Nấm men công nghiệp lương đức phẩm

THƯV!ỆN ĐẠI HỌC NHA TRANG ‫ ا‬ƯƠN‫ ج‬ĐỨC PHẨM ٠^ M 6 561 ‫ ا‬Ph NẤM MEN CỔNGNGHÌỆP 3000011648 Ш N H À X U Ấ T B Ả N K H O A HỌC ٧ À K Ỹ THUẬT \ ١ LƯƠNG Đ ỨC PHẨM ]^ẤM MEN CÔNG NG H IỆP ٠ ٠ fKiiJ[jD;jẠl ‫؛‬ T H Ư V ẫ E i\i h\ NHÀ XUẤT BẢN KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT HÀ NƠI í LỜI NỚIĐẨl Nđm men nl^óm ١)‫ ؛‬sinh vật gần g với lồi, ngirờl tỉc.xKa đến ‫اا‬0 ‫ﻻ‬ Cốc sả/ì pliẩrn chiuìg, iìhư rượii, hia, rượu vaiìg ỉìlĩiềtỉ dang đồ uống khác ngày càììg ììììiềii VCÌ dưcĩng clỉirơ đáp lOìg Jii nhu cáu cCia nglCỜÌ Ngoai ra, tế bồo nđm men rổt giàu protein - c٥١l ỉà irguồn protein đơn bào (SCP ١ rát qui gió Hiện ‫\ل‬0‫ ﻻ‬nguồỉt >\0‫ ﻻ‬đattg la ngu(.ồn dlttb dưỡng gldn tlê'p qua cbdn ituOl tới COÌI ítgườl 1‫ ﻻا‬vọng rầng tlrờl gian kltOng xa nguồn protein tinh tách từ nấm ìnen cho chihìg ta fihu:ng' ân nhan tao giong sản phẩm thịt, cá, trứng vcì ĩa(ơ:ng lai ngành sản xuất vơ cìing rộng lớn Cuố)i sách dược biên soqn ١١hâm cung cổp hiến thực co' bdn sinh họv cim nấm men sở cơtìg nglĩệ để dưa nấm men vâo s^ảỉii xiui't côỉỉg ngluệp DỐI tượng sách sltth vlCn ndm cuối củc trrtịng cao dẳng đạí học có liên quan đến vi sinh vật ١١،‫ ؛‬cơng ỉiglìệ V‫ ؛‬sirỉỉh vật, học viên lớp cao học sinh học nlvừng al quait td١١١dến vàn dê ‫ﻹةاا‬٠ Biên soan sách ìỉày cln lù cịn nhrcng sai sót, tác giả chan thành cảm ơn nlĩững ‫ ز‬kiếỉỉ dóng góp CỊỈIÍ hau cua bạn àọc Jỉà Nội tháng năm 2005 T ácgỉả PGS TS Lương Đức Phẩm PHẦN THỨ NHẤT ĐẠI CƯƠNG VỂ NẤM MEN Chương PHÂN LOẠI VÀ HÌNH THÁI NẤM MEN 1.1 PH ÂN LOẠI N Ấ M M EN Từ cổ xưa lồi người biết nấu rượu Tác nhân chuyển hóa đường thành rượu loại nấm men thường gọi men rượu Theo hệ thống phân loại nấm men thuộc vào giới nấm {Kitìgdoììĩ Fungi theo Whitaker, 1969; Takhtakjan, 1970) Fungi bắt nguồn từ chữ la tinh Fungus có nghĩa nấm, dùng Mycetes bắt nguồn từ chữ Hy Lạp Mukes Nấm men nhóm nấm thể đơn bào tập hợp đơn bào, nhân chuẩn, hiển vi Nấm men thuộc hai lớp nấm: nấm túi {Ascomycetes) nấm bất toàn {Deuĩero- mecetes Fungi imperfect) Xem sơ đồ phân loại nấm trang sau 1.1.1 Tiêu chí phân lọaỉ nấm men Đơn vị phân loại nấm men sản xuất lên men nòi chủng Đây tế bào chủng lồi xác định Các nịi (chủng) hợp thành loài {Species), loài hợp thành giống {genus, genera), giống hợp thành lìọ (xem sơ đồ) Đ ể xác định giống vi sinh vật nói chung cách xác ta phải thực hàng loạt thí nghiêm phức tạp mât nhiều thòi gian để cổ hiểu biết sâu sắc đặc điểm sinh học giúp ta có chẩn đốn đắn Có hai dấu hiệu hay đặc điểm chẩn đốn học là: hình thái ni cấy Trong tài liệu thường mơ tả hình thái loài chủng, lài liệu công nghệ sản xuất cụ thể thường mổ tả chi tiết nòi (hay chủng) dùng sản xuất thường gọi chủng sản Nấm men lồi giống nấm men thuộc hai nhóm nấm: nhóm nấm túi tạo thành bào tử gộp chung vào lớp nấm túi (Ascospor) nhóm nấm khơng tạo thành bào tử - lớp nấm khơng hồn thiện {Fungi imperfect) hay cịn gọi lớp nấm bất tồn Các nhà khoa học Xô Viết trước thường phân loại giống loài nấm sinh bào tử theo hệ thống Kudryavxeva (1954) với nấm men nói chung theo hệ thống phân loại J L odder(1970) Eumycophyta (nấm) Ascomycetes (Pungi imperíect) Deuteromycetes Endomycetes Endomycetaceae Endomyces Giới Lớp M oniliales Saccharomycetaceae Cryptoccaceae Saccharomyces Schiĩosaccìioromyces Zygosaccharomyces CìyĩocociiS Mycodenna Piclìia ٤ Candida ٠ Debaryomyces Rììodoĩoriiỉaceae Rhodotorula Họ Giống Kìoeskera ^ Toruiaspora Hasemda * Bơ Georichurn ^ Trichosponim X Lồi Chủng (nịi) Sơ đổ phán loại nấm men (theo w Carol Eratier) Nấm men tạo thành màng; Nấm men hỉnh chuỳ; Nấm men tạo thành khuẩn ti thật khuẩn ti giả Qua sơ dồ phân lơạl nấm ٠ Lớp nấm w Cam! Frarier ta thấy: ĨỈÁỈ nấm sinh bào tử nang hay gọi nấm thật Dưới lớp gồm nấm dơn bào {unicellomyceteles) Dây nấm men Dưới họ SchizosaccharO' mycetaceae ١6‫؟‬r t v c k \;‫؟‬T\‫>؟‬Saccharomycodes١Sackìra١HQnsen\aspora١Nasodia Phần lớn nấm men dược sử dụng cơng nghiệp thuộc giống Saccìiarotnyces lớp nấm tUi vài gíống thuộc lớp nấm bất tồn GiOng Endonìyces vernalis loài nấm men dùng chiê'n thứ dể tổng hợp chất béo ٠ Giống Saccharornyces, quan trọng nhát loài Saccharomyces cerevisiae, dược dùng nhiều cồng nghỉệp thực phẩm Một số chủng nấm meir dUng làm men nơ bánh mì, số khác dUng công nghiệp rượu, b،a١ rượu vang, sản xuất glyxerol enzym invertaza Saccharomyces fragilis lên men dương lactoza dOng vai trò quan trọng sản xuất sữa sản phẩm sữa co lẽ tương lai loài người trOng cậy vào giống nấm men dể thu nhận cồn tuyệt dối từ nguyên liệu tái tạo dược dể thay xăng dẩu mỏ trái dít bị cạn kiệt ٠ GiOng Zygosaccharomyces Một vài tác giả coi giống giống phụ giống Saccharomyces Các lồí giống phát triển dịch dường nồng độ cao làm hOng mật sirO z nusbarumeri dược tim thấy mật Các loài tham gia vào lên men rượu vang dặc biệt lên men dậu tưcmg làm thành thứ dồ uống dặc biệt ٠ Cắc giống Piclìia) Haseniila) Debaryomyces giống Mycodenna} Candida nấm men khOng hlnh thành màng mặt dlch nuồi cấy phát triển bề mặt dlch ướp chua dưa chuột loại rau ChUng o.xy hóa chất hữu làm giảm độ chua làm tang pH d ‫إ‬ch ướp Hasenida Pechia chĩu dựng độ cồn cao oxy hóa rượu etylic Debaryotnyces chịu dược muối cao dặc biệt phomat có muOi tới 24% thấy men phát triển Nấm men tạo màng khOng sản sinh rượu etylic từ dường Giống Sacclìaromycodes Hansenida spora có hình chanh, cUng men giả Kloeckera khOng sinh bào tử có tế bào hình chuy Những giống men làm hỏng rư^i ١ dặc biệt mùi rượu vang ٠ Lớp men giả gọi lớp men khOng hoàn toàn thuộc lớp nấm bất toàn (Fungi imperfect hay Deiiteromycetes) Nấm lớp khOng tạo thành bào tử Thuộc lớp có Mo١iia lcs% m l ١vọ\aC t ٠yptococcQceaeN^RhodorulaceQe ٠ Họ Cryptococcaceae hay Crvpĩoccoides gồm giống CryptoccocuS) ToriilopsiS) Pityrosporu?n١Bvtanomyces١CaudidaJrigonopsìs١Rhodotorulua 1.1.2 Phân loai nấm men sỏ di truyền Phương pháp phân loại vi sinh vật nói chung phân loại nấm men dựa sở nghiên cứu hình thái tế bào khuẩn lạc ١các dặc tinh sinh học khác bị hạn chế vỉ phải làm thi nghiệm đặc biệt khó xác định xác chủng loại gần Do việc phân loại chùng giống nấm men hay vi sinh vật nói chung dựa sở cấu trúc phân tử phương pháp tỏ hữu hiệu áp dụng phịng thí nghiệm phân loại vi sinh vật Có phương pháp phân loại theo sở cấu trúc phân tử cùa tế bào: - Phương pháp đánh dấu ADN (ADN finger printing) Phương pháp sử dụng mẫu dị phóng xạ để nhận băng ADN đặc trưng cho cá thể riêng biệt kỹ thuật thẩm tích Southern Blotting Cơng việc tiến hành trước lai với mẫu dò Mẫu ADN cần lai cắt enzym giới hạn cần chuyển từ agaroza sang lớp màng nitro xenluloza nylon đo chúng có kích thước lớn có khả liên kết với AD N tốt Quá trình chuyển ADN lên bề mặt lớp thích hợp làm cho liên kết với ADN sợi đơn tạo giá đỡ bền vững Mẫu dò trước lai với ADN cần đánh dấu để phát chúng màng Trước sử dụng sợi kép ADN biến tính nhiệt để tạo sợi đơn Các sợi đơn dễ dàng bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung với sợi đơn khác lớp màng để tạo thành sợi kép ổn định Quá trình lai ghép thường tiến hành qua đêm sau lớp màng rửa để loại bỏ sợi thừa liên kết yếu Chất để đánh dấu dùng chất đồng vị phóng xạ, đồng vị phospho-32 Gần người ta hay dùng chất đánh dấu steroit digoxigenin thực vật (DIG) Sợi ADN đánh dấu DIG xác định phản ứng so màu Quá trình lai ghép sợi ADN qua bước sau (xem hình 1.1): 1.Thu nhận tế bào màng bọc Bổ sung ADN đánh dấu Phân huỷ nhận tế bào tách ÁDN Bẻ gãy ADN chuyển lên màng Lai đoạn mối đánh dấu với ADN tương ứng nấm men Hình 1.1 Lai ADN chủng nấm men theo phưcmg pháp đánh dấu - Phương pháp phán tích nhiễm sắc ĩlỉể Phương pháp dựa sở điện di cĩể phân cắt loàn thể nhiẻm sắc kích cỡ chúng Các gen đơn bội Sccharomyces chứa 16 thể nhiêm sắc có kích thước khác Chúng tách thành băng riêng rõ dung dịch ethidiumbrome C2iH 2()BrN3 ánh sáng tử ngoại Một số giống nấm men đơn bội có 16 bảng, giống nấm men lưỡng bội thường có sị' băng nhiều Với cách ta dẻ dàng nhận biết khác giống nghiên cứu với giống chuẩn có tĩong phịng thí nghiệm dùng sản xuất - Phương pháp PCR Kỹ thuật PCR phưctng pháp nhân đoạn ADN đặc hiệu hay gọi phản ứng chuỗi trùng hợp Cơ sở phương pháp dựa vào đặc tính hoạt động enzym ADN polymeraza có khả tổng hợp mạch từ khuôn kể từ mồi cặp sẩn với khn Mồi trình tự bổ sung chun biệt cho đoạn ADN cần tổng hợp Quá trình gồm bước: biến tính phân tử, bắt cặp mồi với khn tổng hợp mạch Mổi q trình coi chu kỳ cầc chu kỳ ìặp lại nhiểu lần (hình 1.2 1.3) ADN đích B Chu kỳ Biến tính 94 ٠c Bát cặp mối 55°c D E K éo dài mơì C Chu kỳ 5. Ậ 25 - 40 chu kỳ Hình 1.2 Phương pháp PCR Hình 1.3 Phân loại chủng nấm rnen phương pháp PCR: A, Chủng nấm men mới; B Chủng nấm men dại; c Chủng nấm men chìm; D ADN đối chứng 1.2 HÌNH THÁI VÀ CÂU TẠO TẾ BÀO NẤM MEN 1.2.1 Hỉnh thái Tế bào nấm men có hình dáng: hình cầu, hìnf ovan elíp ٢;hình chanh, hình trụ, hình chuỳ hốc đơi cịn kéo dài thành sợi Nấm men thay đổi hình dáng kích thước giai đoạn phát triển điểu kiện môi trường xung quanh Hình thái chúng khơng thay đổi giống ni cấy cịn trẻ môi trường dinh dưỡng tiêu chuẩn So với vi sinh khác (đối với vi khuẩn chẳng hạn) tế bào nấm men có kích thước tưcmg đối lớn: đường kính khoảng pm; chiều dài ịxm (1 pm - micron mét = 10 ^ m) Với kích thước ta ước tính bề mặt tế bào nấm men lít dịch lên men vào khoảng 10 m^ cường độ trao đổi chất tế bào nấm men với môi trường xung quanh vô to lớn Khối lượng nấm men 500 kg so với trâu bò khối lượng ngày đêm nấm men tổng hợp 50 protein, trâu bò lổng hợp 0,5 kg (như gấp 100 lần) Trọng lượng riêng :ủa tế bào nấm men không khác so với tế bào vi khuẩn (ở nấm men số 1.055 “ 1.060, vi khuẩn: 1,050 - 1,112) Hình dáng tế bào nấm men giới thiệu hình 1.4 Hinh L4 Hình thái tế bào nấm men 1.2.2 Cấu tạo tế bào nâ'm men Nấm men sinh vật đcfn bào hiển vi, tế bào giống động, thực vật So sánh cấu tạo tế bào nấm men với vi khuẩn ta thấy có tiến hóa nhẩy vọt từ nhân sơ đến nhân chuẩn Cùng với tiến hóa nhân chế phân chia nhân (nhân có màng, có tểh nhiễm sắc, phân bào có tơ ) thể nhân chuẩn xuất nhiều thể không thấy thể nhân sơ, ti thể, lục lạp v.v Tế bào nấm men có thành phần cấu tạo phức tạp Trong tế bào có cấu từ - tiểu thể chia thành; quan nội bào hay quan từ tế bào chất chứa tế bào hay thể vùi tế bào (inclusion) 10 Cấu tạo tế bào nấm men dược glớ‫ ؛‬thiệu hinh ] ٠ Vo’ tếbờo: Bao quanh tế bào nấm men lớp màng mỏng dày dặc, mềm mại dàn hồi để định hình cQng bảo vệ tế bào chống lại tác động bên chất dộc v ỏ tế bào nấm men mang diện NO cịn có tác dụng giữ áp suất thẩm thâu nộỊ bào, diều chỉnh c.ác chất dinh dưỡng hợp chất có phân tử 1trọng thấp muOi khoáng di qua lỗ nhỏ vào tế bào Thành phần hoá học cùa vỏ tế bào gồm có phức chất proitein - polysacarit phosphat lipit Vỏ tê' bào dầy khoảng 25 nm chiếm khoảng 25% khô'i lượng tế bào Trong thành phần poly.sacarit thấy có glucan (chủ yếu) mannan Tổng hai liopchd't chiếm tới 90% châ'l kho cùa vỏ tê' bào Glucan polyme pliức tạp từ tiểu phầiii 1‫ ﻵ‬glucoza Mặc dù có cấu trUc khbng gian, phần lớn glucan nằm !(Jp phía cUa vơ liếp giáp với màng tế bào chất Glucan thành phẩn chinh cấu tạo nên vỏ tế bào ^ê'u thà.nh phấn bl phá hỏng thl tê' bào bị phá vỡ hoàn toàn Mannan ۴ lyme cùa dường mannanozs, chủ yếu nằm phần vỏ, nhimg khOng phải thành phẩn dỊnh vỏ tế bào Nếu b‫؛‬ỏ phẩn mannan hlnh dáng tế bào khOng bị biến dổi Dại thể ta thấy lượng mannan vỏ tế bà(0 nấm men nhỏ, Saccharotnyces guttiilata Endomycopsis caponlaris hoàn toàn vắng mặt ‫ ة‬Nadsonia fidvescenS) &hizo.saccharomyces v ỏ tế bào nấm men cịn có kitin (chitin) Kitin loạ‫؛‬ hydratcacbon, polyme N-axetyl-glucozamin Thành phần thường nằm sát vUng nấm men nẩy chồi Tếhào chất: vUng vỏ thành tế bào với màng tế bào c!hấí ta thấy hàng loạt enzym, chủ yếu enzym thuỷ phân, p-fructofuranozidaza (invectaza) phosphataza axit ^ lành phẩn protein có vỏ tế bào chiếm khoảng 10% chất kho Trong số có phần enzym liên kết với vỏ thành tế b.ào Trong enzym kể invectaza có chất 11 biến làm hỏng trình kết hợp nhân Lai tế bào chất sử dụng theo ba cách: thay gen ty thể, thêm vào A D N dạng plasmid (cấu trúc tự chép ADN) hay chuyển giao sợi đôi A R N phân tủ Khi sử dụng phương pháp thay gen ty thể, nghiên cứu ảnh hưởng vật liệu di truyền đến chức nãng tế bào như: hoạt động hơ hấp, hoạt tính bề mặt tế bào đặc điểm khác nấm men Những tiến công nghệ sinh học tạo tiền đề cho việc phát triển phương pháp di truyền V í dụ dung hợp tế bào trần phương pháp A D N tái tổ hợp 10.7.3.4 Dung hợp tế bào trần (Protoplast fusion) Dung hợp tế bào trần kỹ thuật áp dụng nghiên cứu di truyền nhằm tạo chủng giống nấm men Phương pháp không phụ thuộc vào tính đơn bội kiểu ghép đơi áp đụng rộng rãi giống men có chất đa bội Thành tế bào nấm men loại bỏ cách sử dụng lizozym (enzym dung giai thành (vỏ) tế bào) chiết từ dày ốc sên, từ nguồn vi sinh vật khác Việc loại bỏ lớp thành tế bào làm cho tính thẩm thấu tế bào trần yếu Cho nên, chúng cần trì m trường ổn định tính thẩm thấu, ví dụ dung dịch sorbitol IM Enzym có tế bào trần loại bỏ cách rửa kỹ, sau tế bào trần trộn huyền phù hố tác nhân dung hợp có chứa polyethylen glycol (PEG) ion Cs}* dung dịch đệm Tiếp tế bào trần dung hợp cần phải kích hoạt để tái tạo lại lớp thành tế bào để bắt đầu lại trình phân chia Q trình tiến hành mơi trường rắn có chứa 3% agar sorbitol Hoạt động polyethylene glycol tác nhân dung hợp chưa hiểu cách cặn kẽ Tuy nhiên, nhà khoa học tin hoạt động polycation tạo m ối liên kết yếu tế bào trần (hình 10.15) Phương pháp dung hợp tế bào trần tạo nhiều chủng nấm men có đặc tính ưu việt như: - Chủng giống nấm men bia có hoạt tính amylaza kiến tạo phương pháp đung hợp tế bào trần loài s cerevisiae s diastaticus - Nấm men đa bội thể có khả tạo hàm lượng cồn cao tạo thành từ chủng có khả kết lắng tốt chủng nấm men rượu Sakê - G iống nấm men có khả chịu áp suất thẩm thấu cao lai tạo từ loài Saccharomyces diastaticus Saccharomyces rouxii Dung hợp tế bào trần kỹ thuật có hiệu quả, chủng giống lai phương pháp thường có tính chất khác so với bố m ẹ gen kết hợp hai chủng giống Vì vậy, sử dụng kỹ thuật để đưa vào tế bào nấm men đặc tính có lợi khả kết lắng khó thực hiện, kỹ thuật 318 xem có hiệu chúng tạo sản phẩm cuối có hương vị khơng thay đổi nhiều, thời giống tạo bàng phương pháp chịu dựng áp suất thẩm thấu lớn, nhiệt độ lên men cao (gần 40'١ C) tãng khả chịu cồn Các chủng giống nấm men loại sử dụng thành công ngành công nghiệp sản xuất rượu S a cch a ro m y ce s d ia s t a tic u s S a cch a ro m yce s u v a ru h ٦ (a , b, c , c a r ils b e r g e n s is ) T o n tế b o E n z y m p h ả v ỡ th n h tê' b o ( liz o z y m - L is o z y m e ) T ế b o trẫ n T c nhân dung hợp D u n g h ợ p t ế b o trẫ n T ế b o đ ã d u n g hợp P h ụ c h i th ả n h (v ỏ ) tế b o T i t o th n h t ế b o n ấ m m en đ ã đ ợ c d u n g hợp D E X : c ó h o t tín h lê n m e n d e x tr in F L O : c ó k h ả n â n g k ế t lắ n g S ả n p h ẩ m c ủ a q u trìn h d u n g h ợ p Hinh /Ớ 75 Dung hợp tế bào trần chủng nấm men Mặc dù kỹ thuật lai tạo lai hiếm, dung hợp tế bào trần có thành cơng định, chúng có hạn chế Một nhược điểm lớn chúng thiếu tính đặc hiệu trao đổi đặc tính di truyền Chỉ đến năm 1978, mà người la xây dựng hệ thống trao đổi ADN nấm men kỹ thuật lai tạo có bước tiến lớn Ngày nay, làm biến đổi thành phần di truyền chủng giống nấm men mà không làm đặc tính khơng mong muốn đồng thời đưa vào nấm men gen lừ nguồn khác Kỹ thuật sử dụng loạt phương pháp gọi kỹ thuật A D N tái tổ hợp xuất phát từ hai lĩnh vực có liên quan Đó lĩnh vực di truyền học vi sinh vật, chuyên nghiên cứu chế, thông qua vỉ sinh vật kế thừa nét đặc trưng cha mẹ chúng lĩnh vực sinh học phân tử nghiên cứu thông tin di truyền, mang phản lử ADN làm để A D N điều khiển trình tổng hợp protein 10.7.4 Tái tổ hợp ADN Trong nãm từ 1970 đến 1980, nhờ có phát triển kỹ thuật ADN tái tổ 319 hợp, việc áp dụng vi sinh vật thực tế tiến hành rộng rãi sức tưởng tượng người Cho dù trình tái tổ hợp tự nhiên cho phép trao đổi gen vi sinh vật có quan hệ gần gũi với nhau, nhiên kỹ thuật lai tái tổ hợp nhân tạo lại thực lồi khơng có quan hệ với Các kỹ thuật mạnh ngày thuật ngữ tái tổ hợp A D N thường hiểu thao tác gen nhân tạo, cho dù chủng loài hay loài khác biệt Với kỹ thuật gen động vật có xương sống, kể người, chuyển vào phân tử A D N vi khuẩn gen virut cấy vào phân tử ADN nấm men Trong nhiều trường hợp, đối tượng nhận sau tạo để biểu gen mã hố cho sản phẩm có giá trị thương mại Do vậy, nấm men có chứa gen mã hoá cho insulin người dùng để sản xuất insulin sử dụng điều trị bệnh tiểu đường cho người sản xuất vacxin chống viêm gan B từ gen lấy từ vỏ virut viêm gan B (nấm men tạo protein virut) Nhờ có kỹ thuật tái tổ hợp A DN mà người tạo hàng nghìn phiên phân tử A D N , từ sản sinh đủ cô' lượng A D N cho nhu cầu thí nghiệm phân tích khác Chúng ta thường nghĩ thao tác gen nhân tạo thao tác di truyền Kỹ thuật di truyền thực nhờ vào việc khám phá phát triển số kỹ thuật quan trọng việc phát enzym cắt đặc hiệu, enzym có nguồn gốc từ vi khuẩn có khả cắt phân tử ADN từ nguồn khác thành đoạn nhỏ dễ dàng cho việc tái tổ hợp điều kiện invitro Kỹ thuật di truyền thực phát triển cùa phương pháp chuyển phân tử A D N tái tổ hợp vào bên tế bào Quá trình thực vectơ Nếu muỗi mang virut gây bệnh sốt vàng da đốt truyền bệnh sang người muỗi xem vectơ truyền bệnh Thuật ngữ vectơ hay vectơ clonning sử đụng rộng rãi để mô tả phân tử ADN tự chép sử dụng chất mang để chuyển gen từ sinh vật sang sinh vật khác Công nghệ tái tổ hợp A D N sử dụng để cải tạo chủng giống nấm men, số giống nấm men tái tổ hợp thành cơng: - Có hoạt tính enzym glucoamylaza nấm mốc Aspergillus nìger - Có hoạt tính enzym glucanaza từ vi khuẩn Bacillus subtilis nấm mốc Tricodenna reishi - Có hoạt tính enzym axetolactat decacboxylaza vi khuẩn Enterobacter aerogenes Acetobacter spp - Có hoạt tính enzym proteaza ngoại bào dành cho nấm men bia chịu lạnh - Biến đổi đặc tính kết lắng nấm men Quá trình tái tổ hợp A D N chủng men bia đưa thêm A D N cùa 320 s diasĩơticỉis có khả nâng tiết enzym glucoamylaza dùng để sản xuất bia nghèo nãng lượng (hình 10.15) Có lẽ sử dụng phối hợp giải pháp truyền thống rẻ tiền sẵn có cho nhiều vấn đề mà giống tái tổ hợp hy vọng giải nguồn enzym glucanaza١ gIucoamylaza a-am ylaza rẻ tiền, làm hạn chế việc triền khai sử dụng chủng giống nấm men tái tổ hợp Tương tự vậy, số trường hợp tái tổ hợp A D N vượt tầm hiểu biết tính chất sinh hố nấm men Ngồi cịn phụ thuộc vào chấp nhận người tiêu dùng Mặc dù rào cản đầy khó khăn, tin tương lai người trở nên quen thuộc với loại dược phẩm sản xuất kỹ thuật tái tổ hợp A D N nhiều loài trồng cải tạo nhằm có sản phẩm tốt trồng nơng trang để lấy thực phẩm chiếm lịng tin người tiêu dùng lúc lưỡng lự việc sử dụng sản phẩm công nghệ công nghiệp sản xuất o T ế bào A D N p la s m it A D N cho nấm m en ^ ١ 'ỉr C c e n zy m p hân huỷ v ò tế b o ( ỉy s o z y m e ) C c đoạn Đ o n p la s m it nhỏ A D N sa u m vòng ị G ắ n k é o dài _ ٠ P la s m it tả i tổ h ợ p T ế bào H ình 10.16 Giống men bia phương pháp tái tổ hợp AD N 321 10.7.5 Những thành tựu nghiên cứu nâ'm men Thế kỷ 20 chứng kiến cách mạng lớn lĩnh vực cải tiến công nghệ, đặc biệt công nghệ sinh học Kỹ nghệ di truyền mau chóng trở thành mũi nhọn lĩnh vực nghiên cứu nấm men, tạo nhiều chủng, giống mang đạc tính ưu việt Một sô' thành công ứng dụng công nghệ sản xuất bia như: - Bằng phương pháp đột biến, Malzahn, 1977 tuyển chọn chủng nấm men bia có khả kết lắng cao - Hockney Frieman, 1980 thu nhận chủng nấm men bia có khả tạo cồn cao từ q trình phân lập thể đột biến EMS - Sử dụng kỹ nghệ lai ghép gen cho phát triển chủng giống nấm men công nghiệp Lewis cộng sự, 1976, Russell, 1980 xác định gen điều khiển trình kết lắng nấm men Tương tự vậy, gen (DEX, STA) mã hoá cho sản xuất glucoamylaza ngoại bào xác định gần người ta tạo chủng nấm ưien đa bào mang gen điều khiển trình đồng hoá maltoza (MALT-6) Người ta tạo nên chủng nấm men có khả bền vững với cycloheximid phương pháp đưa vectơ trội vào tế bào nấm men Quá trình lai ghép nấm men kích thích gen trội đơn P l, làm tăng khả nãng bền vững axit decarboxylat cinamic điểu có ý nghĩa q trình tạo hương công nghệ sản xuất bia Bằng viẹc đưa đoạn gen endoglucanaza Trichoderma recset vào gen nấm men kiến tạo chủng nấm men có hoạt tính phân giải p-glucan cao, giúp cho q trình lọc thơ trở nên dễ dàng chóng lại hình thành kết tủa bia Đồng thời, chủng nấm men với hoạt tính xenlulaza cao thu nhận từ việc chuyển gen xenlulaza từ Trichoderma recset Saccharomyces Những nhà khoa học Nhật Bản thành công việc nghiên cứu chuyển gen a-axetolactat decacboxylaza từ chủng Enterobacteria aerogeiies vào nấm men để giảm tạo thành diaxetyl lên men bia phân lập gen đồng hoá đường maltoza với tần sô' copy cao, chuyển vào chủng nấm men bia ứng dụng thành công lên men bia nồng độ đường 24 p hiệu suất lên men tăng 30% Những chủng nấm men với đặc tính ưu việt tạo phương pháp di truyền có nhiều ứng dụng hiệu vào ngành cơng nghệ đồ uống nói chung bia nói riêng chắn trở thành mũi nhọn lĩnh vực công nghệ sinh học kỷ 21 322 T À I L IỆ U TH A M K H Ả O ‫ إ‬ Nguyễn Thành Đ ạt١Mai Thị Hằng; 2001, s ‫؛‬nh học vi sinh vật١tái lẩn thứ nhất, Nhà xuất Giáo dục, Hà Nội Hoàng Dinh Hoà2000 ‫؛‬ COng nghệ sản xuất ma!t bia, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nộl Lương Dức Phẩm: 2004, COng nghệ vi sinh vật, tái lấn thứ nhất, Nhà xuất NOng nghiệp Hà Nội Hồ Sương1992 ‫؛‬ COng nghệ sản xuất bia, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Dinh Thưởng, Nguyễn Thị Hằng2000 ‫؛‬, COng nghệ sản xuất kiểm tra cồn etybc, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn ٧ ăn Việt, Nguyền Thị Hiền người khảc2001 ‫؛‬, Nấm men bia ứng dụng, Nhà xuất NOng nghiệp, Hà Nội Beery D R.1982 ‫؛‬, Biology of yeast, Edward Arnold (Publishes) LTd London Hans G Schlegel1993 ‫؛‬, General Microbiology (Trans, by M Kogut), 7‫ غ‬edi Cambridge Univercity Press Reed G., Nagodawithana T w 1991 ‫؛‬ Yeast Technology, 2‫ ك‬Ed., Van Noslrand Reinhold New York 10 WallkerG M.1998 ‫؛‬, Yeast Physiology and Biotechnology, John Weiley and Sons, Chilester, u K 11 Бурян H H., Тюрина; 1979, Микробиология виноделения; "Пищевая Пр ١١ изд., Москва 12 Грачева и м ١ Иванов л А., Кантере в м ; 1972, Технология Микробных прегратов Аминокислот и биоэнергия, 2“ изд "Колос١١, Москва 13 Жвирблянская А ю 1970 ‫؛‬, Микробиологический контроль производства пива и безаалкогольных напитков, ‘‘Пищевая Пр٠١١ изд., Москва 323 MỤC LỤC Phần th ứ Đ Ạ I CƯ Ơ NG V Ể NẤM M EN Chương PHÂN LOẠI VÀ HÌNH THÁI NÂM MEN 1.1 Phân loại nấm m en 1.1.1 Tiêu chí phân lọai nấm men 1.1.2 Phẫn loại nấm men sở di truyển 1.2 Hình thái cấu tạo tế bào nấm m en 1.2.1 Hình thái 1.2.2 Cấu tạo tế bào nấm men 10 1.3 Một sô' giống nấm men thường gặp tự nhiên sử dụng công nghiệp 18 1.3.1 Giống Saccharomyces M eyen 19 1.3.2 Giống Pichia Hansen 23 1.3.3 Giống Hansenula Sydow 24 1.3.4 Giống Candida Berkhout 25 1.3.5 Giống Schizosaccharomyces Lindner 25 1.3.6 Giống Sac charomyces Hansen 26 1.3.7 Giống Hanseniaspora (Zikes) Klốecker 26 1.3.8 Giống Brettanomyces Kufferath 27 1.3.9 Giống Torulopsis Berlese 28 1.3.10 Giống Rhodotorula Harrison 28 Chương SINH LÝ NẤM M EN 29 2.1 Thành phần hoá học tế bào nấm m en 29 2.2 Dinh dưỡng nấm m en 32 2.2.1 Vận chuyển vật chất qua màng tế bào 32 2.2.2 Dinh dưỡng cacbon 34 324 2.2.3 Dinh dưỡng nitơ 36 2.2.4 Dinh dưỡng nguyên tố vô 38 2.2.5 Dinh dưỡng chất sinh trưởng 39 2.3^ in h trường nấm m en 40 2.3.1 Sinh sả n 40 2.3.2 Đặc tính di truyền nấm m en 44 2.3.3 Sinh trưởng nấm men 46 Chương CÁC QUÁ TRÌNH TRAO Đ ổ l CHẤT VÀ SẢN PHẨM CỦA TÊ BÀO NẤM M EN 52 3.1 Dị hoá đồng hoá tế bào nấm m en 52 3.1.1 Sự dị hoá (catabolism hay Dissilation) 52 3.1.2 Đổng hoá (Anabolism hay Assimilation) 54 3.2 Trao đổi lượng 55 3.3 Hô hấp 56 3.3.1 Hơ hấp kỵ khí 60 3.3.2 Hơ hấp hiếu khí 60 3.3.3 Hơ hấp điềukiện kỵ khí lên men 63 3.4 Sinh tổng hợp số hợp chất quan trọng vàsản phẩm tế bào nấm m en 68 3.4.1 Sinh tổng hợp chất vật liệu xây dựng tế bào 68 3.4.2 Các sản phẩm từ nấm m en 75 Phần thứ hai CÁC SẢ N PH Ẩ M LÊN M EN VÀ CÔ NG N G H IÊ P NẤM M EN 79 Chương CÁC SẢN PHẨM LÊN M E N 79 4.1 Khái niệm lên m en 79 4.2 Các sản phẩm từ nấm men 85 4.3 Những nhân tố ảnh hưởng đến hoạt tính nấm m e n 85 4.3.1 Nhiệt đ ộ ‫؛‬ T r r.T 86 4.3.2 Oxy hồ tan - độ hiếu k h í 87 325 4.3.3 ρΗ môi trường 88 4.3.4 Khí CO2 88 4.3.5 Rượu e ty lic 89 4.3.6 Thành phần môi trường 89 4.4 Nước công nghệ lên m en 90 4.4.1 Yêu cầu nước dùng cho phachế môi trường dinh dưỡng 90 4.4.2 Xử lý nước phương pháp traođổiion 91 Chương SẢN XUẤT CỒN - RƯỢU ETYLIC 94 5.1 Nguyên liệu sản xuất rượu - cồn etylic 96 5.1.1 Các nguồn nguyên liệu chứa tinh bột 96 5.1.2 Rỉ đường 98 5.2 Một số phương pháp sản xuất rượu 100 5.2.1 Phương pháp đường hoá a xit 101 5.2.2 Phương pháp men thuốc bắc 101 5.2.3 Phương pháp maltaza 101 5.2.4 Phương pháp myco-malt (có nghĩa làmầm mốc) 102 5.3 Vi sinh vật sản xuất rượu 102 5.3.1 Nấm m e n 102 5.3.2 Nấm mốc thu nhận chế phẩm enzym để đường hoá tinh bột 108 5.4 Lên men rượu theo phương pháp myco-malt (từ nguyên liệu tinh bột) 112 5.4.1 Nấu đường hoá Π5 5.4.2 Lên m en 117 5.5 Lên men rượu từ rỉ đường 124 5.5.1 Xử lý nguyên liệu 124 5.5.2 Chuẩn bị dịch nuôi cấy nhân giống lên m en 125 5.5.3 Nhân giống sản xuất rượu từ rỉ đường 125 5.5.4 Lên m en - 127 5.6 Chống tạp nhiễm cho lên men 128 5.7 Chưng cất tinh luyện 129 5.7.1 Chưng cất gián đoạn - 129 5.7.2 Chưng luyện bán liên tục (chưng cất giánđoạn, luyện liên tục) 132 5.7.3 Chưng luyện liên tụ c 133 326 5.8 Tinh luyện để thu nhận cồn tuyệt đ ố i 134 5.9 Sản xuất rượu thủ công truyền thống 135 5.9.1 N guyên liệu 136 5.9.2 Cách làm bánh m e n 137 5.9.3 Hệ vi sinh vật bánh m e n 140 5.9.4 Sản xuất rượu theo phương pháp thủ công truyền thống 141 Chương BIA 144 6.1 Nguyên liệu 145 6.1.1 Nước 145 6.1.2 Thóc malt 146 6.1.3 Hoa hublon (hoa hốt bốtheoâm Hán - Việt hay hoa bia) 152 6.1.4 Các ngun liệu tinh bột(khơng phải thóc malt) 154 6.2 Quy trình cơng nghệ sản xuất b ia 134 6.2.1 Sơ đồ công nghệ sản xuất bia 155 6.2.2 Nấu - đường hố hay làq trình chuẩn bị dịch lên men 156 6.2.3 Men bia 159 6.2.4 Lên m en 166 6.2.5 Hoàn thành sản phẩm 168 6.3 Sử dụng chế phẩm enzym trọng sản xuất bia 169 6.3.1 Termamyl 120L 169 6.3.2 Celluclast 1.5L 169 6.3.3 CereAo 170 6.3.4 Pungamyl 800L 170 6.3.5 Neutraza 170 6.3.6 Finizym 170 6.3.7 Maturex L 171 ế.4 Sinh vật gầyLỈiạiTrong sản xuất bia 171 6.4.1 Nấm m en 171 6.4.2 Vi khuẩn 172 6.4.3 Nấm m ố c 174 6.5 Kiểm tra vi sinh vât 174 327 6.5.1 Kiểm tra men giống 174 6.5.2 Xác định Pedicoccus 175 6.5.3 Xác định men dại 76 6.5.4 Kiểm tra bia chưa chín 176 6.5.5 Kiểm tra bia thành phẩm 176 6.6 Men bia chất lượng sản phẩm 178 6.6.1 Các yêu cầu công nghệ với giống men b ia 178 6.6.2 Hấp thu cacbon dinh dưỡng men bia 179 6.6.3 Hấp thu hợp chất chứa nitơ 179 6.6.4 Một số yếu tố ảnh hường tới trìnhlên men chất lượng bia 181 6.6.5 Diaxetyl, axetoin 2,3-butandiol 185 6.7 Sinh tổng hợp sản phẩm thứ cấp (bậc ) 185 6.7.1 Glycerin 186 6.7.2 Rượu bậc c a o 186 6.7.3 Este aldehyt 187 Chưoíng RƯỢU VANG 188 7.1 Đặc điểm nước quà yêu cầu nguyên liệu làm rượu vang 189 7.2 Hệ vi sinh vật dịch 191 7.2.1 Nấm m en 191 7.2.2 Vi khuẩn nấm môc 194 7.3 Hệ vi sinh vật lên men rượu vang tự nhiên (lên men tự phát) 195 7.4 Dinh dưỡng nấm men chất lượng vang 196 7.4.1 Nguồn dinh dưỡng cacbon 196 7.4.2 Dinh dưỡng nitơ 197 7.4.3 Dinh dưỡng nguyên tố vô 199 7.4.5 Các nhân tô' sinh trường 200 7.5 Nấm men thường gặp sản xuất rượu vang 200 7.5.1 Saccharomyces vini 202 7.5.2 Saccharomyces uvariim 203 7.5.3 Saccharomytces chevalieri 203 7.5.4 Saccharomyces oviỊormis 203 328 7.5.5 H anseniaspora apicuìate - Kỉoeckem apiciiỉata 203 7.5.6 Yêu cầu chọn nấm men chủng 204 7.6 Sản xuất rượu v a n g 205 7.6.1 Men giống sản xuất vang 205 7.6.2 Lên m e n 205 7.7 Sản phẩm lên m e n 207 7.7.1 Những sản phẩm tạo trình hoạt động sống nấm men 207 7.7.2 Các sản phẩm tạo thành trình tự phân cùa nấm m en 213 7.8 Các tác nhân ảnh hưởng đến lên men vang 213 7.9 Các chất sát khuẩn (A nticeptic) dùngtrong sản xuất rượu vang 217 7.10 Quá trình lên m en m alo-lactic ỏ rượu van g .219 7.10.1 Tác nhân gây lên men m alo-lactic 219 7.10.2 Lẽn men m alo-lactic tự phát v a n g .220 7.10.3 Lên men m alo-lactic giống vi khuẩn chủng .221 Chương SINH KHỐI NẤM MEN 224 8.1 Nấm men dùng công nghiệp thu sinh khối 226 8.2 Sản xuất sinh khối nấm men từ nguyên liệu thông thường 233 8.3 Quy trình cơng nghệ sản xuất sinh khối nấm men 237 8.4 Sản xuất nấm men chăn nuôi từ bã rượu 238 8.4.1 Nấm men dùng sản xuất men chăn nuôi môi trường bã rượu 240 8.4.2 Chuẩn bị môi trường dinh dưỡng 240 8.4.3 Nhân giống - Sinh sản giống chủng .242 8.4.4 Nuôi cấy nấm men thương phẩm - Nuôi cấy mở rộng 243 8.4.5 Tách rửa nấm m en 245 8.4.6 Nhiệt phân (thermolysis) 245 8.4.7 Sấy m en .247 8.4.8 Yêu cầu chất lượng men thương phẩm 247 8.5 Sản xuất protein vi sinh vật từ dầu mỏ khí đ ốt 248 8.6 Sản xuất nấm men bánh m ì 256 8.6.1 Giống men bánh m ì 258 8.6.2 Các phương pháp bảo quản men giống 259 8.6.3 Sản xuất men nước men ép theo phương pháp thủ công 260 329 8.6.4 Quá trình lách lĩien lừ dịch ri đường lên men nhà máy rư ợ u 262 8.6.5 Sấy men thành phẩm 264 8.6.6 Sản xuất men bánh mì nhà máy rượu với nguyên liệu từ rỉ đường 265 8.6.7 Sản xuất nấm men từ rỉ đư n g 266 Phần thứ ba VI SIN H VẬT TẠP NHIỄM VÀ TUY ỂN C H Ọ N N Ấ M M EN 267 Chương V I SIN H VẬT TẠP NHIỄM TRONG SẢN X U Ấ T N Ấ M M EN 267 9.1 Vi khuẩn lactic 268 9.1.1 Giới thiệu sơ giản vi khuẩn lactic 268 9.1.2 Sinh lý vi khuẩn lactic 268 9.1.3 Các sản phẩm trao đổi chất vi khuẩn lactic 269 9.1.4 Những yếu tố ảnh hưởng đến phát triểncủa vi khuẩn la ctic 270 9.1.5 Các vi khuẩn lên men lactic gây hại trongcông nghiệp nấm m en .272 9.2 Vi khuẩn axetic vi khuẩn tạp nhiễm khác .275 9.3 Tạp nhiễm nấm men 278 9.3.1 T oruỉopsis 278 9.3.2 Candida (trước gọi M icoderma) 280 9.3.3 P ic h ia 280 9.3.4 Apiculatus (hay Haiiseniaspora, Kloeckera, men đầu nhọn) 281 9.3.5 M o n ilia 281 9.3.6 Schizosaccharomyces 282 9.4 Nấm m ố c 282 9.4.1 A spergillus 282 9.4.2 Penicilliuni 284 9.4.3 Oidium .284 9.4.4 R h izopu s 285 9.4.5 M u cor 285 9.4.6 B o trytis 286 9.4.7 Sphaerulina 287 9.5 Các biện pháp phòng chống vi sinh vật tạp nhiễm .287 330 Chương 10 TUYỂN CHON NẤM MEN 289 10.1 Nghiên cứu tuvển chọn nấm men giống chUng 289 10.1.1 Tách giống thuẩn chủng từ khuẩn lạc riêng biệt 289 10.1.2 Tách nấm men từ tế bào theo phương pháp Lindner 291 10.2 Nghiên cứu tế bào nấm men kinh hiển vi .292 10.2.1 ffinh thái, sinh sả n 292 10.2.2 Đếm,số lượng tế bào dỊch nuOi cấy dể xác định tốc độ sinh sản sinh trường nấm men 293 10.2.3 Nghiên cứu hlnh thành bào tử nấm men 294 10.2.4 Xác định hàm lượng hạt glycogen tế bào men 296 10.2.5 Nhuộm quan sát hạt Volutin, chất béo tế bào 297 10.2.6 ^ m tế bào men chết 297 10.3 Xác định dồng hoá lên men loại dường nấm men 297 10.4 Các dặc điểm lèn men .299 10.4.1 Lực lẽn m en 299 10.4.2 Mức lốn men cuối 300 10.4.3 Khả sinh trường: xác định tốc độ sinh sản hệ số sinh trưởng 301 10.4.4 Khả kết lắng 301 10.4.5 Khả nẫng chịu cồn 302 10.4.6 Khả chịu nhiệt chịu lạnh 302 10.4.7 Tinh chịu axit 302 10.4.8 Khả nàng chịu sulfit (SOj) 302 10.4.9 Xác định phenotip (phenotype) K, N s nấm men 303 10.5 Một số mồi trương thương dUng 306 10.6 Những dung dịch thuốc nhuộm tiêu vi sinh vật cách làm tiẽu 309 10.6.1 Tiêu vi sinh vật .309 10.6.2 Cách pha dung dịch thuốc nhuộm thỊ 310 10.7 Chọn lọc nấm men có hoạt tinh ca o 311 10.7.1 Chọn lọc thích ứng 311 10.7.2 Dột biến 311 10.7.3 Sự tạo giống lai (Hybridization) 315 10.7.4 Tái tổ hợpADN 319 10.7.5 Những thành tựu nghiên cứu nấm men 322 TÀI LIỀU THAM KHẢO 323 331 V NẤM MEN CÔNG NGHIỆP Tác giả: PGS TS Lương Đức Phẩm Chịu trách nhiệm xuất bản: Biên tập sửa bài: PGS TS TÔ ĐẢ N G HẢI ThS NGUYỄN HUY TIÊN NGỌC LINH, ĐỨC LUƠNG Trình bày bìa: HUƠNG LAN N H À XUẤT BẢN KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT 70 Trần Hưng Đạo - Hà Nội In 800 cuốn, khổ 19 X 27cm Xưởng ỉn NXB Vãn hoá Dân tộc Q uyết định xuất số: 409-2006/CXB/22-33/KHKT ngày 17/7/2006 In xong nộp lưu chiểu Quý III năm 2006 N ... loại nấm men (theo w Carol Eratier) Nấm men tạo thành màng; Nấm men hỉnh chuỳ; Nấm men tạo thành khuẩn ti thật khuẩn ti giả Qua sơ dồ phân lơạl nấm ٠ Lớp nấm w Cam! Frarier ta thấy: ĨỈÁỈ nấm. .. loại chủng nấm rnen phương pháp PCR: A, Chủng nấm men mới; B Chủng nấm men dại; c Chủng nấm men chìm; D ADN đối chứng 1.2 HÌNH THÁI VÀ CÂU TẠO TẾ BÀO NẤM MEN 1.2.1 Hỉnh thái Tế bào nấm men có hình... khát, men bánh mì, men thức ăn chãn ni v.v Song, có số giống - lồi nấm men lại gây phá hỏng trình lên men sản phẩm lên men 18 1.3.1 Giông Saccharom yces Meyen ‫؛‬٠١ Giống gổm nấm men có thổ lẽn men