Nghiên cứu thu nhận peptide mạch ngắn có hoạt tính sinh học từ phụ phẩm cá hồi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - NGUYỄN HÀ TRUNG NGHIÊN CỨU THU NHẬN PEPTIDE MẠCH NGẮN CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ PHỤ PHẨM CÁ HỒI LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS PHẠM KIÊN CƯỜNG PGS.TS QUẢN LÊ HÀ Hà Nội - Năm 2018 LỜI CAM ĐOAN Học viên: Nguyễn Hà Trung Nơi đào tạo: Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Người hướng dẫn 1: TS Phạm Kiên Cường Đơn vị : Viện Công nghệ mới/ Viện Khoa học công nghệ Quân Người hướng dẫn 2: PGS.TS Quản Lê Hà Đơn vị : Viện Công nghệ Sinh học & công nghệ thực phẩm/ĐH Bách Khoa HN Tên luận văn: “Nghiên cứu thu nhận peptide mạch ngắn có hoạt tính sinh học từ phụ phẩm cá hồi” Nội dung cam đoan: Tôi xin cam đoan, suốt trình nghiên cứu luận văn thạc sĩ, hướng dẫn bảo tận tình giáo viên hướng dẫn, tiến hành nghiên cứu luận văn cách trung thực, toàn nội dung báo cáo luận văn trực tiếp thực Tất nghiên cứu không chép từ báo cáo khoa học, luận văn tiến sĩ, thạc sĩ hay sách tác giả Học viên Nguyễn Hà Trung LỜI CẢM ƠN Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Phạm Kiên Cường, Viện Công nghệ - Viện Khoa học Công nghệ Quân PGS.TS Quản Lê Hà, Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, tận tình,hướng dẫn tơi suốt q trình nghiên cứu để hồn thành luận văn Trong thời gian thực tập làm việc phịng Thí nghiệm Cơng nghệ Hóa sinh Cơng nghệ - Viện Khoa học & Công nghệ quân sự, nhận quan tâm giúp đỡ, bảo tận tình chun mơn, kĩ thuật động viên chân thành anh, chi cán phịng Tơi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ q báu Nhân dịp tơi xin chân thành cảm ơn Thầy, Cô Viện Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội nhiệt tình giảng dạy giúp đỡ trình học tập nghiên cứu Qua đây, xin chân thành cảm ơn cán phịng thí nghiệm Viện cơng nghệ sinh học công nghệ thực phẩm, bạn sinh viên, học viên, nghiên cứu sinh trường Đại Học Bách Khoa Hà Nội giúp đỡ tơi q trình thí nghiệm Tơi xin gửi lời cảm ơn đến Thủ trưởng Viện Công nghệ - Viện Khoa học & Công nghệ quân Ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học & Công nghệ Thực phẩm – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, tạo điều kiện thuận lợi giúp tơi hồn thành luận văn Cuối cùng, tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè động viên giúp đỡ, tạo điều kiện để tơi hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn! Học viên Nguyễn Hà Trung MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN DANH MỤC BẢNG BIỂU MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU Tổng quan cá hồi Tổng quan Peptide có hoạt tính sinh học 2.1 Khái niệm chung Peptide 2.1.1 Cấu tạo chung Peptide 2.1.2 Tính chất hóa học peptide 2.2 Peptide mạch ngắn có hoạt tính sinh học 2.2.1 Giới thiệu peptide mạch ngắn có hoạt tính sinh học 2.2.2 Các hoạt tính sinh học peptide 2.4 Tổng quan trình thủy phân protein 13 2.4.1 Quá trình thủy phân 13 2.4.2 Các phương pháp thủy phân protein 14 2.4.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình thủy phân protein enzyme 16 2.5 Nghiên cứu thu nhận peptide có hoạt tính sinh học từ nguồn thủy sản 18 2.5.1 Trên giới 18 2.5.2 Tại Việt Nam 21 CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Nguyên liệu hóa chất 24 2.2 Thiết bị 24 2.3 Phương pháp nghiên cứu 24 2.3.1 Xác định thành phần hóa học phụ phẩm cá hồi 24 2.3.2 Phương pháp tách lipit khỏi phụ phẩm 26 2.3.3 Phương pháp thủy phân enzyme 27 2.3.4 Xác định hàm lượng amino acid ninhydrin 27 2.3.5 Xác định hoạt tính chống oxy hóa peptide 1,1-diphenyl-2picrylhydrazyl (DPPH) [51] 28 2.3.6 Xác định mức độ thủy phân 29 2.9 Phương pháp điện di gel Tricine-SDS-PAGE 30 CHƯƠNG KẾT QUẢ 33 3.1 Xây dựng quy trình xử lý nguyên liệu phụ phẩm cá hồi dùng cho thu hồi peptide có hoạt tính sinh học 33 3.2 Nghiên cứu lựa chọn chế phẩm protease thương mại để thủy phân giới hạn phụ phẩm cá hồi thu peptide sinh học 36 3.3 Nghiên cứu xác định điều kiện thủy phân thích hợp (nhiệt độ, pH, thời gian, tỷ lệ enzyme/cơ chất, chất hoạt hóa 40 3.3.1 Ảnh hưởng nồng độ enzyme đến phản ứng thủy phân 40 3.3.2 Ảnh hưởng pH môi trường đến hiệu phản ứng thuỷ phân 41 3.3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến phản ứng thuỷ phân 43 3.3.4 Ảnh hưởng thời gian đến phản ứng thuỷ phân 44 3.4 Điều kiện thủy phân phụ phẩm cá hồi để thu nhận peptit mạch ngắn có hoạt tính chống oxy hóa 47 3.5 Quy trình thủy phân phụ phẩm cá hồi thu peptide có hoạt tính sinh học 49 3.6 Thử nghiệm tạo bột peptide phương pháp sấy phun 51 3.6.1 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ sấy 51 3.6.2 Khảo sát ảnh hưởng tốc độ nhập liệu 52 3.7 Xây dựng quy trình thu hồi peptide chức 53 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 Kết luận 56 Kiến nghị 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Nghĩa từ viết tắt DHA Acid docosahexaenoic DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl EPA Axit eicosapentaenoic OPA Ortho-phthalaldehyde SDS Sodium dodecyl sulfate PAGE Polyacrylamide Gel Electrophoresis DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Cá hồi vân Việt Nam [50] Hình 1.3 Ảnh hưởng peptide chức đến hệ thống thể Hình 1.4 Quy trình tách xác định peptide chức từ nguồn protein thực phẩm [8] 23 Hình 2.1 Phản ứng tạo phức thuốc thử OPA với hợp chất chứa nhóm amino (H2N=R) 29 Hình 3.1 Ảnh hưởng việc loại bỏ lipit trước thủy phân đến hiệu suất thủy phân phụ phẩm cá hồi 34 Hình 3.2 Hàm lượng lipit sản phẩm thủy phân với alcalase trypsin sau sấy khô 35 Hình 3.3 So sánh hiệu suất tách lipit từ phụ phẩm cá hồi phương pháp 36 Hình 3.4 Ảnh hưởng thời gian thủy phân lên mức độ thủy phân phụ phẩm cá hồi số enzyme 38 Hình 3.5 Ảnh hưởng loại enzyme protease lên hoạt tính chống oxy hóa 39 Hình 3.6 Ảnh hưởng nồng độ enzyme đến phản ứng thuỷ phân phụ phẩm cá hồi 41 Hình 3.7 Ảnh hưởng nồng độ enzyme đến hoạt tính quét gốc tự DPPH dịch thủy phân 41 Hình 3.8 Ảnh hưởng pH môi trường đến khả thủy phân phụ phẩm cá hồi Alcalase Trypsin 42 Hình 3.9 Ảnh hưởng pH mơi trường đến hoạt tính quét gốc tự DPPH dịch thủy phân 42 Hình 3.10 Ảnh hưởng nhiệt độ đến phản ứng thủy phân phụ phẩm cá hồi enzyme 44 Hình 3.11 Ảnh hưởng nhiệt độ thủy phân đến hoạt tính quét gốc tự DPPH dịch thủy phân 44 Hình 3.12 Ảnh hưởng thời gian đến sản phẩm thủy phân phụ phẩm cá hồi enzyme 45 Hình 3.13 Ảnh hưởng thời gian thủy phân đến hoạt tính quét gốc tự DPPH dịch thủy phân 45 Hình 3.14 Điện di kiểm tra dịch thủy phân phụ phẩm cá hồi 49 Hình 3.15 Điện di dịch thủy phân sau lọc qua màng 30 kDa 10 kDa 51 Hình 3.16 Hệ thống sấy phun dịch peptide 53 Hình 3.17 Sản phẩm bột peptide từ phụ phẩm cá hồi 53 Hình 3.18 Bột cháy dính vào thành thiết bị 53 Hình 3.19 Quy trình cơng nghệ sản xuất bột peptide từ phụ phẩm cá hồi 55 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1: Thành phần EPA, DHA phụ phẩm cá hồi (g.100g-1) [47] Bảng 1.2: Thành phần amino acid từ da cá hồi [53] Bảng 2.1 : Hoạt tính sinh học số peptide từ phụ phẩm cá 21 Bảng 2.1: Phương pháp xác định thành phần hóa học nguyên liệu 24 Bảng 2.2 Giá trị số α, ß, htotal, protein từ vật liệu khác 30 Bảng 2.3 Thành phần gel polyacrylamide 31 Bảng 2.4 Thành phần đệm chạy đệm gel Tricine-SDS-PAGE 32 Bảng 3.1 Thành phần hóa học phụ phẩm cá hồi đơng lạnh 33 Bảng 3.2 Đánh giá kết thủy phân phụ phẩm cá hồi kết hợp trypsin alcalase 48 Bảng 3.3 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ sấy 52 Bảng 3.4 Khảo sát ảnh hưởng tốc độ nhập liệu 52 MỞ ĐẦU Cá hồi có tên khoa học Salmonidae họ cá vây tia, đồng thời họ sống Salmoniformes (bộ cá hồi) Đầu năm 2005, 50.000 trứng điểm mắt nhập từ Phần Lan để thử nghiệm Trung tâm Nghiên cứu thủy sản nước lạnh Sa Pa-Lào Cai Kể từ cá hồi vân ấp, nở, ương nuôi thương phẩm thành công nhiều nơi nước năm qua (Lào Cai, Lai Châu, Lâm Đồng, ) (Báo cáo Viện Kinh tế Quy hoạch thủy sản., 2014) Theo phê duyệt: “Quy hoạch phát triển cá nước lạnh đến năm 2020” Bộ Nông nghiệp phát triển nông thôn xác định mục tiêu là: Tổng sản lượng nuôi cá nước lạnh đến năm 2015 đạt 3.460 (cá tầm 2.012 tấn, cá hồi 1.448 tấn); đến năm 2020, sản lượng nuôi đạt 10.000 (cá tầm 7.287 tấn, cá hồi 2.713 tấn) Tập trung số vùng Đông Bắc, Tây Bắc, Bắc Trung duyên hải miền trung, Tây nguyên Trong trình chế biến cá, lượng lớn sản phẩm phụ (xương, da, vụn thịt,…) thường chế biến làm thức ăn cho tôm, cá, gia súc sử dụng cho sản phẩm có giá trị kinh tế thấp chế biến thành bột cá, dầu cá hay làm dầu diezel sinh học Phụ phẩm cá hồi chứa hàm lượng protein lớn có số ứng dụng như: chế biến đồ hộp, sản xuất nước mắm, tinh chế collagen, Chính việc chế biến, xử lý phụ phẩm cá hồi nhằm thu protein có giá trị thương mại cao đồng thời tránh vấn đề môi trường quan tâm nghiên cứu Trong đó, việc thủy phân enzym để thu hồi protein từ phụ phẩm cá cách tiếp cận hiệu ứng dụng rộng rãi [2-4] Nghiên cứu See tập thể (2011) sử dụng enzym thủy phân protein từ nguồn phụ phẩm từ cá hồi để tạo peptide amino acid có giá trị dinh dưỡng cao Các nghiên cứu đánh giá hoạt tính peptide thu từ thủy phân da cá hồi cho thấy chúng có khả chống xi hóa, kháng khuẩn, liên kết canxi Hiện tại, chưa có cơng trình công bố Việt Nam nghiên cứu peptide sinh học phân tử thấp từ phụ phẩm cá hồi để sử dụng làm nguyên liệu chế biến thực phẩm chức Đây sở để chúng tơi lựa chọn đề tài "Nghiên cứu thu nhận peptide mạch ngắn có hoạt tính sinh học từ phụ phẩm cá hồi " dịch thủy phân trypsin cao dịch thủy phân alcalase Do để xây dựng quy trình thủy phân với hiệu suất thủy phân hoạt tính chống oxy hóa cao chúng tơi tiến hành thủy phân phụ phẩm cá hồi việc kết hợp enzyme Trypsin Alcalase đánh giá khối lượng bã, thể tích dịch, hàm lượng amino acid % hoạt tính chống oxy hóa dịch thủy phân thu sau phản ứng Bảng 3.2 Đánh giá kết thủy phân phụ phẩm cá hồi kết hợp trypsin alcalase Alcalase 4% (4 giờ) Khối lượng bã (g) 23,57 Thể tích dịch (ml) 72 Trypsin 4% (4 giờ) 31,72 62 17,53 56,62 20,13 73 21,20 64,72 18,33 81 29,48 70,34 22,24 72 20,02 59,45 Mẫu Alcalase 2% (2 giờ) Trypsin 2% (2 giờ) Trypsin2% (2 giờ) Alcalase 2% (2 giờ) Alcalase 2% + Trypsin 2% (4 giờ) Hàm lượng % Hoạt tính amino acid chống oxy (mg/ml) hóa 18,87 33,05 So sánh kết thủy phân, với lượng nguyên liệu với thời gian lượng enzyme (4% enzyme, thời gian thủy phân giờ), kết thu thể Bảng 3.2 cho thấy, mẫu thủy phân với enzyme Trypsin 2% sau thủy phân tiếp Alcalase 2% thu lượng bã (18,33 g), thể tích dịch thủy phân lớn (81 ml), hàm lượng amino acid cao đạt 29,48 mg/ml hoạt tính chống xi hóa cao đạt 70,34% Điều kiện lựa chọn để thủy phân phụ phẩm cá hồi * Kiểm tra kích thước protein thu sau thủy phân: Kết thúc trình thủy phân phụ phẩm cá hồi, sau ly tâm thu dịch loại bỏ bã, sản phẩm dịch thủy phân thu nhận kiểm tra kích thước cách điện di Tricine SDS-PAGE Kết thu Hình 3.6 48 M: Color Marker Ultra Low Range (M.W 1,060 26,6 kDa, Sigma Aldrich C6210) 1: Mẫu dịch thủy phân Hình 3.14 Điện di kiểm tra dịch thủy phân phụ phẩm cá hồi Sản phẩm thủy phân phụ phẩm cá hồi quan sát gel điện di vệt protein dài So sánh với thang chuẩn marker nhận thấy sản phẩm phản ứng thủy phân phụ phẩm có kích thước đa dạng khoảng từ 2,5kDa đến 20kDa Tuy nhiên có lượng nhỏ peptide với trọng lượng phân tử thấp (nhỏ 5kDa) quan sát thấy cho thấy có tạo thành peptide sau phản ứng thủy phân phụ phẩm enzym 3.5 Quy trình thủy phân phụ phẩm cá hồi thu peptide có hoạt tính sinh học Qua nhiều thử nghiệm thay đổi điều kiện nồng độ enzyme, nhiệt độ, thời gian thủy phân, pH khác nhau, quy trình thủy phân phụ phẩm cá hồi xây dựng sau: Phụ phẩm cá hồi sau rã đông, xay nhỏ bổ sung nước theo tỷ lệ 1:1 (khối lượng/thể tích), khuấy để đồng hỗn hợp Sau đó, tiến hành gia nhiệt hỗn hợp 95oC để tách lipit hạ nhiệt độ phòng Ly tâm hỗn hợp thủy phân với tốc độ 10000 vòng/phút thời gian 15 phút 4oC Hỗn hợp sau ly tâm phân thành lớp riêng biệt, sau loại bỏ lớp lipit phía trên, hỗn hợp phụ phẩm tách mỡ lại sử dụng để tiến hành thủy phân 49 Đầu tiên, hỗn hợp gia nhiệt ổn định 40oC, pH 8,5 (điều chỉnh NaOH 0,1N) trình thủy phân phụ phẩm bắt đầu thêm enzyme trypsin với tỷ lệ nồng độ enyme/cơ chất 2% (khối lượng/thể tích) tương ứng vào hỗn hợp Q trình thủy phân thực thời gian Lắc hỗn hợp với tốc độ 200 vòng/phút Sau thủy phân, làm bất hoạt enzyme trypsin 90oC 10 phút Đưa hỗn hợp ổn định 55oC, pH 8,0 (điều chỉnh NaOH 0,1N) sau bổ sung enzyme alcalase để tiếp tục thủy phân hỗn hợp Tỷ lệ nồng độ enzyme/cơ chất 2% (thể tích/thể tích) tương ứng với hoạt độ enzyme alcalase 35,62 UI/g Kết thúc trình thủy phân, enzyme alcalase bất hoạt cách xử lý hỗn hợp 90oC 10 phút, sau đưa hỗn hợp trở nhiệt độ phòng Tiến hành ly tâm dịch thủy phân phụ phẩm cá hồi với tốc độ 10.000 vòng/phút 15 phút 4oC, hỗn hợp phân tách thành phần riêng biệt, thu lấy dịch trong, loại bỏ tủa Dịch thủy phân phụ phẩm cá hồi sau thu nhận lọc hệ thống lọc tiếp tuyến Akta flux GE Healthcare với màng lọc kích thước 30 kDa nhằm loại bỏ protein chưa thủy phân protein có kích thước lớn, đồng thời giúp tập trung tăng hàm lượng peptide mạch ngắn dung dịch Dịch thủy phân sau lọc qua màng 30 kDa tiếp tục lọc tiếp qua màng 10 kDa Điện di kiểm tra dịch lọc trước sau màng 10kDa để kiểm tra kích thước phân tử dịch sau lọc điện di Tricine SDS-PAGE, kết thu hình 3.15 50 M: Color Marker Ultra Low Range (M.W 1,060 - 26,6 kDa, Sigma Aldrich C6210) 1: Mẫu dịch peptide < 10 kDa 2: Mẫu dịch peptide 10-30 kDa Hình 3.15 Điện di dịch thủy phân sau lọc qua màng 30 kDa 10 kDa Như kết điện di gel Tricine SDS-PAGE cho thấy, dịch thủy phân trước màng lọc 10 kDa có kích thước từ 10-30 kDa kết điện di vệt đậm dịch thủy phân sau màng lọc 10 kDa có kích thước nhỏ 10 kDa có vệt nhạt kích thước thấp Kích thước protein dịch thủy phân sau lọc tiếp tuyến lên kích thước so với dự tính 3.6 Thử nghiệm tạo bột peptide phương pháp sấy phun Phương pháp sấy phun có chi phí thấp, suất cao sử dụng rộng rãi công nghiệp thực phẩm Ở quy mô pilot, hiệu suất thu hồi sản phẩm quan trọng chúng tơi tiến hành khảo sát số thơng số cho q trình sấy phun nhiệt độ sấy, tốc độ nhập liệu, để thu suất tốt thu nhận sản phẩm Hệ thống sấy phun sử dụng APS Anhydro A/S (Đan Mạch) có suất tối đa 15L/mẻ 3.6.1 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ sấy Kết khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ sấy đến hiệu trình sấy ghi lại bảng 3.3 51 Bảng 3.3 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ sấy Thông số Áp suất khí nén 3,0 bar, tốc độ nhập liệu 727 ml/h Nhiệt độ (oC) 110 115 120 Độ ẩm sản phẩm 5,12 4,80 4,79 Hiệu suất thu hồi 79,24 81,43 75,79 Hoạt tính chống oxy hóa 24,24 24,35 21,16 Nhiệt độ sấy cao hay thấp gây bất lợi cho trình sấy peptide [49] Nhiệt độ khơng khí sấy thấp độ ẩm hạt vật liệu sấy cịn cao nên gây bám dính thiết bị, giảm hiệu suất thu hồi Ngược lại tăng nhiệt độ lên cao hiệu suất thu hồi giảm nước bốc nhanh, hạt tạo thành bị khô cháy, bám lên thành thành thiết bị, ngồi cịn ảnh hưởng đến màu sắc mùi vị sản phẩm Hoạt tính chống oxy hóa sản phẩm giảm tăng nhiệt độ sấy cấu trúc phân tử peptide bị ảnh hưởng nhiệt độ cao Như vậy, nhiệt độ sấy 115oC thích hợp để tiến hành thí nghiệm 3.6.2 Khảo sát ảnh hưởng tốc độ nhập liệu Kết khảo sát ghi lại bảng 3.4 Bảng 3.4 Khảo sát ảnh hưởng tốc độ nhập liệu Thơng số Áp suất khí nén 3,0 bar, nhiệt độ 115oC Độ ẩm sản phẩm 485 (10 rpm) 4,92 727 (15 rpm) 4,79 970 (20 rpm) 5,22 Hiệu suất thu hồi 78,12 81,42 73,32 Hoạt tính chống oxy hóa 24,10 24,36 23,76 Tốc độ dịng nhập liệu (ml/h) Tốc độ bơm nhập liệu tăng đồng nghĩa với thời gian lưu vật liệu sấy buồn sấy giảm ảnh hưởng tới hiệu sấy Khi tốc độ nhập liệu cao, thời gian lưu buồng sấy không đủ dài cho việc bốc hơi, dẫn tới độ ẩm sản phẩm tăng, phần hạt ẩm dính lại buồng sấy tăng lên, dẫn đến hiệu suất thu hồi giảm [49] Số liệu thực nghiệm cho thấy, hiệu suất thu hồi sản phẩm tăng nhẹ từ 78,12% tốc độ 485 ml/h lên 81,42% tốc độ 727 ml/h sau giảm xuống 73,32% tốc độ 970 ml/h Điều cho thấy hiệu suất thu hồi tốc độ 727 ml/h 52 tốt giá trị khảo sát Hoạt tính chống oxy hóa thí nghiệm khơng có khác biệt rõ ràng Vì chọn tốc độ nhập liệu 727 ml/h (15 rpm), 115oC cho thí nghiệm sau Hình 3.16 Hệ thống Hình 3.17 Sản phẩm bột peptide Hình 3.18 Bột cháy sấy phun dịch peptide từ phụ phẩm cá hồi dính vào thành thiết bị 3.7 Xây dựng quy trình thu hồi peptide chức Từ kết nghiên cứu thực đưa quy trình sản xuất thử nghiệm bột peptide có hoạt tính sinh học từ phụ phẩm cá Hồi Hình 3.19 Thuyết minh quy trình:  Xử lý nguyên liệu: Nguyên liệu sau mang phải rửa nước, loại bỏ phần mỡ thừa, xay nhỏ máy xay Sau xay đồng hóa với nước tỷ lệ 1:1 thiết bị gia nhiệt có cánh khuấy Hỗn hợp nguyên liệu sau vơ hoạt enzyme nhiệt độ 95ºC 15 phút Sau vô hoạt enzyme hỗn hợp để nguội, ly tâm 6000g 10 phút để loại bỏ chất béo  Thủy phân: + Thủy phân lần 1: Hỗn hợp thủy phân enzyme Trypsin, nhiệt độ 40ºC, pH 8,5 thời gian 120 phút với tỷ lệ enzyme bổ sung 2% Trong trình thủy phân định kỳ khuấy đảo chỉnh pH Sau bất hoạt enzyme nhiệt độ 95ºC 15 phút + Thủy phân lần 2: Sau thủy phân lần hỗn hợp thủy phân tiếp Alcalase, nhiệt độ 55ºC, pH thời gian 120 phút với tỷ lệ enzyme bổ sung 53 2% Trong trình thủy phân định kỳ khuấy đảo chỉnh pH Sau bất hoạt enzyme nhiệt độ 95ºC 15 phút Sản phẩm hỗn hợp peptide thủy phân tiếp tục cho phần tinh Dịch thủy phân sau lọc thơ vải lọc 100µm để loại bỏ phần chất rắn không tan  Lọc màng: Dịch peptide lọc lần cột lọc màng siêu lọc Lần dịch lọc qua cột lọc với kích thước màng 30kDa, sản phẩm sau lọc tiếp tục lọc lần với cột lọc kích thước 10kDa Dịch sau lọc vơ trùng tồn thùng chứa dịch sau lọc cần đảm bảo vệ sinh trước sử dụng  Sấy phun: Dịch sau lọc đưa sấy phun thiết bị sấy phun Dịch sấy nhiệt độ 115oC áp suất 3,0 bar, tốc độ dòng nhập liệu tương đương tốc độ bơm 15rpm Sản phẩm thu vào lọ kín nhằm tránh hút ẩm, định lượng vào bao bì đem đóng gói Các thao tác cần thực nhanh đảm bảo vệ sinh Sản phẩm đóng gói bao PA hút chân không 54 Nguyên liệu Rã đông, xay nhỏ Nước Phối trộn với nước: 1:1 (w/w) Bất hoạt enzyme nội (95oC, 15 phút) Ly tâm 6000v/phút, 10 phút Trypsin Chất béo Thủy phân lần (40oC; pH 8,5; 120 phút; E/S = 2%) Bất hoạt enzyme (95oC, 15 phút) Alcalase Thủy phân lần (55oC; pH 8; 120 phút; E/S = 2%) Bất hoạt enzyme (95oC, 15 phút) Lọc thô Chất rắn không tan Lọc phân đoạn lần (30kDa, 10kDa) Sấy phun (115oC, 3bar, tốc độ nhập liệu 727 ml/h) Bột peptide Hình 3.19 Quy trình cơng nghệ sản xuất bột peptide từ phụ phẩm cá hồi 55 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Phụ phẩm cá hồi có hàm lượng protein tổng số, lipit độ ẩm 30,21%; 17,74% 48,45% Phương pháp tách lipit gia nhiệt đạt hiệu suất 75,28% - Quy trình thủy phân phụ phẩm cá thu peptide có hoạt tính sinh học sau: phụ phẩm cá hồi sau tách mỡ nhiệt thêm nước tỷ lệ 1:1 (khối lượng/thể tích), tiến hành thủy phân Trypsin 2% pH 8,5, nhiệt độ 40oC giờ, thủy phân Alcalase 2% pH 8,0, nhiệt độ 55oC giờ, sau lọc tiếp tuyến qua màng 30kDa 10kDa Dịch thủy phân thu có hàm lượng amino acid đạt 29,48 mg/ml có hoạt tính chống oxy hóa xác định thơng qua khả qt gốc tự DPPH (SC) 70,34% - Điều kiện sấy phun dịch thủy phân 115oC, áp suất khí nén 3,0 bar, tốc độ nhập liệu 727 ml/h (tương đương tốc độ bơm 15 rpm) Kiến nghị - Nghiên cứu quy trình tinh để thu dịch peptide có hoạt tính sinh học đánh giá số hoạt tính sinh học hoạt tính liên kết canxi, chống stress - Nghiên cứu bổ sung peptide ứng dựng vào sản xuất thực phẩm chức 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO Adler-Nissen, J., (1986), "Enzymic hydrolysis of food proteins", Elsevier applied science publishers, Ahn, C.-B., J.-Y Je, and Y.-S Cho, (2012), "Antioxidant and antiinflammatory peptide fraction from salmon byproduct protein hydrolysates by peptic hydrolysis", Food Research International, 49, (1): p 92-98 Akiko, T.Y., et al., (2003), "Effect of various kinds of protease on fish sauce with salmon Oncorhynchus keta of the maturation", journal of the japanese society for cold preservation of food, 29, (1): p 17-23 Althunibat, O., et al., (2009), "In Vitro Antioxidant and Antiproliferative Activities of Three Malaysian Sea Cucumber Species", Amissah, J., (2012), "Bioactive properties of salmon skin protein hydrolysates", Department of Bioresource Engineering Macdonald Campus, McGill University, Montreal, Quebec Anh, H.K., (2007), "Hóa học thực phẩm", Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội AOAC, (1990), "Official Method of Analysis", Association of official analytical chemists,USA Arihara, K., (2006), "Strategies for designing novel functional meat products", Meat Science, 74, (1): p 219-229 Bernet, F., et al., (2000), "Diazepam-like effects of a fish protein hydrolysate (Gabolysat PC60) on stress responsiveness of the rat pituitary-adrenal system and sympathoadrenal activity", Psychopharmacology, 149: p 34-40 10 Bjørn Liaset, K.J., Marit Espe, (2003), "Chemical composition and theoretical nutritional evaluation of the produced fractions from enzymatic hydrolysis of salmon frames with Protamex", Process Biochem., 38: p 1747-1759 11 Bội, V.N., (2004), "Nghiên cứu trình thủy phân protein cá enzyme protease từ B.subtilis 5S", Luận án tiến sĩ sinh học, Trường Đại học Nha Trang 57 12 Chantachum, S., S Benjakul, and N Sriwirat, (2000), "Separation and quality of fish oil precooked and non-precooked tuna heads", Food Chemistry, 69: p 289-294 13 Di Bernardini, R., et al., (2011), "Antioxidant and antimicrobial peptidic hydrolysates from muscle protein sources and by-products", Food Chemistry, 124, (4): p 1296-1307 14 Erdmann, K., B.W.Y Cheung, and H Schröder, (2008), "The possible roles of food-derived bioactive peptides in reducing the risk of cardiovascular disease", The Journal of Nutritional Biochemistry, 19, (10): p 643-654 15 Girgih, A.T., et al., (2013), "Antioxidant properties of Salmon (Salmo salar) protein hydrolysate and peptide fractions isolated by reverse-phase HPLC", Food Research International, 52, (1): p 315-322 16 Gómez-Guillén, M.C., et al., (2011), "Functional and bioactive properties of collagen and gelatin from alternative sources: A review", Food Hydrocolloids, 25, (8): p 1813-1827 17 Guérard, F., et al., (2001), "Enzymatic hydrolysis of proteins from yellowfin tuna (Thunnus albacares) wastes using Alcalase", Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 11, (4): p 1051-1059 18 Hận, L.T., (2004), "Nghiên cứu thu chế phẩm enzyme protease từ nội tạng cá chẽm va ứng dụng sản xuất bột cá thực phẩm", Trường Đại học Nha Trang, Nha Trang 19 Harnedy, P.A.F., Richard J., (2012), "Bioactive peptides from marine processing waste and shellfish: A review", Journal of Functional Foods, 4, (1): p 6-24 20 Herpandi, H., et al., (2013), "Optimizing the Enzymatic Hydrolysis of Skipjack Tuna (Katsuwonus pelamis) Dark Flesh Using Alcalase Enzyme: A Response Surface Approach", Journal of Fisheries and Aquatic Science, 8: p 494-505 58 21 Hoskin, D.W and A Ramamoorthy, (2008), "Studies on anticancer activities of antimicrobial peptides", Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Biomembranes, 1778, (2): p 357-375 22 Hương, N.T.M., (2012), "Sản xuất sản phẩm thủy phân protein từ đầu cá ngừ vây vàng protease thương mại", Tạp chí Khoa học - Cơng nghệ Thủy sản, 2: p 25-30 23 I, N., et al., (2005), "Optimization of hydrolysis conditions for the production of threadfin bream (nemipterus japonicus) hydrolysate by alcalase", Journal of Muscle Foods, 16, (2): p 87-102 24 Joseph Thomas Ryan, R.P.R., Declan Bolton, Gerald F Fitzgerald, Catherine Stanton, (2011), "Bioactive Peptides from Muscle Sources: Meat and Fish", Nutrients, 3: p 765-791 25 Jung, W.-K and S.J Kim, (2007), "Ca-binding peptide derived from pepsinolytic hydrolysates of hoki (Johnius belengerii) frame", European Food Research and Technology, 224: p 763-767 26 Kim, S.-Y., J.-Y Je, and S.J Kim, (2007), "Purification and characterization of antioxidant peptide from hoki (Johnius belengerii) frame protein by gastrointestinal digestion", The Journal of Nutritional Biochemistry, 18: p 318 27 Kołodziejska, I., et al., (2008), "Effect of extracting time and temperature on yield of gelatin from different fish offal", Food Chemistry, 107: p 700-706 28 Kristinsson Hordur G and R B.A., (2000), "Fish protein hydrolysates: production, biochemical and functional properties", Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 40 (1): p 43 29 Lam, T.B., (2012), "Tổng quan peptide có hoạt tính sinh học", Đại học Bách Khoa Hồ Chí Minh 30 Lệ, N.V., (1996), "Nghiên cứu sử dụng protease đầu tôm chế biến thủy sản", Luận án phó tiến sĩ khoa học sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội 59 31 Lian, P., C.M Lee, and E Park, (2001), "Optimization of Enzyme-Assisted Squid Flavor Production Using an Orthogonal Array Method", Journal of Aquatic Food Product Technology, 10, (1): p 19-32 32 Luyến, T.T., (2016), "Các phản ứng biến đổi thực phẩm q trình cơng nghệ", Nhà xuất Nơng nghiệp, TP.Hồ Chí Minh 33 Mellander, O., (1950), "The physiological importance of the casein phosphopeptide calcium salts II Peroral calcium dosage of infants", Acta Societatis Medicorum Upsaliensis, 55, (5-6): p 247-255 34 MK, D and A D, (2012), "Pharmaceutical applications of bioactive peptides", OA Biotechnology, 1, (2): p 35 Ninh, Đ.V., (2004), "Nghiên cứu trình thủy phân cá enzymenội tạng cá, mực thử nghiệm sản xuất sản phẩm từ protein thủy phân", Luận văn thạc sỹ kỹ thuật, Trường ĐH Thủy sản Nha Trang 36 Nongonierma, A.B and R.J Fitz Gerald, (2016), "Strategies for the discovery, identification and validation of milk protein-derived bioactive peptides", Trends in Food Science & Technology, 50: p 26-43 37 O' Meara, G.M and P.A Munro, (1984), "Effects of reaction variables on the hydrolysis of lean beef tissue by alcalase", Meat Science, 11, (3): p 227-238 38 Opheim, M., et al., (2015), "Hydrolysis of Atlantic salmon (Salmo salar) rest raw materials—Effect of raw material and processing on composition, nutritional value, and potential bioactive peptides in the hydrolysates", Process Biochemistry, 50, (8): p 1247-1257 39 Rutherfurd-Markwick, K.J.M., P.J, (2005), "Bioactive peptides derived from food", J AOAC Int, (88): p 955-966 40 S.M, K., (1999), "Manufacture of fish hydrolyzate by enzyme", Korean Journal of Food Science and Technology, 31, (3) 41 Sarah Md Seniman, M., S Mohamad Yusop, and A Babji, (2014), "Production of enzymatic protein hydrolysates from freshwater catfish (Clarias batrachus)", 60 42 Schägger, H and G von Jagow, (1987), "Tricine-sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from to 100 kDa", Analytical Biochemistry, 166, (2): p 368-379 43 See S., H.L., and Babji A.S, (2011), "Optimization of enzymatic hydrolysis of salmon (Salmo salar) skin by Alcalase", International Food Research Journal, 18: p 1359-1365 44 Shahidi, F and Y Zhong, (2008), "Bioactive Peptides", Journal of AOAC International, USA 45 Singh, B.P., S Vij, and S Hati, (2014), "Functional significance of bioactive peptides derived from soybean", Peptides, 54: p 171-179 46 Slizyte, R., et al., (2016), "Bioactivities of fish protein hydrolysates from defatted salmon backbones", Biotechnology Reports, 11: p 99-109 47 Sprague, M., J.R Dick, and D.R Tocher, (2016), "Impact of sustainable feeds on omega-3 long-chain fatty acid levels in farmed Atlantic salmon, 2006– 2015", Scientific Reports, 6: p 21892 48 Suthasinee Nilsang, S.L., Manop Suphantharika, Apinya Assavanig, (2004), "Optimization of enzymatic hydrolysis of fish soluble concentrate by commercial proteases", Journal of food engineering, 70, (4): p 571-578 49 T Himonides, A., A K D Taylor, and A J Morris, (2011), "Enzymatic Hydrolysis of Fish Frames Using Pilot Plant Scale Systems", 50 Bộ Nông nghiệp phát triển nông thôn, (2015), "Quy hoạch phát triển cá nước lạnh đến năm 2020, tầm nhìn 2030", 51 Trúc T.T., Tuấn V.N , Minh V.T.A., Mười N.V., (2015), "Nghiên cứu khả thủy phân dịch protein thịt đầu tôm sú enzyme protease nội tại", Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 37: p 39-46 52 Tú, L.N., (2002), "Hóa Sinh Cơng Nghiệp", Nhà xuất Khoa học kỹ thuật, Hà Nội 53 Tylingo, R and S Mania, (2016), "Isolation and Characterization of Acid Soluble Collagen from the Skin of African Catfish (Clarias gariepinus), 61 Salmon (Salmo salar) and Baltic Cod (Gadus morhua)", Journal of Biotechnology & Biomaterials, 6, (2): p 1-6 54 Vermeirssen, V., J.V Camp, and W Verstraete, (2007), "Bioavailability of angiotensin I converting enzyme inhibitory peptides", British Journal of Nutrition, 92, (3): p 357-366 62 ... thực phẩm chức Đây sở để chúng tơi lựa chọn đề tài "Nghiên cứu thu nhận peptide mạch ngắn có hoạt tính sinh học từ phụ phẩm cá hồi " Nội dung bao gồm: - Nghiên cứu xử lý nguyên liệu phụ phẩm cá hồi. .. liệu phụ phẩm cá hồi dùng cho thu hồi peptide có hoạt tính sinh học 33 3.2 Nghiên cứu lựa chọn chế phẩm protease thương mại để thủy phân giới hạn phụ phẩm cá hồi thu peptide sinh học. .. học Tuy nhiên có vài sản phẩm thực phẩm từ thịt thủy sản thu peptide có hoạt tính sinh học có tính thương mại [24] Các peptide có hoạt tính sinh học thu có nhiều chức sinh lý khác chống oxy hóa,