Nghiên cứu di truyền quần thể loài cá hú pangasius conchophilus (robert vidthayanon, 1991) tại khu vực hạ lưu sông mekong

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG LÊ PHAN KHÁNH HƯNG NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN QUẦN THỂ LOÀI CÁ HÚ Pangasius conchophilus (Roberts & Vidthayanon, 1991) TẠI KHU VỰC HẠ LƯU SÔNG MEKONG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHÁNH HÒA – 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG LÊ PHAN KHÁNH HƯNG NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN QUẦN THỂ LOÀI CÁ HÚ Pangasius conchophilus (Roberts & Vidthayanon, 1991) TẠI KHU VỰC HẠ LƯU SƠNG MEKONG LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành: Cơng nghệ sinh học Mã số: 8420201 Quyết định giao đề tài: 551/QĐ-ĐHNT ngày 21/6/2017 Quyết định thành lập HĐ: 1367/QĐ-ĐHNT ngày 19/11/2018 Ngày bảo vệ: 01/12/2018 Người hướng dẫn khoa học: TS ĐẶNG THÚY BÌNH Chủ tịch Hội đồng: PGS TS NGƠ ĐĂNG NGHĨA Phịng ĐT Sau Đại học: KHÁNH HỊA – 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết đề tài: “Nghiên cứu di truyền quần thể loài cá hú Pangasius conchophilus (Roberts & Vidthayanon, 1991) khu vực hạ lưu sơng Mekong” cơng trình nghiên cứu thân tơi thực hiện, hướng dẫn TS Đặng Thúy Bình thuộc Viện Cơng nghệ Sinh học Môi trường, Trường Đại học Nha Trang chưa công bố cơng trình khoa học khác thời điểm Các số liệu luận văn trung thực phần dự án PEER 3-100 “Building a Mekong River genetic biodiversity research network” TS Đặng Thúy Bình đồng chủ trì Nha Trang, ngày 22 tháng 10 năm 2018 Tác giả luận văn Lê Phan Khánh Hưng iii LỜI CẢM ƠN  Để thực hoàn thành luận văn tốt nghiệp, nỗ lực phấn đấu thân, nhận nhiều giúp đỡ tổ chức cá nhân Tôi xin thể lời cảm ơn đến giúp đỡ quý báu Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc đến TS Đặng Thúy Bình (Viện Công nghệ Sinh học Môi trường, Trường Đại học Nha Trang) tận tình hướng dẫn giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài Đồng thời, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Th.S Đồn Vũ Thịnh (Khoa Cơng nghệ Thơng tin, Trường Đại học Nha Trang) nhiệt tình hỗ trợ giúp đỡ tơi hồn thành tốt luận văn tốt nghiệp Tôi xin gửi lời cảm ơn đến thầy giáo, cô giáo Viện Công nghệ Sinh học Môi trường giảng dạy, truyền đạt kiến thức chun ngành q báu bổ ích cho tơi suốt trình học tập Cảm ơn dự án PEER 3-100 “Building a Mekong River genetic biodiversity research network” USAID tài trợ cung cấp kinh phí hỗ trợ cho thực nghiên cứu Cuối cùng, xin dành biết ơn to lớn đến gia đình, người thân, anh chị em phịng thí nghiệm Sinh học phân tử, bạn bè quan tâm, động viên chỗ dựa tinh thần giúp tơi vượt qua khó khăn suốt thời gian qua Do thời gian kiến thức hạn chế nên luận văn tốt nghiệp tránh khỏi thiếu sót, tơi mong nhận đóng góp ý kiến quý thành viên Hội đồng để luận văn hồn thiện Tơi xin chân thành cảm ơn! Nha Trang, ngày 22 tháng 10 năm 2018 Tác giả luận văn Lê Phan Khánh Hưng iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN iii LỜI CẢM ƠN iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii DANH MỤC BẢNG .x DANH MỤC HÌNH xi TRÍCH YẾU LUẬN VĂN xii MỞ ĐẦU CHƯƠNG - TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm vùng nghiên cứu 1.1.1 Đặc điểm tự nhiên 1.1.2 Vai trò đa dạng sinh học sông Mekong 1.1.3 Một số nguy lưu vực sông Mekong .7 1.2 Đặc điểm sinh học cá hú Pangasius conchophilus 10 1.2.1 Hệ thống phân loại đặc điểm hình thái cá hú Pangasius conchophilus (Roberts & Vidthayanon, 1991) 10 1.2.2 Phân bố tập tính sống 11 1.3 Phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể 13 1.3.1 Ứng dụng thị phân tử SNPs nghiên cứu đa dạng di truyền 14 1.3.2 Phương pháp giải trình tự hệ (Next Generation Sequencing - NGS) 17 1.3.3 Kỹ thuật Restriction-site Associated DNA sequencing (RAD-seq) enzyme Restriction-site Associated DNA (ezRAD) 19 1.3.3.1 Kỹ thuật Restriction-site Associated DNA sequencing (RAD-seq) .19 1.3.3.2 Kỹ thuật enzyme Restriction-site Associated DNA (ezRAD) 19 1.4 Kích cỡ quần thể hiệu (Effective population size - Ne) 20 1.5 Các cơng trình nghiên cứu ngồi nước liên quan đến nội dung đề tài .21 1.5.1 Các nghiên cứu đối tượng cá hú Pangasius conchophilus (Roberts & Vidthayanon, 1991) .21 1.5.2 Các nghiên cứu di truyền quần thể cá hệ thống sông Mekong 22 CHƯƠNG - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .27 2.1 Đối tượng, địa điểm nghiên cứu phương pháp thu mẫu 27 2.2 Phương pháp nghiên cứu di truyền quần thể cá hú Pangasius conchophilus ứng dụng công nghệ giải trình tự hệ 29 v 2.2.1 Tách chiết xác định hàm lượng DNA .30 2.2.2 Thu nhận thư viện DNA cá hú 30 2.3 Phương pháp xử lý phân tích liệu 34 2.3.1 Phát thị SNPs quần thể cá hú Pangasius conchophilus 34 2.3.2 Nghiên cứu cấu trúc di truyền quần thể cá hú Pangasius conchophilus .37 CHƯƠNG - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .39 3.1 Kết nghiên cứu 39 3.1.1 Thu nhận thư viện DNA cá hú Pangasius conchophilus 39 3.1.1.1 Tách chiết DNA cá hú Pangasius conchophilus 39 3.1.1.2 Thu nhận thư viện DNA cá hú Pangasius conchophilus 40 3.1.2 Phát thị phân tử SNPs nghiên cứu di truyền quần thể cá hú Pangasius conchophilus 40 3.1.2.1 Xây dựng hệ gen tham chiếu cá hú Pangasius conchophilus 40 3.1.2.2 Phát sàng lọc thị SNPs 42 3.1.3 Khảo sát đa dạng di truyền quần thể cá hú Pangasius conchophilus phân bố khu vực hạ lưu sông Mekong 43 3.1.3.1 Khảo sát thông số đa dạng di truyền quần thể 43 3.1.3.2 Xác định khác biệt di truyền quần thể 46 3.1.4 Xây dựng cấu trúc di truyền quần thể cá hú Pangasius conchophilus phân bố khu vực hạ lưu sông Mekong 48 3.1.4.1 Cấu trúc di truyền quần thể cá hú Pangasius conchophilus dựa phần mềm STRUCTURE… 48 3.1.4.2 Cấu trúc di truyền quần thể cá hú Pangasius conchophilus dựa phương pháp phân tích thành phần (Principal Component Analysis - PCA) 49 3.1.5 Ước tính kích cỡ quần thể hiệu (Ne) .50 3.2 Thảo luận 50 3.2.1 Về đa dạng di truyền quần thể cá hú Pangasius conchophilus 50 3.2.2 Về cấu trúc di truyền quần thể cá hú Pangasius conchophilus 52 3.2.4 Về kích cỡ quần thể hiệu (Ne) .57 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .59 TÀI LIỆU THAM KHẢO .61 PHỤ LỤC vi DANH MỤC KÝ HIỆU µl Microliter µM Micromol A, T, C, G Adenine, Thymine, Guanine, Cytosine bp Base pairs Gb Gigabytes kg Kilogram km Kilometer L Chiều dài mg Milligram ml Milliliter n Số lượng mẫu W Khối lượng vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT %P Percentage of Polymorphic loci (Tỉ lệ locus đa hình) AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism (Đa hình chiều dài đoạn cắt khuếch đại) CI Confidence Interval (Khoảng tin cậy) cs Cộng ĐBSCL Đồng sông Cửu Long DNA Deoxyribonucleic Acid dNTP Deoxyribonucleoside Triphophate ezRAD enzyme Restriction-site Associated DNA FDR False Discovery Rate (Tỉ lệ phát lỗi sai) FST Fixation Index (Giá trị khác biệt di truyền) He Expected Heterozygosity (Số dị hợp tử mong đợi) Ho Observed Heterozygosity (Số dị hợp tử quan sát) IPCC Intergovernmental Panel on Climate Change (Ủy ban Liên phủ Biến đổi khí hậu) IR International Rivers (Tổ chức Sơng ngịi Quốc tế) ISSR Inter-simple Sequence Repeat IUCN International Union for Conservation of Nature (Liên minh Quốc tế Bảo tồn Thiên nhiên Tài nguyên Thiên nhiên) MRC Mekong River Commission (Ủy hội sông Mekong) MVP Minimum Viable Population (Quần thể tối thiểu loài sống được) Na Number of Different Alleles (Số alen locus) Ne Number of Effective Alleles (Số alen hiệu quả) Ne Effective population size (Kích cỡ quần thể hiệu quả) NGS Next Generation Sequencing (Giải trình tự hệ mới) viii PCA Principal Component Analysis (Phân tích thành phần chính) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng khuếch đại DNA) RAD-seq Restriction-site Associated DNA sequencing RAPD Random Amplified Pholimorphic DNA (Đa hình đoạn DNA khuếch đại ngẫu nhiên) RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (Đa hình chiều dài phân đoạn cắt giới hạn) SNPs Single Nucleotide Polymorphism (Chỉ thị đa hình nucleotide đơn) United Nations Educational Scientific and Cultural Organization UNESCO (Tổ chức Giáo dục, Khoa học Văn hóa Liên Hiệp Quốc) VNTR Variable Number of Tandem Repeat (Số lượng trình tự đoạn lặp lại) WWF World Wildlife Fund (Quỹ Quốc tế Bảo vệ Thiên nhiên) ix DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Số lượng mẫu cá hú Pangasius conchophilus thu địa điểm nghiên cứu 27 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng enzyme cắt giới hạn 31 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại thư viện DNA 33 Bảng 3.1 Thông số hệ gen tham chiếu cá hú Pangasius conchophilus dựa giá trị coverage (cutoff1) cutoff2 41 Bảng 3.2 Các thông số đa dạng di truyền quần thể cá hú Pangasius conchophilus dựa thị SNPs .45 Bảng 3.3 Giá trị khác biệt di truyền (FST) độ tin cậy (P) quần thể cá hú Pangasius conchophilus 47 Bảng 3.4 Kích cỡ quần thể hiệu (Ne) ước tính cho quần thể cá hú Pangasius conchophilus nghiên cứu hạ lưu sông Mekong 50 x 118 So, N, Maes, GE & Volckaert, FAM 2006b, ‘High genetic diversity in cryptic populations of the migratory sutchi catfish Pangasinodon hypophthalmus in the Mekong river’, Heredity, vol 96, pp 166-174 119 Sonah, H, Bastien, M, Iquira, E, Tardivel, A, Légaré, G, Boyle, B, Normandeau, E, Laroche, J, Larose, S & Jean, M 2013, ‘An improved genotyping by sequencing (GBS) approach offering increased versatility and efficiency of SNP discovery and genotyping’, PLoS ONE, vol 8, no 1, pp e54603 120 Sriphairoj, K, Na-Nakorn, U & Klinbunga, S 2018, ‘Species identification of nonhybrid and hybrid Pangasiid catfish using polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism’, Agriculture and Natural Resources, vol 52, no 1, pp 99-105 121 Takagi, AP, Ishikawa, S, Nao, T, Limsong, S, Hort, S, Thammavong, K, Saphakdy, B, Phomsouvanhm, A, Nishida, M & Kurokura, H 2011a, ‘Population structure of the climbing perch, Anabas testudineus, in the lower Mekong River basin’, Fisheries Management and Ecology, vol 18, pp 145-153 122 Takagi, AP, Ishikawa, S, Nao, T, Song, SL, Hort, S, Thammavong, K, Saphakdy, B, Phomsouvanhm, A, Nishida, M & Kurokura, H 2010, ‘Genetic differentiation and distribution routes of the bronze featherback Notopterus notopterus (Osteoglossiformes: Notopteridae) in Indochina’, Biological Journal of the Linnean Society, vol 101, pp 575-582 123 Takagi, AP, Ishikawa, S, Nao, T, Song, SL, Hort, S, Thammavong, K, Saphakdy, B, Phomsouvanhm, A, Nishida, M & Kurokura, H 2011b, ‘Genetic differentiation of Macrognathus siamensis within the Mekong River between Laos and Cambodia’, Journal of Applied Ichthyology, vol 27, pp 1150-1154 124 Tautz, D 1989, ‘Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers’, Nucleic Acids Research, vol 17, no 16, pp 6463-6471 125 Tiengtam, N, Pongpat, C & Sangchan, J 2010, ‘Feeding habits of snail eating catfish (Pangasius conchophilus Roberts & Vidthayanon, 1991) in Mekong River Nakhon Phanom province’, Proceedings of the 48th Kasetsart University Annual Conference, Kasetsart, 3-5 March, Subject: Fisheries 72 126 Toonen, RJ, Puritz, JB, Forsman, ZH, Whitney, JL, Fernandez-Silva, I, Andrews, KR & Bird, CE 2013, ‘ezRAD: a simplified method for genomic genotyping in non-model organisms’, PeerJ, vol 1, pp e203 127 Tran, HTT, Tran, TN, Tran, HNA & Nguyen, HT 2017, ‘DNA barcoding and phylogenetic relationships of nine Catfish species from Mekong basin, Vietnam’, Journal of Molecular Biomarkers & Diagnosis, vol 8, no 6, pp 363 128 Tuan, LA & Wyseure, G 2007, ‘Action plan for the multi-level conservation of forest wet lands in the Mekong River Delta, Vietnam’, International Congress on Development, Environment and Natural Resources: Multi-level and Multi-scale Sustainability, Cochabamba, Bolivia, 11-13 July 129 Tuan, LA 2010, ‘Important role of water resources in the Mekong River Delta’s agriculture’, International workshop on “Mekong Environment and Livelihood: The Changing Situation and Transboundary Implications”, Can Tho, Vietnam, - Feb 130 Vidthayanon, C 2012, ‘Pangasius conchophilus’, The IUCN Red List of Threatened Species 2012, e.T181218A1710343 131 Vos, P, Hogers, R, Bleeker, M, Reijans, M, van de Lee, T, Hornes, M, Frijters, A, Pot, J, Peleman, J, Kuiper, M & Zabeay, M 1995, ‘AFLP: a new technique for DNA fingerprinting’, Nucleic Acids Research, vol 23, no 21, pp 4407-4414 132 Wang, J 2005, ‘Estimation of effective population sizes from data on genetic markers’, Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences, vol 360, no 1459, pp 1395-1409 133 Wang, S, Meyer, E, McKay, JK & Matz, MV 2012, ‘2b-RAD: a simple and flexible method for genome-wide genotyping’, Nature Methods, vol 9, pp 808-810 134 Wang, Z, Second, G & Tanksley, SD 1992, ‘Polymorphism and phylogenetic relationship among species in the genus Oryza as determined by analysis of nuclear RFLPs’, Theoretical and Applied Genetics, vol 83, pp 565-581 135 Welsh, J & McClelland, M 1990, ‘Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers’, Nucleic Acids Research, vol 18, no 24, pp 7213-7218 136 Williams, JG, Kubelik, AR, Livak, KJ, Rafalski, JA & Tingey, SV 1990, ‘DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers’, Nucleic Acids Research, vol 18, no 22, pp 6531-6535 73 137 WWF (World Wildlife Fund) 2009a, ‘First contact in the Greater Mekong – new species discoveries’, World Wildlife Fund, Hanoi, Vietnam, 26 pp 138 WWF 2009b, ‘The Greater Mekong and climate change: Biodiversity, Ecosystem Services and Development at Risk’, World Wildlife Fund, Hanoi, Vietnam, 31 pp 139 WWF 2014, ‘Magical Mekong: New Species Discoveries 2014’, World Wildlife Fund, Washington, D.C 140 Yamamoto, S, Morita, K, Koizumi, I & Maekawa, K 2004, ‘Genetic differentiation of white-spotted charr (Salvelinus leucomaenis) populations after habitat fragmentation: Spatial–temporal changes in gene frequencies’, Conservation Genetics, vol 5, no 529-538 141 Yang, Y, Xie, B & Yan, J 2014, ‘Application of next-generation sequencing technology in forensic science’, Genomics, Proteomics & Bioinformatics, vol 12, no 5, pp 190-197 142 Yi, S, Wang, W & Zhou, X 2018, ‘Genomic evidence for the population genetic differentiation of Misgurnus anguillicaudatus in the Yangtze River basin of China’, Genomics, https://doi.org/10.1016/j.ygeno.2018.02.011 143 Yodsiri, S, Wongpakam, K, Ardharn, A, Senakun, C & Khumkratok, S 2017, ‘Population genetic structure and genetic diversity in Twisted-Jaw fish, Belodontichthys truncatus Kottelat & Ng, 1999 (Siluriformes: Siluridae), from Mekong Basin’, International Journal of Zoology, vol 2017, Article ID 5976421, pp 144 Zhao, L, Chenoweth, EL, Liu, J & Liu, Q 2016, ‘Effects of dam structures on genetic diversity of freshwater fish Sinibrama macrops in Min River, China’, Biochemical Systematics and Ecology, vol 68, pp 216-222  Tài liệu từ Internet 145 BBC 2014, ‘Recombinant DNA technology – Higher tier’, truy cập tháng 03/2018, 146 Garrison, E n.d, ‘A C + + library for parsing and manipulating VCF files’, truy cập tháng 03/2018, < https://github.com/vcflib/vcflib> 74 147 IR (International Rivers) 2017, ‘Mekong Mainstream Dams’, truy cập tháng 09/2018, 148 Natera 2016, ‘Natera's SNP-based approach’, truy cập tháng 03/2018, 149 R Core Team 2013, ‘R: A language and environment for statistical computing’, R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria, available at http://www.R-project.org/ 150 TERRA (Towards Ecological Recovery and Regional Alliance) 2015, ‘Map of Dams on the Mekong Mainstream and Tributaries’, truy cập tháng 05/2018, 151 Verrow, S, Blair, M, Packard, B & Godfrey, W n.d, ‘Gel-free size selection using SPRIselect for next generation sequencing’, truy cập tháng 09/2017, 75 PHỤ LỤC Phụ lục Nội dung Quy trình tách chiết DNA Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega) Quy trình đo hàm lượng DNA đo Qubit 2.0 Fluorometer (Invitrogen) Số trang 1 Bảng ký tự ASCII mã hóa giá trị Q – score (0 – 40) Giá trị thang đo Phred độ xác base Số lượng cá thể cá hú số lượng SNPs cịn lại sau thơng số lọc Các cặp cá thể cá hú có mối quan hệ di truyền cận huyết (relatedness) quần thể nghiên cứu Kết kiểm định outlier loci quần thể cá hú nghiên cứu phần mềm LOSITAN Số lượng cá thể quần thể sau bước sàng lọc SNPs, kiểm tra relatedness outlier loci Công thức tính số di truyền sử dụng nghiên cứu 1 1 PHỤ LỤC Quy trình tách chiết DNA Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega) Bước 1: Lấy 25 mg mô cá hú vào tube 1,5 ml nghiền nhỏ Bước 2: Thêm 275 µl Digestion Solution Master Mix (gồm thành phần đây) vào tube chứa mẫu Trộn  Nuclei Lysis Solution: 200 µl  0,5M EDTA (pH 8,0): 50 µl  Proteinase K, 20 mg/ml: 20 µl  RNase A solution, mg/ml: µl Bước 3: Ủ mẫu nhiệt độ 55°C 16 – 18 (qua đêm) Bước 4: Cho 250µl Wizard SV Lysis Buffer vào tube chứa mẫu, vortex Bước 5: Hút mẫu chuyển sang cột Wizard® SV Minicolumn Assembly Bước 6: Ly tâm cột chứa mẫu 13000 vòng/phút phút Loại bỏ dịch Bước 7: Thêm 650 µl Column Wash Solution (CWA, chứa Ethanol 95% thêm) → Ly tâm 13000 vòng/phút phút → Loại bỏ dịch (Lặp lại bước lần) Bước 8: Ly tâm 13000 vòng/phút phút để làm khô màng Bước 9: Chuyển cột Minicolumn sang ống eppendorf 1,5 ml Tiến hành rửa giải lần riêng biệt để thu hồi DNA  Lần 1: Thêm 100 µl Nuclease-Free Water Ủ phút nhiệt độ phòng → Ly tâm 13000 vòng/phút phút → Giữ lại phần dịch eppendorf  Lần 2: Thêm 100 µl Nuclease-Free Water Ủ 10 phút nhiệt độ phòng → Ly tâm 13000 vòng/phút phút → Giữ lại phần dịch eppendorf  Lần 3: Thêm 100 µl Nuclease-Free Water Ủ 15 phút nhiệt độ phòng → Ly tâm 13000 vòng/phút phút → Giữ lại phần dịch eppendorf Bảo quản DNA thu nhiệt độ – 40°C PHỤ LỤC Quy trình đo hàm lượng DNA đo Qubit 2.0 Fluorometer (Invitrogen) Bước 1: Chuẩn bị tube 0,5 ml ghi nhãn cho mẫu cần đo hàm lượng DNA mẫu chuẩn Bước 2: Pha dung dịch Qubit TM working solution theo tỷ lệ Qubit TM dsDNA HS Reagent 1:200 Qubit TM dsDNA HS Buffer Bước 3: Cho 190 µl of Qubit TM working solution cho tube chuẩn bị cho mẫu chuẩn Bước 4: Thêm 10 µl dung dịch chuẩn Qubit TM standard 1, cho tube riêng biệt, trộn đều, tránh tạo bọt Bước 5: Thêm Qubit TM working solution cho tube sử dụng để đo nồng độ DNA mẫu, thể tích cuối 200 µl Bước 6: Thêm mẫu vào tube có dung dịch Qubit TM working solution chuẩn bị trước đó, với thể tích dao động – 20 µl, trộn – giây Bước 7: Ủ nhiệt độ phòng vòng phút Bước 8: Cài đặt máy đo Qubit 2.0 cách chọn DNA, sau ấn chọn dsDNA High Sensitivity Ở hình chính, chọn Yes No để tiến hành xác định đường chuẩn Bước 9: Thiết lập đường chuẩn  Đặt tube có chứa dung dịch Standard#1 vào máy, đóng nắp, ấn READ Lấy tube  Đặt tube có chứa dung dịch Standard#2 vào máy, đóng nắp, ấn READ Lấy tube Bước 10: Đặt tuýp chứa mẫu vào vào máy, đóng nắp, ấn READ để máy đo Bước 11: Xác định nồng độ DNA công thức: Nồng độ DNA = QF value x 200/A Trong đó: QF value: Giá trị hiển thị máy Qubit A thể tích DNA cho vào ban đầu PHỤ LỤC Bảng ký tự ASCII mã hóa giá trị Q - score (0 - 40) (Nguồn: https://www.omixon.com/bioinformatics-for-beginners-file-formats-part-2-short-reads/) PHỤ LỤC Giá trị thang đo Phred độ xác base Xác suất base Tỉ lệ base khơng xác xác 10 / 10 90% 20 / 100 99% 30 / 1.000 99,9% 40 / 10.000 99,99% 50 / 100.000 99,999% Giá trị thang đo Phred (Nguồn: https://www.illumina.com/documents/products/technotes/technote_Q-Scores.pdf) PHỤ LỤC Số lượng cá thể cá hú số lượng SNPs cịn lại sau thơng số lọc Số lượng cá thể Số lượng SNPs AF (Allele Frequency) 271 70049 Remove Indels 271 46932 271 28592 271 24887 AB (Allele Balance) 271 21134 Mean Q (Quality) 271 21134 251 20955 251 13339 251 8826 Max missing 251 3785 CIGAR 251 3785 Bad loci remove 251 2595 HWE (Hardy–Weinberg equilibrium) 251 1558 Final Filtering 251 1558 Thông số lọc SAF/SAR (Number of alternate observations on the forward strand/ Number of alternate observations on the reverse strand); SRF/SRR (Number of reference observations on the forward strand/ Number of reference observations on the reverse strand) MQR/MQMR (Mapping quality of observed alternate alleles /Mapping quality of kept reference alleles) Remove lowDP (Total read depth at the locus) Individuals MeanDP (Mean Depth) PAIRED (Proportion of observed alternate alleles which are supported by properly paired read fragments) PHỤ LỤC Các cặp cá thể cá hú có mối quan hệ di truyền cận huyết (relatedness) quần thể nghiên cứu STT Kí hiệu mẫu Cặp quan hệ Chỉ số Mối quan hệ dyadml VN_AG08/VN_AG92 Sông Hậu - Sông Hậu 0,9609 Full sibling VN_AG09/VN_AG95 Sông Hậu - Sông Hậu 0,9053 Full sibling CA_KD27/CA_ST27 Kandal - Stung Treng 0,7740 Full sibling VN_AG06/VN_CT16 Sông Hậu - Sông Hậu 0,6353 Full sibling LA_PS40/LA_PS41 Pakse - Pakse 0,4799 Half sibling LA_PS06/LA_PS12 Pakse - Pakse 0,4581 Half sibling CA_ST11/VN_CT18 Stung Treng - Sông Hậu 0,2945 Half sibling CA_KD27/CA_ST20 Kandal - Stung Treng 0,1864 Cousin CA_ST20/CA_ST27 Stung Treng - Stung Treng 0,1750 Cousin 10 CA_KD18/CA_ST27 Kandal - Stung Treng 0,1684 Cousin 11 CA_ST26/CA_ST27 Stung Treng - Stung Treng 0,1671 Cousin 12 CA_KD27/VN_CT09 Kandal - Sông Hậu 0,1597 Cousin 13 CA_KD18/CA_KD27 Kandal - Kandal 0,1552 Cousin 14 CA_ST27/VN_CT09 Stung Treng - Sông Hậu 0,1537 Cousin 15 CA_KD27/LA_PS02 Kandal - Pakse 0,1491 Cousin 16 CA_KD27/VN_CT17 Kandal - Sông Hậu 0,1319 Cousin 17 CA_ST27/VN_CT19 Stung Treng - Sông Hậu 0,1171 Cousin 18 VN_DT07/VN_DT09 Sông Tiền - Sông Tiền 0,1162 Cousin 19 CA_KT24/TL_MD10 Kratie - Mukdahan 0,1107 Cousin 20 CA_KD27/LA_PS40 Kandal - Pakse 0,1088 Cousin 21 CA_ST27/VN_CT15 Stung Treng - Sông Hậu 0,1086 Cousin 22 CA_ST27/VN_CT17 Stung Treng - Sông Hậu 0,1055 Cousin PHỤ LỤC Kết kiểm định outlier loci quần thể cá hú phần mềm LOSITAN STT Kí hiệu loci Loại loci STT Kí hiệu loci Loại loci SNP_125 Balancing 22 SNP_1416 Balancing SNP_146 Balancing 23 SNP_1432 Balancing SNP_217 Balancing 24 SNP_1483 Balancing SNP_222 Balancing 25 SNP_1488 Balancing SNP_335 Balancing 26 SNP_1552 Balancing SNP_340 Balancing 27 SNP_1558 Balancing SNP_433 Balancing 28 SNP_112 Positive SNP_449 Balancing 29 SNP_163 Positive SNP_559 Balancing 30 SNP_328 Positive 10 SNP_569 Balancing 31 SNP_504 Positive 11 SNP_765 Balancing 32 SNP_551 Positive 12 SNP_905 Balancing 33 SNP_589 Positive 13 SNP_949 Balancing 34 SNP_641 Positive 14 SNP_1076 Balancing 35 SNP_678 Positive 15 SNP_1095 Balancing 36 SNP_856 Positive 16 SNP_1102 Balancing 37 SNP_877 Positive 17 SNP_1137 Balancing 38 SNP_1157 Positive 18 SNP_1148 Balancing 39 SNP_1205 Positive 19 SNP_1171 Balancing 40 SNP_1242 Positive 20 SNP_1324 Balancing 41 SNP_1288 Positive 21 SNP_1383 Balancing 42 SNP_1333 Positive Hình Kết kiểm định outlier phần mềm LOSITAN (thông số lặp lại (sims): 100000 lần; khoảng tin cậy (Confidence Interval): 95%; FDR < 0,05) Mỗi chấm tròn màu xanh tương ứng với thị SNPs (vị trí loci) Vùng màu đỏ vị trí loci có khả positive selection loci Vùng màu xám thể nơi tập trung neutral loci Vùng màu vàng vị trí loci có khả balancing selection loci PHỤ LỤC Số lượng cá thể quần thể sau bước sàng lọc SNPs, kiểm tra relatedness outlier loci Số lượng cá thể Quần thể Ban đầu Sau Sau kiểm tra Sau kiểm định sàng lọc SNPs relatedness outlier loci Loei 12 12 12 12 Mukdahan 32 30 29 29 Ubon Ratchathani 32 32 32 32 Pakse 32 28 23 23 Stung Treng 32 27 23 23 Kratie 32 31 30 30 Kandal 31 31 29 29 Sông Tiền 32 32 30 30 Sông Hậu 36 28 17 17 Tổng số 271 251 225 225 PHỤ LỤC Cơng thức tính số di truyền sử dụng nghiên cứu  %P - Percentage of polymorphic loci (Tỉ lệ locus đa hình tổng số locus): Tỷ lệ tính cách xác định số locus đa hình chia cho tổng số locus kiểm tra P = npi/ntotal Trong đó: npi tổng số locus đa hình, ntotal tổng số locus  Ho - Observed Heterozygosity (Số dị hợp tử quan sát): Số dị hợp tử quan sát chia cho tổng số lượng cá thể quần thể Ví dụ: Một quần thể có thành phần kiểu gen xAA: yAa : zaa Ho = y/(x+y+z)  He - Expected Heterozygosity (Số dị hợp tử mong đợi): Tần số dị hợp tử theo lý thuyết, tính cơng thức: He = 2pq Trong đó: p, q tần số alen quần thể p + q =  Giá trị khác biệt di truyền (FST): Giá trị FST tính tốn dựa khác biệt tần số alen quần thể theo công thức: FST = (HT – HS) / HT Trong đó: HS = (He1*N1 + He2*N2) / (N1+N2), với He1 He2 số dị hợp tử quần thể quần thể 2; N1 N2 số lượng quần thể quần thể HT = 2*p-bar *q-bar, với p-bar q-bar tần số alen quần thể  Kích cỡ quần thể hiệu (Ne): Giá trị Ne tính tốn dựa số lượng cá thể đực cá thể quần thể theo công thức: Ne = 4*Nm*Nf / (Nn + Nf) Trong đó: Nm (male) số lượng cá thể đực, Nf (female) số lượng cá thể ... quần thể 46 3.1.4 Xây dựng cấu trúc di truyền quần thể cá hú Pangasius conchophilus phân bố khu vực hạ lưu sông Mekong 48 3.1.4.1 Cấu trúc di truyền quần thể cá hú Pangasius conchophilus. .. trúc di truyền quần thể cá hú Pangasius conchophilus hạ lưu sông Mekong sử dụng phần mềm STRUCTURE 48 Hình 3.5 Cấu trúc di truyền quần thể cá hú Pangasius conchophilus hạ lưu sông Mekong. .. biệt để sử dụng cho nghiên cứu di truyền quần thể 2.3.2 Nghiên cứu cấu trúc di truyền quần thể cá hú Pangasius conchophilus  Khảo sát đa dạng di truyền quần thể cá hú Pangasius conchophilus Sau