± 0,17 13,36 ± 0,18 12,16 ± 0,27 Bảng PL3 Ảnh hƣởng thời gian lên men đến hoạt độ NAHase chủng P oxalicum 20B Thời gian lên men (ngày) Hoạt độ NAHase (U/ml) 1,22 ± 0,33 1,17 ± 0,05 3,57 ± 0,18 Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật 77 2012-2014 Bùi Thị Thương Công nghệ sinh học 10,74 ± 0,85 8,54 ± 0,23 1,00 ± 0,01 Bảng PL4 Ảnh hƣởng pH lên men đến hoạt độ NAHase chủng P oxalicum 20B pH lên men Hoạt độ NAHase (U/ml) 7,06 ± 0,51 8,66 ± 0,27 9,55 ± 0,04 10,27 ± 0,0 7,28 ± 0,0 Ảnh hƣởng nguồn dinh dƣỡng tới trình sinh tổng hợp NAHasetừ chủng P oxalicum 20B Bảng PL5 Ảnh hƣởng nguồn nito Nguồn nito Hoạt độ NAHase (U/ml) Sinh khối (g) Không nấm men 4,56 ± 0,0 0,39 Cao nấm men 11,32 ± 0,10 0,58 Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật 78 2012-2014 Bùi Thị Thương Công nghệ sinh học Pepton 9,58 ± 0,22 0,53 NaNO3 0,65 ± 0,09 0,32 Nấm men + NaNO3 7,59 ± 0,11 0,51 (NH4)2SO4 0,31 ± 0,0 0,31 Nấm men + (NH4)2SO4 10,68 ± 0,04 0,43 NaNO3 + (NH4)2SO4 0,40 ± 0,0 0,44 Bảng PL6 Ảnh hƣởng nồng độ chitin Tỷ lệ chitin (%) Hoạt độ NAHase (U/ml) 0,1 7,74 ± 0,22 0,2 9,07 ± 0,53 0,3 8,20 ± 0,04 0,4 8,95 ± 0,32 0,5 0,94 ± 0,02 0,6 0,83 ± 0,0 0,7 0,86 ± 0,0 Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật 79 2012-2014 Bùi Thị Thương Công nghệ sinh học Bảng PL7 Ảnh hƣởng nguồn phospho (tỷ lệ K2HPO4:KH2PO4) Tỷ lệ K2HPO4:KH2PO4 Sinh khối Hoạt độ NAHase (U/ml) (%) (g) 12,20 ± 0,02 0,40 0,2:0,1 14,45 ± 0,19 0,45 0,4:0,2 8,86 ± 0,08 0,38 0,8:0,4 8,64 ± 0,13 0,31 Bảng PL8 Ảnh hƣởng tỷ lệ MgSO4 Tỷ lệ MgSO4 (%) Hoạt độ NAHase (U/ml) Sinh khối (g) 10,82 ± 0,02 0,41 0,07 15,13 ± 0,02 0,52 0,14 12,59 ± 0,60 0,47 0,28 11,81 ± 0,64 0,43 Bảng PL9 Kết trƣớc sau khảo sát yếu tố lên men chủng P oxalicum 20B theo hoạt độ NAHase Tên chủng Trƣớc khảo sát Sau khảo sát P oxalicum 20B 12,4 ± 0,43 21,5 ± 0,13 Nghiên cứu điều kiện bảo quản dịch enzyme thô theo hoạt độ hexosaminidas Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật 80 2012-2014 Bùi Thị Thương Công nghệ sinh học Bảng PL10 Nghiên cứu điều kiện bảo quản dịch enzyme thô Nhiệt Điều kiện độ bảo quản bảo quản Nhiệt độ - thường Hoạt độ NAHase (U/ml) Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày 18 27 45 54 84 174 100 ± 98,5 ± 84,9 ± 99,0 ± 81,4 ± 59,2 ± 40,9 ± 0,55 2,0 0,02 0,52 0,11 0,48 0,22 100 ± 100 ± 89,9 ± 100 ± 100 ± 100 ± 100 ± 79,8 ± 1,05 1,80 1,51 1,90 0,37 0,36 0,48 0,40 100 ± 100 ± 100 ± 96,1 40,4 ± 0,24 0,10 0,74 0,69 0,13 0,06 ± 0,12 0,25 100 ± 100 ± 90,4 ± 100 ± 100 ± 100 ± 96,8± 92,8 ± 0,41 1,30 0,65 0,24 0,26 0,37 0,20 0,12 100 ± 100 ± 97,1 ± 100 ± 100 ± 100 ± 100 ± 87,4 ± 0,76 1,55 2,04 0,08 0,08 0,04 0,28 0,12 Manitol : 100 ± 100 ± 100 ± 100 ± 100 ± 100 ± 100 ± 94,3 ± NaCl 0,59 0,28 0,61 0,01 0,22 0,16 0,36 0,04 100 ± 100 ± 100 ± 100 ± 1,01 0,20 0,02 0,03 40C -200C - - Glyxerol : Glucoza 72,8 ± 89,3 ± 88,0 ± 4C Glyxerol Glyxerol : NaCl NaCl 40 C 77,7 ± 97,0 ± 1,01 2,57 100 ± 90,9 ± 91,7 ± 85,3 ± 82,8 ± 100 ± 0,05 0,34 Luận văn Thạc sĩ kỹ thuật 1,21 0,93 81 1,10 0,69 95,7 ± 82,8 ± 0,05 0,02 88,1 ± 75,6 ± 0,46 1,76 2012-2014 ... CAM ĐOAN Tôi B? ?i Thị Thương xin cam đoan n? ??i dung lu? ?n v? ?n với đề tài ? ?Tuy? ?n ch? ?n chủng sinh -N- axetylhexosaminidase ứng d? ??ng cho thu nh? ?n N- axetyl- D- glucosamin? ?? cơng trình nghi? ?n cứu sáng tạo... gốc nguy? ?n b? ??nh khớp Ngoài ứng d? ??ng điều trị b? ??nh viêm khớp, NAG ứng d? ??ng y học để chữa b? ??nh viêm ruột, ứng d? ??ng mỹ phẩm làm đẹp da chất để s? ?n xuất axit sialic (ứng d? ??ng chữa b? ??nh cúm) NAG chứng... nhi? ?n với tác d? ??ng kháng khu? ?n, kháng n? ??m tăng sinh tế b? ?o, chitin ứng d? ??ng: Trong y học, chitin ứng d? ??ng làm vật liệu sinh học như: mô ghép, giả, phẫu thu? ??t, da nh? ?n tạo, mạch máu nh? ?n tạo Da