Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và năng lực trí tuệ của học sinh từ 6 đến 17 tuổi người dân tộc Kinh H’mông Dao ở tỉnh Yên Bái

Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và năng lực trí tuệ của học sinh từ 6 đến 17 tuổi người dân tộc Kinh H’mông Dao ở tỉnh Yên Bái Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và năng lực trí tuệ của học sinh từ 6 đến 17 tuổi người dân tộc Kinh H’mông Dao ở tỉnh Yên Bái luận văn tốt nghiệp thạc sĩ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TƢ̣ NHIÊN Phạm Kiên Cƣờng NHÂN DÕNG VÀ BIỂU HIỆN TRÊN BỀ MẶT BÀO TỬ Bacillus subtilis GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN VP28 CỦA VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TÔM LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội, 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TƢ̣ NHIÊN Phạm Kiên Cƣờng NHÂN DÕNG VÀ BIỂU HIỆN TRÊN BỀ MẶT BÀO TỬ Bacillus subtilis GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN VP28 CỦA VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TƠM Chun ngành: Hóa sinh học Mã số: 62 42 01 16 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS Phan Tuấn Nghĩa PGS.TS Nguyễn Thị Vân Anh Hà Nội, 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan là công trin ̀ h nghiên cƣ́u mà th ực dƣới hƣớng dẫn GS.TS Phan Tuấn Nghĩa PGS.TS Nguyễn Thị Vân Anh Các số liê ̣u, kế t quả nêu luâ ̣n án là trung thƣ̣c và chƣ a tƣ̀ng đƣơ ̣c công bố bấ t kỳ công trình khác NCS Phạm Kiên Cường LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến GS.TS Phan Tuấn Nghĩa, PGS.TS Nguyễn Thi ̣ Vân Anh , người thầy tận tình dìu dắt, hướng dẫn, động viên khích lệ tạo điều kiện tốt cho tơi suốt q trình làm luận án nghiên cứu sinh Tôi xin chân thành cảm ơn đến tồn thể q thầy, Bộ mơn Sinh lý thực vật Hóa sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên truyền đạt cho kiến thức quý báu suốt thời gian học tập nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi Cấp ủy thủ trưởng Viện Công nghệ mới, Viện Khoa học Công nghệ Quân sự, anh chị bạn bè đồng nghiệp Viện Công nghệ mới, thành viên nhóm nghiên cứu Phịng Protein tái tổ hợp Phòng Sinh học nano ứng dụng, tḥc Phịng Thí nghi ệm trọng điểm Cơng nghê ̣ Enzym Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tôi xin gửi lời cảm ơn đ ến Ban Giám hiệu, Phòng Sau Đại học , Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh học và các Phòng ch ức Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điề u kiê ̣n cho tơi h ọc tập, hồn thành thủ tục cần thiết nghiên cứu sinh Tôi xin chân thành cám ơn đến TS Đặng Thị Lụa, Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản I TS Trần Thị Tuyết Hoa, Khoa Thủy sản Trường Đại học Cần Thơ nhiệt tình giúp đỡ, cung cấp chia sẻ thơng tin q trình thử ng hiê ̣m ứng dụng thực tế sản phẩm đề tài luận án Luận án thực với tài trợ kinh phí đề tài thuộc chương trình Trọng điểm cấp nhà nước Bộ Khoa học Công nghệ tài trợ, mã số KC.04.09/11-15 thân hỗ trợ kính phí làm thực nghiệm với tư cách nghiên cứu sinh đề tài Tơi xin chân thành bày tỏ lịng biết ơn tới bố , mẹ, vợ, con, gia đình, người bên tôi, cổ vũ, động viên và tạo điề u kiê ̣n tḥn lợi cho tơi có thời gian học tập, nghiên cứu hoàn thành luận án NCS Phạm Kiên Cường MỤC LỤC Trang MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIÊU ̣ VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH MỞ ĐẦU 11 CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 14 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TÔM .14 1.1.1 Vị trí phân loại virus gây bệnh đốm trắng tôm .14 1.1.2 Cấu trúc WSSV 16 1.1.3 Hệ gen WSSV 22 1.1.4 Bệnh đốm trắng WSSV gây tôm .28 1.1.5 Chẩn đoán WSSV 32 1.2 NGHIÊN CỨU TẠO VACCINE DỰA TRÊN KHÁNG NGUYÊN VỎ WSSV 34 1.2.1 Một số biện pháp phòng chống WSSV 34 1.2.2 Protein VP28 nghiên cứu tạo vaccine phòng WSSV 40 1.2.3 Các protein bề mặt khác nghiên cứu tạo vaccine phòng WSSV 46 1.3 BÀO TỬ B subtilis VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN NGOẠI LAI TRÊN BỀ MẶT BÀO TỬ TRONG NGHIÊN CỨU TẠO VACCINE .48 1.3.1 Bào tử B subtilis đặc tính hình thành bào tử .48 1.3.2 Một số protein bề mặt B subtilis 50 1.3.3 Biểu protein ngoại lai bề mặt bào tử 52 2.1 NGUYÊN LIỆU 54 2.1.1 Mẫu tôm thử nghiệm .54 2.1.2 Các hoá chất nguyên vật liệu 54 2.2 MÁY MÓC VÀ TRANG THIẾT BỊ 56 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 56 2.3.1 Thu nhận virus gây bệnh đốm trắng từ mẫu tôm nhiễm bệnh 56 2.3.2 Nuôi cấy tạo bào tử B subtilis 56 2.3.3 Tách chiết, định lƣợng DNA 57 2.3.4 Nhân dòng, biểu VP28 E coli B subtilis 60 2.3.5 Phát hiện, định lƣợng tinh VP28 64 2.3.6 Thử nghiệm khả phòng WSSV bào tử B subtilis tái tổ hợp 68 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 72 3.1 NHÂN DÕNG, XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ VÀ MỘT SỐ ĐẶC TRƢNG CỦA GEN vp28 TỪ CÁC MẪU WSSV THU NHẬN Ở VIỆT NAM .72 3.1.1 Nhân bản đoa ̣n gen mã hóa VP28 bằ ng PCR 72 3.1.2 Nhân dòng gen mã hóa VP28 vào vector pGEM-T 74 3.1.3 Xác định trình tự nghiên cứu tính đa hình gen mã hóa VP28 .75 3.2 NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA VP28 79 3.2.1 Biể u hiê ̣n VP28 hệ thống vector pET28b E coli 79 3.2.2 Biểu VP28 dạng dung hợp với protein CotB bề mặt bào tử B subtilis .84 3.3 KHẢ NĂNG PHÕNG BỆNH ĐỐM TRẮNG TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG CỦA BÀO TỬ B subtilis BIỂU HIỆN VP28 TRÊN BỀ MẶT 99 3.3.1 Sự tồn bào tử B subtilis biểu VP28 ruột tôm thẻ chân trắng 99 3.3.2 Khả kích thích miễn dịch tôm thẻ chân trắng bào tử B subtilis biểu VP28 102 3.3.3 Đánh giá khả bảo hộ tôm thẻ chân trắng bào tử tái tổ hợp .105 KẾT LUẬN .114 KIẾN NGHỊ 114 DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN .115 TÀI LIỆU THAM KHẢO .116 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT BCIP 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate BSA Albumin huyết bò (Bovine Serum Albumin) Cm Chloramphenicol dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate DSM Môi trƣờng tạo bào tử Difco (Difco Sporulation medium) EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid GST Glutathione S-transferase IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside kDa Kilodalton LB Luria Bertani NBT p- nitro blue tetrazolium chloride PAGE Điện di gel polyacrylaminde (Polyarylamide Gel Electrophoresis) PBS Muối chứa đệm phosphate (Phosphate Buffered Saline) PCR Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction) PVDF Polyvinylidere Fluoride SDS Sodium Dodecyl Sulphate GST Glutathione S-transferase TSA Tryptic Soy Agar TTFC Phân đoạn đầu C độc tố uốn ván (C- terminal fragment of the tetanus toxin) WSSV Virus gây bệnh đốm trắng (White Spot Syndrome Virus) DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Tên gọi virus gây bệnh đốm trắng qua giai đoạn 15 Bảng 1.2: Các gen mã hóa protein cấu trúc WSSV 26 Bảng 1.3: Một số giáp xác nhiễm bệnh đốm trắng 30 Bảng 1.4: Các chiến lƣợc vaccine chống WSSV để bảo vệ tôm 46 Bảng 1.5: Một số protein lớp áo bào tử vi khuẩn B subtilis 51 Bảng 2.1: Trình tự các cặp mồi sƣ̉ du ̣ng nghiên cƣ́u nhân bản và biể u hiê ̣n gen vp28 55 Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR .59 Bảng 2.3: Thành phần phản ứng Real-time PCR 60 Bảng 2.4: Thành phần gel cô gel tách acrylamide SDS-PAGE 66 Bảng 1: Các mẫu tôm nhiễm WSSV thu nhận từ các địa điểm khác 72 Bảng 3.2: Một số sai khác trình tự nucleotide acid amin VP28 thu nhận Việt Nam so với trình tự công bố (AY168644) 78 Bảng 3.3: Sự hình thành sinh khối bào tử B subtilis tái tổ hợp số môi trƣờng khác .95 Bảng 3.4: Sự hình thành bào tử tái tổ hợp môi trƣờng DSM các thời gian khác 96 Bảng 3.5: Độ sống vi khuẩn mẫu thức ăn trộn bào tử B subtilis biểu VP28 100 Bảng 3.6: Số copy dung dịch WSSV 107 DANH MỤC HÌ NH Hình 1.1: Vị trí WSSV phát sinh chủng loại [124] 16 Hình 1.2: Cấu trúc virion WSSV dƣới kính hiển vi điện tử [54] .17 Hình 1.3: Hình ảnh mô ruột tôm (Procambarus clarkii) sau 48 lây nhiễm WSSV dƣới kính hiển vi điện tử .17 Hình 1.4: Vị trí các protein cấu trúc WSSV [97] .18 Hình 1.5: Cấu trúc liên kết màng VP19, VP24, VP26, VP28 VP51A [21] 19 Hình 1.6: Mô hình 3D phức hợp protein vỏ xuyên màng [21] 19 Hình 1.7: Mô hình tổ chức hệ gen DNA vịng sợi đơi WSSV-CN .23 Hình 1.8: Bản gel SDS-PAGE 12% nhuộm Coomassie Brilliant Blue (CBB) protein vỏ WSSV (EP) protein lõi nucleocapsid (NP) [120] .25 Hình 1.9: Tôm sú bị bệnh đốm trắng, dƣới vỏ đầu ngực thấy rõ các đốm trắng [6].28 Hình 1.10: Sơ đồ hệ thống miễn dịch ở tôm [98] .35 Hình 1.11: Cơ chế kích thích miễn dịch khơng đặc hiệu tơm bị kích thích β-glucan [3] 36 Hình 1.12: Cấu trúc không gian protein VP28 [97] 42 Hình 1.13: Hình dạng nội bào tử B subtilis [27] .48 Hình 1.14: Cấu tạo nội bào tử B subtilis [27] .49 Hình 1.15: Mô hiǹ h bi ểu protein ngoa ̣i b ề mặt bào tử B subtilis sử dụng protein lớp áo bào tử Protein dung hợp gồm phần màu xanh dƣơng protein chuyên chở phần màu hồng protein ngoại lai [74] 52 Hình 3.1: Nhân vp28 PCR từ các mẫu tôm nhiễm WSSV các địa điểm 73 Hình 3.2: Điện di gel agarose sản phẩm PCR kiểm tra có mặt vp28 các thể biến nạp sử dụng cặp mồi pGEM Fw/Rv cặp mồi VP28.1 Fw/Rv 74 Hình 3.3: So sánh mức độ tƣơng đồng trình tự nucleotide gen vp28 từ các mẫu WSSV thu thâ ̣p đƣơ ̣c và trình tƣ̣ vp28 Việt Nam đã công bố trƣớc (AY168644) 77 Hình 3.4: Điện di gel agarose sản phẩm cắt vector biểu vector nhân dòng mang gen vp28 enzyme giới hạn sau tinh 80 Hình 3.5: Điện di sản phẩm PCR kiểm tra có mặt gen vp28 các khuẩn lạc 80 Hình 3.6: SDS-PAGE (A) thẩm tách miễn dịch (B) kiểm tra biểu VP28 E coli .81 Hình 3.7: SDS-PAGE (A) thẩm tách miễn dịch (B) kiểm tra độ tinh VP28 83 Hình 3.8: Điện di sản phẩm cắt giới hạn pDG364-cotB-gst-sep, pDG364-cotB, pGEM-vp28 với hai cặp enzyme EcoRI HindIII 86 Hình 3.9A: Điện di sản phẩm PCR kiể m tra các khuẩ n la ̣c t đĩa thạch biến nạp sản phẩm gắn gen mã hóa VP28 pDG364-cotB bằ ng că ̣p mờ i vp 28, cotB pDG364 .87 Hình 3.9B: Điện di sản phẩm PCR kiể m tra các khuẩ n la ̣c t đĩa thạch biến nạp sản phẩm gắn gen mã hóa VP28 pDG364-cotB-GST bằ ng că ̣p mồ i pDG 364 vp28 88 Hình 3.10: Kiểm tra có mặt gen dung hợp DNA hệ gen B subtilis .89 Hình 3.11: Kiểm tra có mặt gen cotB-vp28 hệ gen B subtilis 90 Hình 3.12: Bào tử quan sát dƣới kính hiển vi 91 Hình 3.13: SDS-PAGE (A) thẩm tách miễn dịch (B) kiểm tra biểu VP28 bào tử B subtilis .92 Hình 3.14: Ảnh chụp phân tích miễn dịch huỳnh quang kiểm tra biểu CotB-VP28 CotB-GST-VP28 bề mặt bào tử B subtilis 94 Hình 3.15: Mức độ bền nhiệt bào tử tái tổ hợp 96 Hình 3.16: Mức độ bền với muối bào tử tái tổ hợp 97 Hình 3.17: Mức độ bền với pH bào tử tái tổ hợp .98 Hình 3.18: Thức ăn tôm thẻ chân trắng sau trộn bào tử B subtilis dạng dại PY79 dạng tái tổ hợp cotB-VP28 hay cotB-GST-VP28 99 ... 297 VP36A wsv3 06 419 VP39A wsv311 204 VP 26 wsv442 800 VP95 wsv037 1280 VP 160 B wsv214 80 VP15 wsv220 67 4 VP 76, VP136A wsv271 1218 VP1 36, VP136A wsv289 1 565 VP 160 A, VP190 wsv308 466 VP 466 , VP51C,... 35 36 37 38 39 40 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 wsv 259 309 VP38A, VP38 wsv 321 117 VP13B, VP 16 wsv 325 465 VP60A, VP 56 wsv 327 8 56 VP90 wsv 339 283 VP39B, VP39 wsv 340 261 VP31 wsv 3 86 68 VP68,... Met và Val [108] Nghiên cứu Wang tập thể [113] cho thấy các vị trí định kháng nguyên VP28 từ gốc acid amin 28 đến 67 , 87 đến 93 từ 171 đến 204 Trong hầu hết các nghiên cứu tạo vaccine phịng