Nghiên cứu di truyền quần thể loài cá sửu boesemania microlepis (bleeker,1858 59) tại đồng bằng sông cửu long

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG THÁI THỊ LAN PHƯƠNG NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN QUẦN THỂ LOÀI CÁ SỬU Boesemania microlepis (BLEEKER, 1858-59) TẠI ĐỒNG BẰNG SƠNG CỬU LONG LUẬN VĂN THẠC SĨ KHÁNH HỊA – 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG THÁI THỊ LAN PHƯƠNG NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN QUẦN THỂ LOÀI CÁ SỬU Boesemania microlepis (BLEEKER, 1858-59) TẠI ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành: Mã số: Quyết định giao đề tài: Quyết định thành lập HĐ: Ngày bảo vệ: Người hướng dẫn khoa học TS ĐẶNG THÚY BÌNH Cơng nghệ sinh học 60420201 89/QĐ-ĐHNT ngày 04/02/2016 685/QĐ-ĐHNT ngày 02/08/2017 19/08/2017 Chủ tịch Hội đồng: PGS.TS NGUYỄN VĂN DUY Khoa Sau đại học: KHÁNH HỊA - 2017 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu thân thực hiện, hướng dẫn TS Đặng Thúy Bình tḥc Viện Cơng nghệ Sinh học Mơi trường, Trường Đại học Nha Trang chưa cơng bố cơng trình khoa học khác thời điểm Các số liệu luận văn trung thực một phần dự án PEER – “Conservation genetics for improved biodiversity and resource management in a changing Mekong Delta” TS Đặng Thúy Bình chủ trì Nha Trang, ngày 01 tháng 07 năm 2017 Tác giả luận văn Thái Thị Lan Phương iii LỜI CẢM ƠN Để thực hoàn thành luận văn tốt nghiệp, nỗ lực phấn đấu thân, nhận nhiều giúp đỡ tổ chức cá nhân Tôi xin thể lời cảm ơn đến giúp đỡ quý báu Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành sâu sắc đến TS Đặng Thúy Bình (Viện Công nghệ Sinh học Môi trường, Trường Đại học Nha Trang) tận tình giúp đỡ hướng dẫn tơi suốt q trình thực đề tài Đồng thời xin gửi lời cảm ơn chân thành đến NCS Vũ Đặng Hạ Quyên (Viện Công nghệ Sinh học Mơi trường), Ths Đồn Vũ Thịnh (Khoa Công nghệ Thông tin), Ths Trương Thị Oanh (Viện Công nghệ Sinh học Môi trường), Ths Trần Quang Sáng (Viện Công nghệ Sinh học Môi trường) nhiệt tình hỗ trợ giúp đỡ để tơi hồn thành tốt luận văn tốt nghiệp Tôi xin gửi lời cảm ơn đến thầy giáo, cô giáo viện Công nghệ Sinh học Môi trường giảng dạy, truyền đạt kiến thức chuyên ngành bổ ích quý báu cho tơi suốt q trình học tập Cảm ơn dự án PEER – “Conservation genetics for improved biodiversity and resource management in a changing Mekong Delta” USAID tài trợ cung cấp kinh phí hỗ trợ cho thực nghiên cứu Cuối cùng, xin dành biết ơn to lớn đến gia đình, người thân bạn bè ln đợng viên, chỗ dựa tinh thần giúp vượt qua khó khăn suốt thời gian qua Do thời gian kiến thức hạn chế nên luận văn tốt nghiệp tơi khơng thể tránh khỏi thiếu sót, tơi mong nhận đóng góp ý kiến quý thành viên Hội đồng để luận văn hồn thiện Tơi xin chân thành cảm ơn! Tác giả luận văn Thái Thị Lan Phương iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN iii LỜI CẢM ƠN iv MỤC LỤC .v DANH MỤC BẢNG x DANH MỤC HÌNH xi TRÍCH YẾU LUẬN VĂN xiii MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan đối tượng nghiên cứu 1.1.1 Vị trí phân loại đặc điểm sinh học cá sửu Boesemania microlepis Bleeker, 1858-59 .4 1.1.2 Tập tính sống phân bố 1.2 Tổng quan vùng nghiên cứu 1.3 Tổng quan phương pháp nghiên cứu 12 1.3.1 Chỉ thị phân tử ứng dụng nghiên cứu di truyền quần thể 12 1.3.1.1 RAPD .12 1.3.1.2 RFLP 12 1.3.1.3 AFLP 12 1.3.1.4 Microsatellite/SSRs 13 1.3.1.5 SNPs 13 1.3.2 Phương pháp giải trình tự 14 1.3.2.1 Phương pháp Sanger 14 1.3.2.2 Phương pháp PyroSequencing 15 1.3.2.3 Phương pháp giải trình tự hệ (Next generation sequencing - NGS) 16 1.3.3 Tổng quan kỹ thuật RAD Sequencing ezRAD Sequencing 21 1.3.3.1 Kỹ thuật RAD Sequencing 21 1.3.3.2 Kỹ thuật ezRAD Sequencing 21 1.4 Tổng quan tình hình nghiên cứu liên quan đến nợi dung đề tài 23 1.4.1 Tổng quan tình hình nghiên cứu di truyền quần thể cá sông Mekong 23 1.4.1.1 Nghiên cứu nước 23 v 1.4.1.2 Nghiên cứu nước .24 1.4.2 Tổng quan tình hình nghiên cứu di truyền quần thể cá sửu Boesemania microlepis (Bleeker, 1858-59) lưu vực sông Mekong 26 1.4.3 Một số nghiên cứu di truyền quần thể dựa vào phương pháp RADseq 26 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Đối tượng, địa điểm nghiên cứu phương pháp thu mẫu 28 2.2 Phương pháp nghiên cứu di truyền cá sửu Boesemania microlepis 29 2.2.1 Sơ đồ tổng quát nghiên cứu di truyền cá sửu Boesemania microlepis 29 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu di truyền quần thể cá sửu Boesemania microlepis ứng dụng cơng nghệ giải trình tự hệ 30 2.2.2.1 Thu nhận thư viện gen ezRAD cá sửu Boesemania microlepis 30 2.2.2.2 Xây dựng hệ gen tham chiếu cá sửu Boesemania microlepis 34 2.2.2.3 Phát thị SNPs quần thể cá sửu Boesemania microlepis 38 2.2.2.4 Nghiên cứu cấu trúc quần thể cá sửu Boesemania microlepis 38 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .41 3.1 Thu nhận thư viện gen ezRAD cá sửu Boesemania microlepis 41 3.1.1 Tách chiết DNA cá sửu Boesemania microlepis 41 3.1.2 Thu nhận thư viện gen ezRAD cá sửu Boesemania microlepis .42 3.2 Xây dựng hệ gen tham chiếu cá sửu Boesemania microlepis 43 3.3 Phát thị phân tử SNPs nghiên cứu di truyền quần thể cá sửu Boesemania microlepis 47 3.4 Xây dựng cấu trúc quần thể cá sửu Boesemania microlepis 49 3.4.1 Khảo sát đa dạng di truyền quần thể cá sửu Boesemania microlepis khu vực nghiên cứu 49 3.4.2 Xác định khoảng cách di truyền quần thể cá sửu Boesemania microlepis khu vực nghiên cứu .49 3.4.3 Xây dựng cấu trúc quần thể cá sửu Boesemania microlepis khu vực nghiên cứu .53 3.4.3.1 Cấu trúc quần thể cá sửu Boesemania microlepis dựa phương pháp phân tích nhóm sử dụng phần mềm STRUCTURE .53 3.4.3.2 Cấu trúc quần thể cá sửu Boesemania microlepis dựa phương pháp phân tích tọa đợ PCoA 55 vi 3.4.3.3 Cấu trúc quần thể cá sửu Boesemania microlepis dựa phương pháp phân tích DAPC 56 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO 72 vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT µL Microlite µM Micromol AB Allele Balance AC Allele Count AF Allele Frequency AMFC Assessment of Mekong Fisheries AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism BIC bp Bayesian Information Criterion Base pairs DAPC Principal Coordinates Analysis DNA Deoxyribonucleic acid ĐBSCL Đồng sông Cửu Long ezRAD ez Restriction-site Associated DNA GBS Genotype By Sequencing IPCC Intergovernmental Panel on Climate Change MRC Mekong River Commission n Số lượng mẫu NGS Next Generation Sequencing PCoA Discriminant Analysis of Principal Components PCR Polymerase Chain Reaction Q RAD Quality Restriction site Associated DNA Sequencing viii RADP RE Random Amplified Pholimorphic DNA Restriction enzyme SNPs Single-nucleotide polymorphism SPB Sample Purification Beads UNDP United Nations Development Programme ix DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Số lượng mẫu cá sửu Boesemania microlepis thu địa điểm 28 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng enzyme cắt giới hạn 31 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR để khuếch đại thư viện gen ezRAD 34 Bảng 2.4 Bộ ký tự ASCII mã hóa giá trị Q – score – 40 36 Bảng 2.5 Giá trị thang đo Phred 36 Bảng 2.6 Logarit khoảng cách địa lý quần thể cá sửu Boesemania microlepis 39 Bảng 3.1 Số lượng cá thể cá sửu Boesemania microlepis sau chọn lọc chất lượng 44 Bảng 3.2 Thông số hệ gen tham chiếu cá sửu Boesemania microlepis dựa giá trị coverage (cutoff1) cutoff2 .45 Bảng 3.3 Kết sàng lọc SNPs cá sửu Boesemania microlepis 47 Bảng 3.4 Số lượng cá thể cá sửu Boesemania microlepis trước sau sàng lọc SNPs 48 Bảng 3.5 Các thông số đa dạng di truyền quần thể cá sửu Boesemania microlepis dựa thị SNPs 50 Bảng 3.6 Chỉ số sai khác di truyền FST độ tin cậy P quần thể cá sửu Boesemania microlepis 50 Bảng 3.7 Phân tích AMOVA quần thể cá sửu Boesemania microlepis .51 Bảng 3.8 Kết phân nhóm quần thể cá sửu Boesemania microlepis (K=3) khu vực nghiên cứu dựa phần mềm STRUCTURE .54 x 36 Hori, H 2000, The Mekong: Environment and Development, United Nations University Publications 37 Huang, HH, Li-Li, X, Zai-Kang, T, Er-Pei, L, Qing-Po, L, Long-Jun, C & Mu-Yuan, Z 2012, ‘De novo characterization of the Chinese fir (Cunninghamia lanceolata) transcriptome and analysis of candidate genes involved in cellulose and lignin biosynthesis’, BMC Genomics, vol 13, no 648, doi: 10.1186/1471-2164-13-648 38 Hurwood, DA, Adamson, EAS & Mather, PB 2008, ‘Evidence for strong genetic structure in a regionally important, highly vagile cyprinid (Henicorhynchus lobatus) in the Mekong river basin’, Ecol Freshw Fish., vol 17, pp 273–283 39 Iranawati, F 2014, ‘An assessment of the geographical scale of recurrent gene flow in wild populations of two species of Mekong River Carps (Henicorhynchus spp.)’, The dissertation is submitted in fulfilment of requirements for the degree of Doctor of Philosophy, Queensland University ofTechnology, Australia 40 Intergovernmental Panel on Climate Change (IPCC) 2007, ‘Climate Change 2007: Impacts, Adaptation and Vulnerability’, Fourth Assessment Report and Summary for Policymakers, Geneva: IPCC 41 International Rivers 2013, ‘The Lower Mekong dams factsheet text’, International Rivers Report Available at http://www.internationalrivers.org/resources/the-lowerMekong-dams-factsheet-text7908 42 Jombart, T, Devillard, S & Balloux, F 2010, ‘Discriminant analysis of principal components: a new method for the analysis of genetically structured populations’, BMC Genetics, vol 11, pp 94 43 Klinbunga, S, Natechanok, T, Vasin, Y, Kannika, K, Bavornlak, K & Piamsak, M 2010, ‘Species identification of the blue swimming crab Portunus pelagicus in Thai waters using mtDNA and RAPD - derived SCAR markers’, Aquaculture, doi:10.1016/j.aquaculture.2010.06.033 44 Koboldt, DC, Chen, K, Wylie, T, Larson, DE, McLellan, MD, Mardis, ER & Ding, L 2009, ‘VarScan: variant detection in massively parallel sequencing of individual 75 and pooled samples’, Bioinformatics, vol 25, no 17, pp 2283–2285 doi:10.1093/bioinformatics/btp373 45 Koboldt, DC, Zhang, Q, Larson, DE, Shen, D, McLellan, MD, Lin, L & Wilson, RK 2012, ‘VarScan 2: somatic mutation and copy number alteration discovery in cancer by exome sequencing’, Genome Research, vol 22, no 3, pp 568–76 doi:10.1101/gr.129684.111 46 Krück, NC, Innes, DI & Ovenden, JR 2013, ‘New SNPs for population genetic analysis reveal possible cryptic speciation of eastern Australian sea mullet (Mugil cephalus)’, Molecular Ecology Resources, vol 13, no 4, pp 715–725 47 Legendre, P & Legendre, L 1998, Numerical Ecology, 2nd English Edition, Elsevier 48 Li, W & Godzik, A 2006, ‘Cd-hit: a fast program for clustering and comparing large sets of protein or nucleotide sequences’, Bioinformatics, vol 22, no 13, pp 1658-1659 49 Li, H & Durbin, R 2009, ‘Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform’, Bioinformatics, vol 25, no 14, pp 1754–1760 doi:10.1093/bioinformatics/btp324 50 Mardis, ER 2008, ‘Next‐generation DNA sequencing methods’, Annu Rev Genomics Hum Genet, vol 9, pp 387–402 51 Mat Jais, AM, Abdul Rahim, MH, Alias, R & Muhammad, N 2009, ‘Genetic marker for haruan Channa striatus’, Procedings of the 8th Malaysia Congress on Genetics 2009, Genting Highland, Malaysia, pp 29 52 Mekong River Commission (MRC) 2005, ‘Overview of the Hydrology of the Mekong Basin’, Mekong River Commission report 53 Mekong River Commission (MRC) 2011, ‘Atlas planning of the Lower Mekong River Basin’, Mekong River Commission Cambodia, Lao PDR, Thailand, Vietnam 76 54 Mekong River Commission (MRC) 2010, ‘State of the Basin Report 2010’, Mekong River Commission, Vientiane, Lao PDR 55 Miller, TL & Cribb, TH 2007, ‘Phylogenetic relationships of some common Indo-Pacific snappers (Perciformes: Lutjanidae) based on mitochondrial DNA sequences, with comments on the taxonomic position of the Caesioninae’, Molecular phylogenetics and evolution, vol 44, no 1, pp 450–60 56 MOC/China 2004, Lancang River, Ministry of Culture, Beijing, China 57 Morin, PA, Luikart, G & Wayne, RK 2004, ‘SNPs in ecology, evolution and conservation’, Trends in Ecology & Evolution, vol 19, pp 208 58 Morozova, O & Marco, AM 2008, ‘Applications of next-Generation Sequencing Technologies in Functional Genomics’, Genomics, vol 92, no 5, pp 255– 264 59 Ngamsiri, T, Nakajima, M, Sukmanomon, S, Sukumasavin, N, Kamonrat, W, Na-kakorn, U & Taniguchi, N 2007, ‘Genetic diversity of wild Mekong giant catfish Pangasianodon gigas collected from Thailand and Cambodia’, Fisheries science, vol 73, no 4, pp 792–799 doi: 10.1111/j.1444-2906.2007.01398.x 60 Nguyen, TT & Sunnucks, P 2012, ‘Strong population genetic structure and its management implications in the mud carp Cirrhinus molitorella, an indigenous freshwater species subject to an aquaculture and culture-based fishery’, Journal of Fish Biology, vol 80, pp 651 61 Park, LK & Moran, P 1994, ‘Developments in molecular genetic techniques in fisheries’, Fish Biology and Fisheries, vol 4, pp 272–299 62 Peakall, R & Smouse, PE 2012, ‘GenAlEx 6.5: genetic analysis in Excel Population genetic software for teaching and research-an update’, Bioinformatics, vol 28, pp 2537-2539 63 Paetkau, D 1999, ‘Using genetics to identify intraspecific conservation units: a critique of current methods’, Conserv Biol., vol 13, pp 1507-1509 77 64 Pecoraro, C, Babbucci, M, Villamor, A, Franch, R, Papetti, R, Leroy, B, Garcia, S, Muir, J, Rooker, J, Arocha, F, Murua, H, Zudaire, I, Chassot, E, Bodin, N, Tinti, B, Bargelloni, L & Cariani, A 2016, ‘Methodological assessment of 2bRAD genotyping technique for population structure inferences in yellowfintuna (Thunnus albacares)’, Marine Genomics, vol 25, pp 23 – 48 65 Peterson, BK, Weber, JN, Kay, EH, Fisher, HS & Hoekstra, HE 2012, ‘Double digest RADseq: An inexpensive method for de novo SNP discovery and genotyping in model and non-model species’, PLos One, vol 7, no 66 Pham Van Mien 2002, ‘Draft report on Review Biological Assessment of Freshwater Ecosystems in Viet Nam’, Viet Nam National Mekong Committee Enviromental Program, pp 1–30 67 Pierce, BA 2003, Genetics – A Conceptual Approach, W.H.Freeman & Company, England 68 Poland, J , Brown, PJ, Sorrells, ME & Jannink, JL 2012, ‘Development of high-density genetic maps for barley and wheat using a novel twoenzyme genotypingby-sequencing approach’, PloS one, vol 7, no 2, pp e32253 69 Pool, JE, Hellmann, I, Jensen, JD & Nielsen, R 2010, ‘Population genetic inference from genomic sequence variation’, Genome Res., vol 20, no 3, pp 291–300 70 Poulsen, AF, Valbo-Jorgensen, J, Chan, S, Chhuon, CK, Hortle, KG, Bouakhamvongsa, K, Viravong, S, Suntornratana, U, Yoorong, N, Tran, QB & Nguyen, TT 2005, Distribution and ecology of some important river fish species of the Mekong River Basin, Mekong River Basin Technical Paper, Vientiane, 120 pp 71 Poulsen, AF & Valbo-Jørgensen, J 2001, ‘Deep pools in the Mekong River’, Mekong Fish Catch and Culture, vol 7, no 1, pp 8-9 72 Pritchard, JK, Stephens, M, Rosenberg, NA & Donnelly, P 2000, ‘Association Mapping in Structured Populations’, Am J Hum Genet., vol 67, pp 170– 181 73 Rainboth, WJ 1996, Fishes of the Cambodian Mekong, FAO Species Identification Field Guide for Fishery Purposes, FAO, Rome, 265 pp 78 74 Robert, TR & Baird, IG 1995, ‘Traditional fisheries and fish ecology on the Mekong River at Khone waterfalls in southern Laos’, Nat Hist Bull Siam Soc., vol 43, pp 219-262 75 Rousset, F 1997, ‘Genetic differentiation and estimation of gene flow from F-statistics under isolation by distance’, Genetics, vol 145, pp 1219-1228 76 Sanger F, Nicklen, S & Coulson AR 1977, ‘DNA sequencing with chainterminating inhibitors’, Proc Natl Acad Sci, vol 74, no 12, pp 5463–5467 77 Sasaki, K 2001, ‘Sciaenidae Croakers (drums)’, in Carpenter, KE & Niem, VH(eds.), FAO species identification guide for fishery purposes-The living marine resources of the Western Central Pacific, Volume Bony fishes part (Menidae to Pomacentridae), Rome, FAO, pp 2791-3380 78 Schmitt, K 2009, ‘Management of Natural Resources in the Coastal Zone of Soc Trang Province’, Mekong Delta Climate Change Forum, vol 3, pp 76 79 So, N, Maes, GE & Volckaert, FA 2006b, “High genetic diversity in cryptic populations of the migratory sutchi catfish Pangasianodon hypophthalmus in the Mekong River”, Heredity (Edinb), vol 96, no 2, pp 166-174 80 So, N, Jeroen, K, Van Houdt, J & Volckaert, AM 2006a, ‘Genetic Diversity and Population History of the Migratory Catfishes Pangasianodon hypophthalmus and Pangasius bocourti in the Cambodian Mekong River’, Fisheries Science, vol 72, no 3, pp 469–76 http://dx.doi.org/10.1111/j.1444-2906.2006.01174.x 81 Stockwell, BL, Wesley, A.L, Ryan, KW, Rene, AA, Lisa, WS & Kent, EC 2015, ‘The application of genomics to inform conservation of a functionally important reef fish (Scarus niger) in the Philippines’, Research Article, vol 17, pp 239–249, doi10.1007/s10592-015-0776-3 82 Syvitski, JPM, Kettner, AJ, Overeem, I, Hutton EWH, Hannon, MT, Brakenridge GR, Day, J, Vörösmarty, C, Saito, Y, Giosan, L & Nicholls, RJ 2009, ‘Sinking Deltas due to Human Activities’, Nature Geosci, vol 2, no 10, pp 681–686, http://dx.doi.org/10.1038/ngeo629 79 83 Toonen, RJ, Puritz, JB, Forsman, ZH, Whitney, JL, Fernandez-Silva, I, Andrews, KR & Bird, CE 2013, ‘ezRAD: a simplified method for genomic genotyping in non-model organisms’, PeerJ, http://dx.doi.org/10.7717/peerj.203 84 United Nations Development Programme (UNDP) in Viet Nam 2008, ‘Human Development Report’, United Nations Development Programme in Viet Nam report, Ha Noi, Viet Nam 85 Vu, VA, Nguyen, ND, Hidas, E & Nguyen, MN 2009, ‘Vam Nao Deep Pools: A Critical Habitat for Pangasius krempfi and other Valuable Species in the Mekong Delta, Vietnam’, Asian Fisheries Science, vol 22, pp 631-639 86 Wang, S, Meyer, E, McKay, JK & Matz, MV 2012, ‘2b-RAD: a simple and flexible method for genome-wide genotyping, Nat Methods, vol 9, no 8, pp 808–810 87 Williams, LM, Ma, X, Boyko, AR, Bustamante, CD & Oleksia, MF 2010, ‘SNP identification, verification, and utility for population genetics in a non-model genus’, BMC Genetics, vol 11, no 32 https://doi.org/10.1186/1471-2156-11-32 88 Zeisset, I & Beebee, TJC 2001, ‘Determination of biogeographical range: an application of molecular phylogeography to the European pool frog Rana lessonae’, Proceedings of the Royal Society of London, Series B, Biological Sciences, pp 933–938  Tài liệu từ Internet Applied Biological Materials 2017, ‘Next Generation Sequencing (NGS) Experimental Design’, abmGood, truy cập tháng 6/2017, BBC 2014, ‘Recombinant DNA technology - Higher tier’, truy cập tháng 6/2017, Centre for Genomic Sciences-HongKong 2017, ‘Technology Overview’, truy cập tháng 6/2017, 80 Dametto, P 2011, ‘Sequencing technologies-The next generation’, truy cập tháng 6/2017, Illumina 2011, ‘Quality Scores for Next-Generation Sequencing’, truy cập tháng 6/2017, Illumina Inc 2013, ‘Illumina Sequencing Technology’, truy cập tháng 6/2017, IUCN Red List 2011, ‘The IUCN Red List of Threatened Species 2011’, truy cập tháng 6/2017, Natera 2016, ‘Natera's SNP-based approach’, truy cập tháng 6/2017, Omixon 2013, ‘Bioinformatics for Beginners-File Formats Part 2-Short reads’, truy cập tháng 6/2017, 10 Puritz, J 2017, ‘dDocent - RADSeq Bioinformatics and Beyond’, truy cập tháng 6/2017, 11 Stuart, S 2013, ‘The Mechanisms of DNA Replication’, truy cập tháng 6/2017, 12 Tổng cục Thống kê Việt Nam 2015, ‘Diện tích, dân số mật đợ dân số phân theo địa phương’, truy cập tháng 6/2017, 13 Ubuntu 2017, ‘Dowload Ubuntu’, truy cập tháng 6/2017, 14 Verrow, S, Blair, M, Packard, B & Godfrey, W n.d, ‘Gel-Free Size Selection Using SPRIselect For Next Generation Sequencing’, truy cập tháng 6/2017, 15 Water Policy International 2014, ‘Mekong River Basic’, truy cập tháng 6/2017, 81 PHỤ LỤC Phụ lục Nội dung Số trang QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT ADN BẰNG KIT QIAGEN QUY TRÌNH ĐO HÀM LƯỢNG DNA BẰNG MÁY ĐO QUBIT 2.0 MẪU VÀ NỒNG ĐỘ DNA TƯƠNG ỨNG CỦA TỪNG CÁ THỂ CÁ SỬU Boesemania microlepis BẢNG ADAPTER ĐƯỢC GẮN CHO TỪNG CÁ THỂ CÁ SỬU Boesemania microlepis KHOẢNG CÁCH ĐỊA LÝ TỰ NHIÊN GIỮA CÁC QUẦN THỂ CÁ SỬU Boesemania microlepis GIÁ TRỊ FST/(1-FST) GIỮA CÁC QUẦN THỂ CÁ SỬU Boesemania microlepis CƠNG THỨC TÍNH CÁC CHỈ SỐ ĐƯỢC SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU PHỤ LỤC QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT ADN BẰNG KIT QIAGEN Bước 1: Lấy 32 mg mẫu mô cá sửu cho vào tube 1,5 ml Bước 2: Thêm 180 µl đệm ATL 20 µl proteinase K, mix Bước 3: Ủ 560C mẫu tan hoàn toàn, mix 15s Bước 4: Thêm 200 µl Buffer AL, mix Bước 5: Thêm 200 µl ethanol (96 – 1000C), mix Bước 6: Dùng pipet hút tồn bợ dịch chuyển sang tube có cợt lọc ml (có sẵn) Bước 7: Ly tâm 8.000 vịng/phút phút Bước 8: Loại bỏ dịch thu cột lọc Bước 9: Đặt cột lọc sang tube ml (có sẵn) Bước 10: Thêm 500 µl đệm AW1, ly tâm phút 8.000 vịng/phút Bước 11: Loại bỏ dịch thu cợt lọc Bước 12: Đặt cột lọc sang tube ml (có sẵn) Bước 13: Thêm 500 µl Buffer AW2, ly tâm phút 13.000 vòng/phút Bước 14: Loại bỏ dịch chuyển cột lọc sang tube 1,5 ml (khơng có sẵn) Bước 15: Thêm 50 µl đệm AE, ủ 3-5 phút nhiệt đợ phòng, ly tâm phút 8.000 vòng/phút thu 100 µl bảo quản DNA -200C PHỤ LỤC QUY TRÌNH ĐO HÀM LƯỢNG DNA BẰNG MÁY ĐO QUBIT 2.0 Bước 1: Chuẩn bị tube 0,5 ml ghi nhãn cho mẫu cần đo hàm lượng DNA mẫu chuẩn Bước 2: Pha dung dịch Qubit TM working solution theo tỷ lệ Qubit TM dsDNA HS Reagent 1:200 Qubit TM dsDNA HS Buffer Bước 3: Cho 190 µl of Qubit TM working solution cho tube chuẩn bị cho mẫu chuẩn Bước 4: Thêm 10 µl dung dịch chuẩn Qubit TM standard 1,2 cho tube riêng biệt, mix đều, tránh tạo bọt Bước 5: Thêm Qubit TM working solution cho tube sử dụng để đo nồng đợ DNA mẫu, thể tích cuối 200µl Bước 6: Thêm mẫu vào tube có dung dịch Qubit TM working solution chuẩn bị trước đó, với thể tích dao đợng - 20µl, mix 2-3 giây Bước 7: Đặt nhiệt đợ phịng vịng phút Bước 8: Cài đặt máy đo Qubit 2.0 cách chọn DNA, sau ấn chọn dsDNA High Sensitivity Ở hình chính, chọn Yes No để tiến hành xác định đường chuẩn Bước 9: Thiết lập đường chuẩn  Đặt tube có chứa dung dịch Standard#1 vào máy, đóng nắp, ấn READ Lấy tube  Đặt tube có chứa dung dịch Standard#2 vào máy, đóng nắp, ấn READ Lấy tube Bước 10: Đặt tuýp chứa mẫu vào vào máy, đóng nắp, ấn READ để máy đo Bước 11: Xác định nồng độ DNA công thức: Nồng độ DNA = QF value x 200/A Trong đó: QF value: Giá trị hiển thị máy Qubit A thể tích DNA cho vào ban đầu PHỤ LỤC MẪU VÀ NỒNG ĐỘ DNA TƯƠNG ỨNG CỦA TỪNG CÁ THỂ CÁ SỬU Boesemania microlepis An Giang Tên Nồng mẫu đợ (ng/µl) AG1 11,50 AG2 12,10 AG3 4,31 AG4 7,96 AG5 4,40 AG6 6,02 AG7 7,48 AG8 11,04 AG9 4,83 AG10 7,26 AG11 6,68 AG12 7,34 AG13 8,30 AG14 9,44 AG15 10,66 AG16 4,76 AG17 16,69 AG18 5,90 AG19 8,56 AG20 13,40 AG21 17,08 AG22 14,11 AG23 9,01 AG24 12,02 AG25 16,10 AG26 5,96 AG27 4,67 AG28 11,94 AG29 7,52 AG30 6,99 Đồng Tháp Tên Nồng mẫu đợ (ng/µl) ĐT1 17,65 ĐT2 9,13 ĐT3 5,97 ĐT4 11,08 ĐT5 7,65 ĐT 14,19 ĐT 5,69 ĐT8 8,34 ĐT9 10,37 ĐT10 9,48 ĐT11 18,67 ĐT12 12,36 ĐT13 6,53 ĐT14 13,75 ĐT15 12,89 ĐT16 6,26 ĐT17 5,34 ĐT18 10,53 ĐT19 8,62 ĐT20 8,59 ĐT21 14,46 ĐT22 6,79 ĐT23 10,23 ĐT24 7,94 ĐT25 ĐT26 ĐT27 ĐT28 ĐT29 Sóc Trăng Tên Nồng mẫu đợ (ng/µl) ST1 5,73 ST2 14,33 ST3 7,20 ST4 11,30 ST5 9,04 ST6 16,28 ST7 17,33 ST8 19,44 ST9 17,65 ST10 21,60 ST11 21,40 ST12 17,23 ST13 16,68 ST14 9,93 ST15 9,90 ST16 10,97 ST17 10,84 ST18 14,03 ST19 15,53 ST20 27,20 ST21 13,60 ST22 18,22 ST23 17,33 ST24 19,13 ST25 23,40 ST26 24,80 ST27 23,60 ST28 17,51 ST29 15,22 Trà Vinh Tên Nồng mẫu đợ (ng/µl) TV1 4,96 TV2 7,26 TV3 7,28 TV4 13,18 TV5 14,37 TV6 11,12 TV7 10,27 TV8 10,73 TV9 7,40 TV10 7,61 TV11 3,23 TV12 6,62 TV13 9,38 TV14 5,91 TV15 12,77 TV16 8,23 TV17 9,32 TV18 10,47 TV19 7,74 TV20 4,91 TV21 8,76 TV22 12,16 TV23 6,56 TV24 4,93 TV25 10,60 Siem Reap Tên Nồng mẫu đợ (ng/µl) SR1 17,61 SR2 6,53 SR3 12,93 SR4 11,46 SR5 12,52 SR6 14,00 SR7 20,20 SR8 14,83 SR9 22,20 SR10 7,63 SR11 22,20 SR12 10,30 SR13 15,03 SR14 10,82 SR15 4,94 SR16 8,96 SR17 22,40 SR18 9,40 SR19 12,40 SR20 10,21 SR21 8,20 PHỤ LỤC BẢNG ADAPTER ĐƯỢC GẮN CHO TỪNG CÁ THỂ CÁ SỬU Boesemania microlepis Quần thể An Giang GAGATTCC-TATAGCCT AG1 TCCGGAGA-GTACTGAC AG2 TCCGGAGA-GGCTCTGA AG3 TCCGGAGA-TAATCTTA AG4 AGCGATAG-GGCTCTGA AG5 AGCGATAG-CCTATCCT AG6 TAATGCGC-GTACTGAC AG7 CGCTCATT-GGCTCTGA AG8 CGCTCATT-CCTATCCT AG9 TCTCGCGC-CCTATCCT AG10 TCTCGCGC-ATAGAGGC AG11 TCTCGCGC-TATAGCCT AG12 CGGCTATG-GGCTCTGA AG13 CGGCTATG-CCTATCCT AG14 CGGCTATG-ATAGAGGC AG15 CGGCTATG-TATAGCCT AG16 TCCGCGAA-CAGGACGT AG17 TCCGCGAA-TAATCTTA AG18 TCCGCGAA-AGGCGAAG AG19 TCCGCGAA-GGCTCTGA AG20 TCCGCGAA-CCTATCCT AG21 TCCGCGAA-ATAGAGGC AG22 TCCGCGAA-TATAGCCT AG23 TCCGGAGA-ATAGAGGC AG24 CGCTCATT-TAATCTTA AG25 CTGAAGCT-GGCTCTGA AG26 TAATGCGC-CAGGACGT AG27 TAATGCGC-TAATCTTA AG28 TAATGCGC-AGGCGAAG AG29 TAATGCGC-GGCTCTGA AG30 Quần thể Sóc Trăng AGCGATAG-TATAGCCT ST1 AGCGATAG-ATAGAGGC ST2 AGCGATAG-CCTATCCT ST3 GAATTCGT-TAATCTTA ST AGCGATAG-GGCTCTGA ST TCTCGCGC-TATAGCCT ST TCTCGCGC-ATAGAGGC ST TCTCGCGC-CCTATCCT ST TCTCGCGC-GGCTCTGA ST TCTCGCGC-AGGCGAAG ST10 TCTCGCGC-TAATCTTA ST11 TCTCGCGC-CAGGACGT ST12 TCTCGCGC-GTACTGAC ST13 Quần thể Đồng Tháp TCCGGAGA-TATAGCCT ĐT1 CGCTCATT-ATAGAGGC ĐT2 CGCTCATT-CCTATCCT ĐT3 CGCTCATT-GGCTCTGA ĐT4 CGCTCATT-AGGCGAAG ĐT5 CGCTCATT-TAATCTTA ĐT CGCTCATT-CAGGACGT ĐT CGCTCATT-GTACTGAC ĐT8 ATTCAGAA-ATAGAGGC ĐT9 ATTCAGAA-CCTATCCT ĐT10 ATTCAGAA-GGCTCTGA ĐT11 ATTCAGAA-AGGCGAAG ĐT12 ATTCAGAA-TAATCTTA ĐT13 ATTCAGAA-CAGGACGT ĐT14 ATTCAGAA-GTACTGAC ĐT15 TAATGCGC-ATAGAGGC ĐT16 TAATGCGC-CCTATCCT ĐT17 TAATGCGC-GGCTCTGA ĐT18 TAATGCGC-AGGCGAAG ĐT19 GAGATTCC-TATAGCCT ĐT20 ATTCAGAA-TATAGCCT ĐT21 GAATTCGT-TATAGCCT ĐT22 CGGCTATG-CCTATCCT ĐT23 ATTCAGAA-TATAGCCT ĐT24 ATTCAGAA-AGGCGAAG ĐT25 ATTCAGAA-GGCTCTGA ĐT26 GAATTCGT-GTACTGAC ĐT27 GAATTCGT-CAGGACGT ĐT28 GAATTCGT-TAATCTTA ĐT29 Quần thể Trà Vinh AGCGATAG-GTACTGAC TV1 AGCGATAG-CAGGACGT TV2 AGCGATAG-TAATCTTA TV3 AGCGATAG-AGGCGAAG TV4 CTGAAGCT-GGCTCTGA TV5 CTGAAGCT-AGGCGAAG TV6 GAATTCGT-GTACTGAC TV7 GAATTCGT-CAGGACGT TV8 GAATTCGT-AGGCGAAG TV9 GAATTCGT-GGCTCTGA TV10 GAATTCGT-CCTATCCT TV11 GAATTCGT-ATAGAGGC TV12 GAATTCGT-TATAGCCT TV13 TCCGCGAA-TATAGCCT ST14 TCCGCGAA-ATAGAGGC ST15 TCCGCGAA-CCTATCCT ST16 TCCGCGAA-GGCTCTGA ST17 TCCGCGAA-AGGCGAAG ST18 TCCGCGAA-TAATCTTA ST19 TCCGCGAA-CAGGACGT ST20 TCCGCGAA-GTACTGAC ST21 CGGCTATG-TATAGCCT ST22 CGGCTATG-ATAGAGGC ST23 CGGCTATG-CCTATCCT ST24 CGGCTATG-GGCTCTGA ST25 CGGCTATG-AGGCGAAG ST26 CGGCTATG-TAATCTTA ST27 CGGCTATG-CAGGACGT ST28 CGGCTATG-GTACTGAC ST29 Quần thể Seam Reap TAATGCGC-TATAGCCT SR1 TAATGCGC-ATAGAGGC SR2 TAATGCGC-CCTATCCT SR3 TAATGCGC-GGCTCTGA SR4 TAATGCGC-AGGCGAAG SR5 TAATGCGC-TAATCTTA SR6 TAATGCGC-CAGGACGT SR7 TAATGCGC-GTACTGAC SR8 AGCGATAG-AGGCGAAG SR9 CTGAAGCT-TATAGCCT SR10 CTGAAGCT-ATAGAGGC SR11 CTGAAGCT-CCTATCCT SR12 CTGAAGCT-GGCTCTGA SR13 CTGAAGCT-AGGCGAAG SR14 GAATTCGT-CAGGACGT SR15 CTGAAGCT-TAATCTTA SR16 CTGAAGCT-CAGGACGT SR17 AGCGATAG-CAGGACGT SR18 AGCGATAG-GTACTGAC SR19 AGCGATAG-CAGGACGT SR20 AGCGATAG-GTACTGAC SR21 TV14 TV15 TV16 TV17 TV18 TV19 TV20 TV21 TV22 TV23 TV24 TV25 CTGAAGCT-CAGGACGT CGGCTATG-AGGCGAAG TCTCGCGC-TATAGCCT TCTCGCGC-ATAGAGGC TCTCGCGC-CCTATCCT CTGAAGCT-CCTATCCT CTGAAGCT-ATAGAGGC CTGAAGCT-TATAGCCT GAGATTCC-GTACTGAC GAGATTCC-CAGGACGT GAGATTCC-TAATCTTA GAGATTCC-AGGCGAAG PHỤ LỤC KHOẢNG CÁCH ĐỊA LÝ TỰ NHIÊN GIỮA CÁC QUẦN THỂ CÁ SỬU Boesemania microlepis Siem Reap An Giang Đồng Tháp Sóc Trăng Siem Reap - An Giang 376,26 - Đồng Tháp 418,22 57,95 - Sóc Trăng 553,45 177,19 197,65 - Trà Vinh 597,77 186,35 179,55 303,02 Trà Vinh Đơn vị: km PHỤ LỤC GIÁ TRỊ FST/(1-FST) GIỮA CÁC QUẦN THỂ CÁ SỬU Boesemania microlepis Siem Reap An Giang Đồng Tháp Sóc Trăng Siem Reap - An Giang 0,004631 - Đồng Tháp 0,000100 0,003784 - Sóc Trăng 0,009438 0,006563 0,000100 - Trà Vinh 0,010264 0,011429 0,000100 0,008491 Trà Vinh - PHỤ LỤC CÔNG THỨC TÍNH CÁC CHỈ SỐ ĐƯỢC SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU  %P - Percentage of polymorphic loci (Tỉ lệ locus đa hình tổng số locus): Tỷ lệ tính cách xác định số locus đa hình chia cho tổng số locus kiểm tra P = npi/ntotal (Trong npi tổng số locus đa hình, ntotal tổng số locus)  Ho - Observed Heterozygosity (Số dị hợp tử quan sát): Số dị hợp tử quan sát chia cho tổng số lượng cá thể quần thể Ví dụ quần thể có thành phần kiểu gen xAA : yAa : zaa Ho = y/(x+y+z)  He - Expected Heterozygosity (Số dị hợp tử mong đợi): Tần số dị hợp tử theo lý thuyết, tính cơng thức He = 2pq (trong p, q tần số alen quần thể p+q=1)  Giá trị khác biệt di truyền FST: tính tốn dựa khác biệt tần số alen quần thể theo công thức: FST = (HT – HS) / HT Trong đó: Hs = (He1*N1 + He2*N2) / (N1+N2), với He1 He2 số dị hợp tử quần thể quần thể 2; N1 N2 số lượng quần thể quần thể HT = 2*p-bar *q-bar, với p-bar q-bar tần số alen quần thể ... di truyền quần thể cá sửu Boesemania microlepis 47 3.4 Xây dựng cấu trúc quần thể cá sửu Boesemania microlepis 49 3.4.1 Khảo sát đa dạng di truyền quần thể cá sửu Boesemania microlepis. .. Boesemania microlepis Hình 2.2 Sơ đồ nghiên cứu di truyền quần thể cá sửu Boesemania microlepis 29 2.2.2 Phương pháp nghiên cứu di truyền quần thể cá sửu Boesemania microlepis ứng dụng cơng nghệ giải... vực nghiên cứu 49 3.4.2 Xác định khoảng cách di truyền quần thể cá sửu Boesemania microlepis khu vực nghiên cứu .49 3.4.3 Xây dựng cấu trúc quần thể cá sửu Boesemania microlepis