Nhân nhanh sinh khối và định lượng thành phần hoạt chất chính trong nuôi cấy rễ bất định của cây hà thủ ô đỏ (polygonum multiflorum thunb )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG HỒ HOÀNG ANH KHA NHÂN NHANH SINH KHỐI VÀ ĐỊNH LƯỢNG THÀNH PHẦN HOẠT CHẤT CHÍNH TRONG NI CẤY RỄ BẤT ĐỊNH CỦA CÂY HÀ THỦ Ô ĐỎ (Polygonum multiflorum Thunb.) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHÁNH HÒA - 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG HỒ HOÀNG ANH KHA NHÂN NHANH SINH KHỐI VÀ ĐỊNH LƯỢNG THÀNH PHẦN HOẠT CHẤT CHÍNH TRONG NI CẤY RỄ BẤT ĐỊNH CỦA CÂY HÀ THỦ Ô ĐỎ (Polygonum multiflorum Thunb.) LUẬN VĂN THẠC SĨ Ngành: Công nghệ sinh học Mã ngành: 60420201 Mã học viên: 58CH262 Quyết định giao đề tài: 321/QĐ-ĐHNT ngày 27/03/2018 Quyết định thành lập hội đồng: Ngày bảo vệ: Người hướng dẫn khoa học: TS VŨ QUỐC LUẬN TS PHẠM THỊ MINH THU Chủ tịch Hội Đồng: Phòng Đào tạo Sau đại học: KHÁNH HỊA - 2019 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan đề tài “Nhân nhanh sinh khối định lượng thành phần hoạt chất ni cấy rễ bất định Hà Thủ Ô đỏ (Polygonum Multiflorum Thunb.)” cơng trình nghiên cứu tơi Những kết số liệu luận văn chưa công bố hình thức Đề tài nghiên cứu thực phòng Sinh học Phân tử Chọn tạo Giống trồng - Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Ngun Tơi hồn tồn chịu trách nhiệm trước nhà trường lời cam đoan Khánh Hòa, tháng 10 năm 2019 Tác giả luận văn Hồ Hồng Anh Kha iii LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy TS Vũ Quốc Luận Thầy trực tiếp hướng dẫn tận tình cho tơi suốt thời gian thực đề tài Sẽ khơng có thành cơng hơm không nhận hướng dẫn giúp đỡ Cô TS Phạm Thị Minh Thu Trong suốt thời gian làm luận văn, Cô tạo điều kiện cho học tập làm việc, động viên, khích lệ truyền đạt cho kiến thức cần thiết Cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên, tạo điều kiện cho thực tập làm luận văn Cảm ơn Ban Giám Hiệu, Khoa sau đại học – Trường Đại học Nha Trang tạo điều kiện giúp đỡ suốt thời gian học tập trường Tôi xin gửi lời cảm ơn đến cán phòng Sinh học Phân tử Chọn tạo Giống trồng – Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên; Bạn Anh, Chị hỗ trợ tạo điều kiện cho suốt thời gian thực luận văn Xin gửi lời cảm ơn đến tất người Bạn học tập, thực tập với Những người bạn giúp đỡ đồng hành suốt chặng đường vừa qua Được học tập, làm việc trải nghiệm bạn cho tơi thấy sống cịn điều tốt đẹp Chúc người may mắn thành đạt tương lai Và lời cuối, từ sâu thẳm đáy lịng dành cảm ơn tới gia đình Khánh Hòa, tháng 10 năm 2019 Tác giả luận văn Hồ Hoàng Anh Kha iv MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN iii LỜI CẢM ƠN .iv MỤC LỤC .v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .vii DANH MỤC BẢNG viii DANH MỤC HÌNH .ix TRÍCH YẾU LUẬN VĂN x CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan Hà Thủ Ô đỏ 1.1.1 Đặc điểm sinh học phân bố .3 1.1.2 Thành phần Hà Thủ Ô đỏ 1.1.3 Tác dụng Hà Thủ Ô đỏ 1.2 Sơ lược rễ bất định .7 1.2.1 Sản phẩm chuyển hóa sơ cấp thứ cấp thực vật 1.2.2 Rễ bất định 1.2.3 Nuôi cấy sinh khối tế bào 13 1.2.4 Tình hình nghiên cứu bioreactor nước giới 14 1.3 Một số nghiên cứu hà thủ ô nước giới .17 1.3.1 Một số nghiên cứu nước 17 1.3.2 Một số nghiên cứu giới 17 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1.Vật liệu 19 2.1.1 Nguồn mẫu 19 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất chuẩn dung mơi 19 2.1.3 Môi trường nuôi cấy 19 2.1.4 Điều kiện thí nghiệm 20 2.1.5 Địa điểm thời gian thực đề tài .20 v 2.2 Phương pháp nghiên cứu 20 2.2.1 Tái sinh rễ bất định Cây Hà Thủ đỏ 20 2.2.2 Nhân nhanh rễ bất định Cây Hà Thủ đỏ 22 2.2.3 Phân tích hàm lượng 4' 5-tetrahydroxystilbene 2-o-β-d-glucoside emodin có rễ bất định Cây Hà Thủ Ô đỏ 23 2.3 Phương pháp phân tích số liệu 24 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .25 3.1 Ảnh hưởng auxin lên khả tái sinh rễ bất định từ loại mẫu cấy khác Hà Thủ Ô đỏ nuôi cấy in vitro .25 3.1.1 Ảnh hưởng auxin (IBA, NAA 2,4-D) lên khả tái sinh rễ bất định từ mẫu Hà thủ ô nuôi cấy in vitro điều kiện sáng tối 25 3.1.2 Ảnh hưởng auxin (IBA, NAA 2,4-D) lên khả tái sinh rễ bất định từ mẫu cuống Hà Thủ Ô đỏ nuôi cấy in vitro điều kiện sáng tối .30 3.1.3 Ảnh hưởng auxin (IBA, NAA 2,4-D) lên khả tái sinh rễ bất định từ mẫu đốt thân Hà Thủ Ơ đỏ ni cấy in vitro điều kiện sáng tối 33 3.1.4 So sánh hiệu tác dụng loại nguồn mẫu khác (lá, cuống lá, đốt thân) lên tái sinh rễ bất định Hà Thủ Ô đỏ .36 3.2 Ảnh hưởng mơi trường ni cấy lên khả hình thành rễ bất định 37 3.3 Tăng sinh rễ bất định hệ thống nuôi cấy khác .38 3.4 Định tính hợp chất thứ cấp phản ứng đặc trưng 40 3.5 Định lượng hợp chất thứ cấp emodin 2,3,5,4' -tetrahydroxystilbene 2-O-β-dglucoside phương pháp HPLC 41 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44 4.1 Kết luận 44 4.2 Kiến nghị 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO .45 DANH MỤC CƠNG TRÌNH 53 PHỤ LỤC SUMMARY vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ½ MS: Mơi trường Murashige Skoog’s (1962) giảm ½ khống đa lượng ½ SH: Mơi trường Schenk Hildebrandt (1972) giảm ½ khống đa lượng 2,4-D: 2,4-Dinitrophenylhydrazine acid ĐHST: Điều hòa sinh trưởng HPLC: High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu cao) IBA: Indole-3- butyric acid MS: Mơi trường Murashige Skoog’s (1962) MS ½ Mơi trường Murashige Skoog’s (1962) giảm NAA: a-naphthaleneacetic acid RBĐ: Rễ bất định SH: Môi trường Schenk Hildebrandt (1972) SH ½: Mơi trường Schenk Hildebrandt (1972) giảm TLC: Thin-layer chromatography (Sắc ký mỏng) vii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Ảnh hưởng loại auxin nồng độ lên khả tái sinh rễ bất định từ nguồn mẫu 21 Bảng 2.2 Ảnh hưởng loại auxin nồng độ khác lên khả tái sinh rễ bất định từ nguồn mẫu cuống 21 Bảng 2.3 Ảnh hưởng loại auxin nồng độ khác lên khả tái sinh rễ bất định từ nguồn mẫu đốt thân .22 Bảng 2.4 Ảnh hưởng mơi trường khống khác lên khả tái sinh rễ bất định Hà Thủ Ô đỏ 22 Bảng 3.1 Ảnh hưởng loại chất điều hòa sinh trưởng khác (IBA, NAA, 2,4D) lên khả tái sinh rễ bất định từ nguồn mẫu điều kiện sáng tối 26 Bảng 3.2 Ảnh hưởng loại chất điều hòa sinh trưởng khác (IBA, NAA, 2,4-D) lên khả tái sinh rễ bất định từ nguồn mẫu cuống điều kiện nuôi cấy sáng tối .31 Bảng 3.3 Ảnh hưởng loại chất điều hòa sinh trưởng khác (IBA, NAA, 2,4-D) lên khả tái sinh rễ bất định từ nguồn mẫu đốt thân điều kiện nuôi cấy sáng tối .34 Bảng 3.4 Ảnh hưởng môi trường khoáng khác lên khả tái sinh rễ bất định Hà Thủ Ô đỏ 37 Bảng 3.5 Ảnh hưởng hệ thống nuôi cấy khác lên khả tăng sinh rễ bất định Cây Hà Thủ đỏ 38 Bảng 3.6 Định lượng emodin 2,3,5,4' -tetrahydroxystilbene 2-O-β-d-glucoside phuong pháp HPLC 42 viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Hà Thủ Ơ đỏ (Internet) Hình 1.2 Cấu trúc hóa học Emodin Hình 1.3 Cấu trúc hóa học tanin Hình 3.1 Ảnh hưởng auxin (IBA, NAA 2,4-D) lên khả tái sinh rễ bất định từ mẫu Hà thủ ô nuôi cấy in vitro điều kiện sáng tối 27 Hình 3.2 Ảnh hưởng auxin (IBA, NAA 2,4-D) lên khả tái sinh rễ bất định từ mẫu cuống Hà thủ ô nuôi cấy in vitro điều kiện sáng tối 32 Hình 3.3 Ảnh hưởng auxin (IBA, NAA 2,4-D) lên khả tái sinh rễ bất định từ mẫu đốt thân Hà thủ ô nuôi cấy in vitro điều kiện sáng tối 35 Hình 3.4 Ảnh hưởng mơi trường khống khác lên khả tái sinh rễ bất định Hà Thủ Ô đỏ 38 Hình 3.5 Ảnh hưởng hệ thống ni cấy khác lên khả nhân nhanh rễ bất định Hà Thủ Ơ đỏ: a, a1: ni cấy lỏng tĩnh, b, b1: nuôi cấy long lắc; c, c1: bioreactor tự tạo (3 lít); d, d1: bioreactor Hàn Quốc (3 lít) 39 Hình 3.6 Định tính phản ứng hóa học: A.Phản ứng với NaOH; Mẫu thử + NaOH; Mẫu thử; Mẫu trắng B Phản ứng với NH4OH: 1: Mẫu thử + NH4OH; Mẫu thử; Mẫu trắng 40 Hình 3.7 Định tính emodin phương pháp sắc ký lớp mỏng: A: quan sát ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm, B: quan sát ánh sáng thường C: chuẩn emodin; M: Mẫu kiểm nghiệm 41 Hình 3.8 Định tính 2,3,5,4' -tetrahydroxystilbene 2-O-β-d-glucoside phương pháp HPLC Peak màu đỏ chuẩn, Peak màu xanh mẫu thí nghiệm 41 Hình 3.9 Sắc ký đồ HPLC định lượng emodin 42 Hình 3.10 Sắc ký đồ HPLC định lượng 2,3,5,4' -tetrahydroxystilbene 2-O-β-d-glucoside 43 ix TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Cây Hà Thủ Ô đỏ (Polygonum multiflora Thunb.) thuộc họ rau Răm (Polygonaceae) loại dược liệu có giá trị kinh tế cần bảo vệ (sách đỏ Việt Nam) Nhiều nghiên cứu Hà Thủ Ơ đỏ có tác dụng với nhiều bệnh lý rụng tóc, tóc bạc sớm, chữa đau lưng dưới, yếu khớp gối, yếu cơ, liệt nửa người, tinh thần hồi hộp, chóng mặt, ngủ,…Nhân giống bảo tồn lồi thảo dược có ý nghĩa quan trọng nhu cầu sử dụng ngày gia tăng Nuôi cấy sinh khối rễ bất định thành cơng nhiều đối tượng dược liệu, đặc biệt có tiềm loài Trong nghiên cứu này, ảnh hưởng nguồn mẫu, chất điều hòa sinh trưởng hệ thống nuôi cấy nghiên cứu nhằm đánh giá khả nhân nhanh rễ bất định Hà Thủ Ô đỏ Rễ bất định cảm ứng từ nguồn mẫu môi trường nuôi cấy tối ưu cấy chuyền vào hệ thống (bình tam giác lít, bình tam giác kết hợp lắc, bình tam giác kết hợp sục khí, bioreactor Hàn Quốc) có chứa g/l mẫu rễ bất định Kết sau tuần nuôi cấy cho thấy, mẫu môi trường SH có bổ sung 1,5 mg/l IBA, 30 g/l sucrose, 8,5 g/l agar pH 5,8 tái sinh rễ bất định (100%), số rễ/mẫu (24,33 rễ), khối lượng tươi (130,67 mg) khối lượng khô (13,45 mg) cao đáng kể so với điều kiện nuôi cấy khác Bên cạnh đó, nhân nhanh rễ bất định hệ thống nuôi cấy bioreactor Hàn Quốc cho hiệu cao hệ thống nuôi cấy khác thể tiêu khối tượng tươi (17,04 g), khối lượng khô (1,56 g) tỷ lệ tăng sinh (3,40 lần) sau tuần nuôi cấy Thông qua đề tài này, nguồn mẫu, chất điều hòa sinh trưởng số yếu tố môi trường tốt cho tái sinh rễ bất định Hà Thủ Ơ đỏ mơ tả; từ đó, sử dụng rễ bất định làm nguồn vật liệu ban đầu để nhân nhanh hệ thống bioreactor định lượng thành phần hoạt chất 2, 3, 5, 4' -tetrahydroxystilbene 2O-β-d-glucoside emodin rễ bất định Những rễ bất định sử dụng làm nguồn vật liệu thu nhận hợp chất có lợi thời gian ngắn Từ khóa: Hà Thủ Ơ đỏ, chất điều hịa sinh trưởng, hệ thống ni cấy, nguồn mẫu, rễ bất định x sắc giá trị Rf vết thu dung dịch emodin chuẩn (Hình 3.7C) Như vậy, có diện emodin mẫu Hình 3.7 Định tính emodin phương pháp sắc ký lớp mỏng: A: quan sát ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm, B: quan sát ánh sáng thường C: chuẩn emodin; M: Mẫu kiểm nghiệm Hình 3.8 Định tính 2,3,5,4' -tetrahydroxystilbene 2-O-β-d-glucoside phương pháp HPLC Peak màu đỏ chuẩn, Peak màu xanh mẫu thí nghiệm 3.5 Định lượng hợp chất thứ cấp emodin 2,3,5,4' -tetrahydroxystilbene 2-O-βd-glucoside phương pháp HPLC Kết định lượng phương pháp HPLC cho thấy, rễ bất định Hà Thủ Ô đỏ nuôi cấy hệ thống bioreactor Hàn Quốc cho kết hàm lượng emodin phân tích (0,0062%) hàm lượng 2,3,5,4'-tetrahydroxystilbene 2-O-βd-glucoside (0,26%) (Bảng 3.6, Hình 3.9, 3.10) 41 Bảng 3.6 Định lượng emodin 2,3,5,4' -tetrahydroxystilbene 2-O-β-d-glucoside phuong pháp HPLC STT Yêu cầu Định lượng Emodin Định lượng 2,3,5,4' tetrahydroxystilbene 2-0-β-D-glucoside Phương pháp thử Kết HPLC 0,0062% HPLC 0,26% Hình 3.9 Sắc ký đồ HPLC định lượng emodin Khi so sánh kết định lượng hai chất emodin 2,3,5,4'-tetrahydroxystilbene 2-O-β-d-glucoside củ tự nhiên, củ trồng củ mua thị trường cho thấy, hàm lượng tích lũy hoạt chất củ có khác biệt lớn Nguyễn Thị Phương đồng tác giả (2019) phân tích định lượng emodin 2,3,5,4'-tetrahydroxystilbene 2-0-β-D-glucoside cho thấy, hàm lượng thấp mẫu thu Hà Nội đạt (0,001%) emodin (0,12%) 2,3,5,4' -tetrahydroxystilbene 2-0-βD-glucoside Tuy nhiên, mẫu thu số vùng lại cho hàm lượng emodin 2,3,5,4' -tetrahydroxystilbene 2-0-β-D-glucoside cao Hưng Yên, Văn Điển (0,05% 2,62%) số mẫu thu Sơn La, Lai Châu, Quảng Tây khơng phát hoạt chất 42 emodin có mẫu phân tích Nguyễn Thị Hà Ly đồng tác giả (2013) cho thấy, hàm lượng emodin củ giao động từ (0,069% - 0,112%) hoạt chất 2,3,5,4' -tetrahydroxystilbene 2-0-β-D-glucoside giao động khoảng (2,24 – 3,03%) Theo kết Lin đồng tác giả (2010) cho thấy hàm lượng hoạt chất Emodin đạt (0,662%) rễ tự nhiên Như vậy, kết phân tích hàm lượng hoạt chất rễ bất định Hà Thủ Ô đỏ ni cấy hệ thống bioreactor có hàm lượng emodin (0,0062%) hàm lượng 2,3,5,4'-tetrahydroxystilbene 2-O-β-d-glucoside (0,26%) Hình 3.10 Sắc ký đồ HPLC định lượng 2,3,5,4' -tetrahydroxystilbene 2-O-β-d-glucoside Điều lại lần khẳng định vai trò hệ thống bioreactor lên khả nhân nhanh sinh khối tích lũy hợp chất thứ cấp ni cấy rễ bất định Hà Thủ Ơ đỏ Vì vậy, thí nghiệm hệ thống bioreactor Hàn Quốc phù hợp cho tăng sinh sinh khối khả tích lũy emodin 2,3,5,4'-tetrahydroxystilbene 2-O-β-d-glucoside rễ bất định Hà Thủ Ô đỏ 43 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Nguồn mẫu Hà Thủ Ơ đỏ cho kết hình thành rễ bất định tốt điều kiện chiếu sáng mơi trường SH có bổ 1,5 mg/L IBA, 30 g/l sucrose, 8,5 g/agar, pH = 5,8 Khả nhân nhanh rễ bất định hệ thống nuôi cấy khác cho thấy bioreactor Hàn Quốc cho kết tốt khối tượng tươi (17,04 g), khối lượng khô (1,56 g) tỷ lệ tăng sinh (3,40 lần) Hàm lượng hoạt chất rễ bất định Hà Thủ Ơ đỏ ni cấy hệ thống bioreactor có hàm lượng emodin (0,0062%) hàm lượng 2,3,5,4'-tetrahydroxystilbene 2O-β-d-glucoside (0,26%) 4.2 Kiến nghị Nghiên cứu sinh trưởng, phát triển tích lũy hoạt chất rễ bất định hệ thống bioreactor tích lớn Nghiên cứu bổ sung số loại elicitor nhằm gia tăng hàm lượng hoạt chất rễ bất định 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO Trong nước [1] Bùi Trang Việt (2002), Sinh lý thực vật đại cương, Phần II: Phát triển, NXB Đại học Quốc gia TP HCM [2] Bùi Văn Thắng (2007), “Nhân giống in vitro Hà Thủ Ô đỏ (Polygonum multiflorum Thunb) tuyển chọn tỉnh Hà Giang”, Tạp chí Lâm nghiệp, Số 4, tr 23-28 [3] Đỗ Huy Bích, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Kim Mãn, Nguyễn Thượng Dong (2003), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam - Tập 1&2, NXB Khoa học Kỹ Thuật Hà Nội, 529-531, 725-728 [4] Đỗ Tất Lợi (1995), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr 900903, 1035-1041 [5] Đỗ Tất Lợi (1999), Những thuốc vị thuốc Việt Nam NXB Y học, tr 455-457, 506-507 [6] Dương Tấn Nhựt (2011), Công nghệ sinh học thực vật - Tập 3, NXB Nông nghiệp, tr 228-245, 175-183 [7] Dương Tấn Nhựt, Bùi Văn Thế Vinh, Nguyễn Thành Hải, Nguyễn Hồ Ngọc Lan, Vũ Quốc Luận, Phan Xuân Huyên (2007), “Nghiên cứu khả nhân nhanh prtocorm-like body hoa Địa lan (Cymbidium sp.) hệ thống bioreactor tự tạo”, Kỷ Yếu Hội Nghị Khoa Học: Công nghệ Sinh học Thực vật Công Tác Nhân Giống Chọn Tạo Giống Hoa, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội, tr 47-50 [8] Dương Tấn Nhựt, Nguyễn Cửu Thành Nhân, Hoàng Xuân Chiến, Nguyễn Phúc Huy, Nguyễn Bá Nam, Trần Xuân Ninh, Phạm Phong Hải, Vũ Quốc Luận, Phan Quốc Tâm, Vũ Thị Hiền, Trịnh Thị Hương, Trần Công Luận, Paek Kee Yoeup (2012), “Một số hệ thống nuôi cấy nghiên cứu nhân nhanh rễ bất định rễ thứ cấp sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.)”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, Số 10(4A), tr 887-897 [9] Dương Tấn Nhựt, Nguyễn Ngọc Kim Vy, Nguyễn Như Hà Vy, Đinh Văn Khiêm (2006), “Nghiên cứu khà hình thành mơ sẹo, tái sinh chồi nhân nhanh giống hà thủ ô đỏ (Polygonum multiflorum Thunm.), Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, Số 4(4), tr 507-518 45 [10] Dương Tấn Nhựt, Nguyễn Thành Hải, Nguyễn Thị Thúy Hằng, Nguyễn Thụy Minh Hạnh, Nguyễn Thị Huyền Trâm, Phạm Quốc Tuấn, Thái Xuân Du, Bùi Văn Lệ (2005), “Bước đầu nghiên cứu khả sản xuất củ giống lily (Lilium spp.) hệ thống bioreactor”, Kỷ Yếu Những Vấn Đề Nghiên Cứu Cơ Bản Khoa Học Sự Sống, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tr 689-692 [11] Dương Tấn Nhựt, Trần Hiếu, Nguyễn Thị Nhật Linh, Hoàng Thanh Tùng, Nguyễn Bá Nam, Nguyễn Phúc Huy, Vũ Quốc Luận, Vũ Thị Hiền (2015), Tối ưu hóa q trình nhân nhanh tích lũy saponin rễ bất định sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) hệ thống nuôi cấy, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, Số 13(3), tr 853-864 [12] Hồ Thanh Tâm (2014), Nghiên cứu số yếu tố môi trường nguồn gốc mẫu cấy lên khả hình thành rễ bất định sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) nuôi cấy in vitro, Luận văn thạc sĩ, trường Đại học Đà Lạt, tr 34-58 [13] Hoàng Thị Kim Hồng (2011), “Nghiên cứu nhả tái sinh chồi cụm chồi nuôi cấy in vitro Hà Thủ Ơ đỏ (Polygonum multiflorum Thunb.)”, Tạp chí Đại học Huế: Nông nghiệp, Sinh học Y Dược, Số 64(1) [14] Hoàng Văn Long, Bùi Văn Thế Vinh, Dương Tấn Nhựt (2007), Giá thể nylon rễ hoa cúc (Chrysanthemum sp.), Tuyển tập Hội nghị Khoa học Công nghệ sinh học nhân giống chọn tạo giống hoa, NXB Nông nghiệp [15] Lê Kim Cương, Hoàng Xuân Chiến, Nguyễn Bá Nam, Trịnh Thị Hương, Dương Tấn Nhựt (2012), “Ảnh hưởng số yếu tố lên khả tăng sinh mô sẹo “xốp” bước đầu nuôi cấy huyền phù tế bào sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.), Tạp chí Sinh học, Số 34, tr 265-276 [16] Lê Thị Thúy, Trịnh Mộng Nhi, Phạm Văn Lộc (2014), “Khảo sát ảnh hưởng chất điều hịa tăng trưởng mơi trường ni cấy đến khả tạo rễ cà rốt nuôi cấy in vitro”, Tạp chí trường Đại học Thủ Dầu Một, tr 62-67 [17] Ngô Văn Thu (2011), Bài giảng dược liệu - Tập 2, NXB Trường Đại học Dược Hà Nội [18] Nguyễn Ánh Hồng (2000), Cơ sở Khoa học Công nghệ chuyển gen thực vật, NXB Nông nghiệp Hà Nội 46 [19] Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thuỷ Tiên (2006), Công nghệ tế bào, NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh [20] Nguyễn Hồng Lộc (2007), Nhập môn Công Nghệ Sinh Học, NXB Đại Học Huế [21] Nguyễn Phương Anh (2004), Nghiên cứu ảnh hưởng phương pháp chế biến đến tác dụng sinh học vị thuốc Đại Hồng, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ trường Đại học Y Dược Hà Nội [22] Nguyễn Thị Hà Ly, Tạ Thị Thảo, Nguyễn Minh Khởi, Phương Thiện Thương (2013), “Xác định đồng thời hàm lượng emodin 2,3,5,4'-tetrahydroxystilbene 2-0-β-D-glucoside dược liệu hà thủ ô đỏ sắc ký lỏng hiệu cao”, Tạp chí Dược liệu, Số 18(6), tr 400-406 [23] Nguyễn Thị Liễu, Nguyễn Trung Thành, Nguyễn Văn Kết (2011), “Nghiên cứu khả tạo rễ bất định sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv) nghiên cứu in vitro, Tạp chí Khoa học - Đại học Quốc gia Hà Nội, Số 27, tr 30-36 [24] Nguyễn Thị Ngọc Hương, Võ Thị Bạch Mai (2009), “Tìm hiểu phát sinh hình thái rễ nuôi cấy in vitro nhàu (Morinda citrifolia L.)”, Tạp chí Phát triển Khoa học Cơng nghệ, Số 17, tr 100-105 [25] Nguyễn Thị Phương, Nguyễn Thị Hà Ly, Nguyễn Thị Bích Thu, Phương Thiện Thương (2019), “Lựa chọn chất đối chiếu kiểm nghiệm chất lượng dược liệu Việt Nam”, Tạp chí Dược liệu, Số 24(1), tr 3-14 [26] Phạm Thanh Kỳ (2004), Bài giảng dược liệu - tập 1, NXB Đại học Dược Hà Nội, tr 7-27, 79-86, 215-258 [27] Trần Thanh Hương, Bùi Trang Việt, Feng Teng-Yung (2009), “Vai trò chất điều hịa tăng trưởng thực vật hình thành rễ bất định từ khúc cắt mang chồi vài giống chuối”, Tạp chí Phát triển Khoa học Công nghệ, Số 9, tr 23-30 [28] Trần Thị Kim Thu (2008), Nghiên cứu nhân giống in vitro Hà Thủ Ô đỏ (Polygonum multiflorum Thunb), Luận văn Thạc sĩ trường Đại học Khoa học, Đại học Huế [29] Trịnh Thị Hương, Hồ Thanh Tâm, Hà Thị Mỹ Ngân, Ngơ Thanh Tài, Nguyễn Phúc Huy, Hồng Xn Chiến, Nguyễn Bá Nam, Vũ Quốc Luận, Vũ Thị Hiền, Nguyễn Thị Thúy Hường, Phạm Bích Ngọc, Chu Hồng Hà, Dương Tấn Nhựt (2012), “Ảnh hưởng nguồn mẫu, kích thước mẫu số loại auxin lên khả tái sinh rễ bất định sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) ni cấy in vitro”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, Số 10(4), tr 877-886 47 [30] Trương Thị Bích Phượng, Trần Thị Kim Thu, Nguyễn Hồng Lộc (2008), “Nghiên cứu nhân giống in vitro Hà Thủ Ơ đỏ (Polygonum multiflorum Thunb)” Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, Số 6(4B), tr 889-895 [31] Võ Thị Bạch Mai (2004), Sự phát triển chồi rễ, NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh [32] Vũ Hương Thủy (2000), Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ đến thành phần anthraglycoside Đại Hồng, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ trường Đại học Y Dược Hà Nội Ngoài nước [33] Archana, G., Narasu, M.L (2000), “Transgenic hairy roots: recent trends and applications”, Biotechnology Advances, 18(1), pp 1-22 [34] Asada, Y., Saito, H., Yoshikawa, T., Sakamoto, K., Furuya, T (1993), “Biotransformation of 18 beta-glycyrrhetinic acid by ginseng hairy root culture”, Phytochemistry, 34, pp 1049-1052 [35] Bensaddek, L., Gillet, F., Nava-Saucedo, J.E., Fliniaux, M.A (2011), “The effect of nitrate and ammonium concentrations on growth and alkaloid accumulation of Atropa belladonna hairy roots”, Journal of Biotechnology, 85, pp 35-40 [36] Casanova, E., Trilla, M.I., Moysset, L., Vainstein, A (2004), « Influence of rol genes in floriculture”, Biotechnology Advances, 23, pp 3-59 [37] Claudia, K (2006), “Current State of Science Review focusing on characterization, efficacy, safety, use and promising areas for oral NADH”, Science Behind Supplements Education Series, pp 1-9 [38] Duc, N.M., Nham, N.T., Kasai, R., Ito, A., Yamasaki, K., Tanaka, O (1993), “Saponins from Vietnamese Ginseng, Panax vietnamensis Ha et Grushv Collected in Central Vietnam I”, Chemical Pharmaceutical Bulletin, 41, pp 2010-2014 [39] Duc, N.M., Nham, N.T., Kasai, R., Ito, A., Yamasaki, K., Tanaka, O (1994), “Saponins from Vietnamese Ginseng, Panax vietnamensis Ha et Grushv Collected in Central Vietnam II”, Chemical Pharmaceutical Bulletin, 41, pp 115-122 [40] Duc, N.M., Nham, N.T., Kasai, R., Ito, A., Yamasaki, K., Tanaka, O (1994), “Saponins from Vietnamese Ginseng, Panax vietnamensis Ha et Grushv Collected in Central Vietnam III”, Chemical Pharmaceutical Bulletin, 41, pp 634-640 [41] Duncan, D.B (1955), “Multiple range and multiple F tests”, Biometrics, 11(1), pp 1-42 48 [42] Fink, S (1982), “Adventitious root primordial - the cause of abnormally broad xylem rays in hard and softwoods”, International Association of Wood Anatomists, 3, pp 31-38 [43] Geneve, R.L., Hackett, W.P., Swanson, B.T (1988), “Adventitious root initiation in de-bladed petioles from the juvenile and mature phases of English ivy”, Journal of the American Society for Horticultural Science, 113, pp 630 - 635 [44] George, E.F., Sherington, P.D (1984), Plant propagation by tissue culture, Exegetics Ltd, Eversley, England [45] Han, J.Y., Kwon, Y.S., Yang, D.C., Jung, Y.R., Choi, Y.E (2006), “Expression and RNA interference-induced silencing of damarenediol synthase gene in Panax gingseng”, Plant Cell Physiology, 47, pp 1653-1662 [46] Harbage, J.F., Stimart, D.P., Evert, R.F (1993), “Anatomy of adventitious root formation in microcuttings of malus domestica Borkh ‘Gala’”, Journal of the American Society for Horticultural Science, 118, pp 680-688 [47] Hayward, H.E (1938), The structure of economic plants, MacMillan, New York, USA [48] Horikawa, K., Mohri, T., Tanaka, Y., Tokiwa, H (1994), “Moderate inhibition of mutagenicity and carcinogenicity of benzo [a] pyrene, 1,6-dinitropyrene and 3,9-dinitroflruoranthene by Chinese medicinal herbs Mutagenesis”, Genetics and Molecular Biology, 9(6), pp 523-256 [49] Jeong, G.T., Part, D.H., Hwang, B., Park, K., Kim, S.W., Woo, J.C (2002), “Studies on mass production of transformed Panax ginseng hairy roots in bioreactor”, Applied Biochemistry and Biotechnology, 98-100, pp 1115-1127 [50] Jeong, G.T., Part, D.H., Park, K (2004), “Production of antioxidant compounds by culture of Panax ginseng C A Meyer hairy roots: I Enhanced production of secondary metabolic in hairy root cultures by elicitation”, Applied Biochemistry and Biotechnology, 121-124, pp 1147-1157 [51] Jing, Y., Yang, J., Wang, Y., Li, H., Chen, Y., Hu, Q., Shi, G., Tang, X., Yi, J (2006), “Alteration of subcellular redox equilibrium and the consequent oxidative modification of nuclear factor κB are critical for anticancer cytotoxicity by emodin, a reactive oxygen species-producing agent”, Free Radical Biology and Medicine, 40(12), pp 2183-2197 [52] Kawaguchi, K., Hirotani, M., Yoshikawa, T., Furuya, T (1990), “Biotransformation of digitoxigenin by ginseng hairy root cultures”, Phytochemistry, 29(3), pp 837-843 49 [53] Kenneth, C.F (2007), Wine microbiology Practical Application and Procedures Published by Springer [54] Kim, J.A., Kwang, H.B., Young, M.S., Sung, H.S., Shin, H (2009), “Hairy root cultures of Taxus cuspidata for enhanced production of paclitaxel”, Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry, 52(2), pp 144-150 [55] Kim, Y.S., Hand, E.J., Yeung, E.C., Peak, K.Y (2003), “Lateral root development and saponin accumulation as affected by IBA or NAA in adventitious root cultures of Panax ginseng C A Meyer” In Vitro Cellular Development Biology – Plant, 39, pp 245-249 [56] Kochan, E., Królicka, A., Chmiel, A (2012), “Growth and ginsenoside production in Panax quinquefolium hairy roots cultivated in flasks and nutrient sprinkle bioreactor”, Acta Physiologiae Plantarum, 34, pp 1513-1518 [57] Kull, T., Arditti, J (2002), Orchid biology reviews and perspective, Kluwer Academic Publishers [58] Lazzeri, P.A., Hildebrand, D.E., Collins, G.B (1987), “Soybean somatic embryogenesis: effects of nutritional, physical and chemical factors”, Plant Cell Tissue and Organ Culture, 10, pp 209-220 [59] Lee, E.J., Moh, S.H., Paek, K.Y (2011), “Influence of inoculum density and aeration volume on biomass and bioactive compound production in bulb-type bubble bioreactor cultures of Eleutherococcus koreanum Nakai”, Bioresource Technology, 102, pp 7165-7170 [60] Lee, S.U., Shin, H.K., Min, Y.K., Kim, S.H (2008), “Emodin accelerates osteoblast differentiation through phosphatidylinositol 3-kinase activation and bone morphogenetic protein-2 gene expression”, International Immunopharmacology, 8(5), pp 741-747 [61] Lin, H.T., Nah, S.L., Huang, Y., Wu, H.C (2010), “Potential antioxidant components and characteristics of fresh Polygonum multiflorum”, Journal of Food and Drug Analysis, 18(2), pp 120-127 [62] Lu, C.C., Yang, J.S., Huang, A.C., Hsia, T.C., Chou, S.T., Kuo, C.L., Lu, H.F., Lee, T.H., Wellington, G.W., Chung, J.G (2010), “Chrysophanol induces necrosis through the production of ROS and alteration of ATP levels in J5 human liver cancer cells”, Molecular Nutrition and Food Research, 54, pp 967-976 50 [63] Matsuoka, H., Hinata, K (1979), “NAA-induced organogenesis and embryogenesis in hypocotyls callus of Solanum melongena L.”, Journal of Experimental Botany, 30, pp 363-370 [64] Mitsuhashi, K.M., Shibaoka, H., Shimokoriyama, M (1978), “Anatomical and physiological aspects of developmental processes of adventitious root formation in Azukia cuttings”, Plant and Cell Physiology, 19, pp 867-874 [65] Murashige, T., Skoog, F (1962), “A reivsed medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures”, Plant Physiology, 15, pp 473-497 [66] Nham, N.T., De, P.V., Luan, T.C., Duc, N.M., Shibata, S., Tanaka, O., Kasai, R (1995), “Pharmacognostical and chemical studies on Vietnamese ginseng, Panax vietnamesis Ha et Grushv (Araliaceae)” Journal of Japanese Botany, 70, pp 1-10 [67] Pierik, R.L.M (1987), “In vitro culture of higher plants” Nijhoff, Dordrecht, The Netherlands, 344 [68] Robert, M.L., Herrera, J.L., Contreras, F., Cooper, K.N (1988), “In vitro propagation of Agave fourcroydes Lem.” Plant Cell Tissue and Organ Culture, 8, pp 37-48 [69] Schenk, R.U., Hidebrandt, A.C (1972), “Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures”, Can Journal of Botany, 50, pp 199-204 [70] Shieh, D.E., Chen, Y.Y., Yen, M.H., Chiang, L.C., Lin, C.C (2004), “Emodininduced apoptosis through p53-dependent pathway in human hepatoma cells”, Life Sciences, 74(18), pp 2279-2290 [71] Su, Y.T., Chang, H.L., Shyue, S.K., Hsu, S.L (2005), “Emodin induces apoptosis in human lung adenocarcinoma cells through a reactive oxygen species-dependent mitochondrial signaling pathway”, Biochemistry Pharmacology, 70(2), pp 229-241 [72] Takayama, S (1991), Mass propagation of plants through shake and bioreactor culture techniques, Biotechnology in agriculture and forestry: Hightech and micropropagation, Springer-Verlag Berlin, Heidelberg, 17, pp 1-46 [73] Tam, H.T., Lee, K.J., Lee, J.D., Bhushan, S., Paek, K.Y., Park, S.Y (2017), “Adventitious root culture of Polygonum multiflorum for phenolic compounds and its pilot-scale production in 500 L-tank”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 130, pp 167-181 51 [74] Thanh, N.T., Murthy, H.N., Yu, K.W., Jeong, C.S., Hahn, E.J., Paek, K.Y (2006), “Effect of oxygen supply on cell growth and saponin production in bioreactor cultures of Panax ginseng”, Journal of Plant Physiology, 163, pp 1337-1341 [75] Thorpe, T.A (1984), Clonal propagation of conifers Proc of the Intern Symposium on in vitro propagation of forest tree species, Bologna, Italy, pp.35-50 [76] Tiberiapop, D.P., Catherine, B (2001), “Auxin control in the formation of adventitious roots”, Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca, 39(1), pp 307-316 [77] Wang, C., Wu, X., Chen, M., Duan, W., Sun, L., Yan, M., Zhang, L (2007), “Emodin induces apoptosis through caspase 3-dependent pathway in HK-2 cells”, Toxicology, 231(2-3), pp 120-128 [78] Wang, W., Wang, D.Q (2005), “Progress of study on brain protective effect and mechanism of Polygonum multiflorum”, Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi 25(10), pp 955-959 [79] Yan, D., Zhao, L., Mei, H., Zhang, S.L., Huang, Z.H., Duan, Y.Y., Ye, P (2008), “Exploration of emodin to treat alpha-naphthylisothiocyanate-induced cholestatic hepatitis via anti-inflammatory pathway”, European Journal of Pharmacology, 590(1-3), pp 377-386 [80] Yan, H.J., Fang, Z.J (2008), “Study on determination and principal component analysic of inorganic elements in Polygonum multiflorum from different areas”, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 33(4), pp 416-419 [81] Zhao, M.Q., Ding, J.Y (2001), “Studies on the arbutin biosynthesis by hairy root of Panax ginseng C.A Meyer”, China Journal Of Chinese Materia Medica, 26(12), pp 819-822 [82] Ziv, M (1999), Organogenic plant regeneration in bioreactors Plant biotechnology and in vitro biology in the 21st century Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherland, pp 673-676 Internet [83] https://lahien.com/ky-thuat-uom-trong-duoc-lieu-ha-thu-o-cu-tron/ 52 DANH MỤC CƠNG TRÌNH Vũ Quốc Luận, Đỗ Thị Luyến, Hồ Hoàng Anh Kha, Hoàng Thanh Tùng, Nguyễn Phúc Huy, Vũ Thị Hiền, Dương Tấn Nhựt 2019 Ảnh hưởng nguồn mẫu, chất điều hịa sinh trưởng hệ thống ni cấy lên khả nhân nhanh rễ bất định hà thủ ô đỏ (Polygonum multiflorum Thunb.) nuôi cấy in vitro Tạp chí Cơng nghệ Sinh học (Nhận đăng) 53 PHỤ LỤC Thành phần mơi trường khống MS (Murashige Skoog, 1962) SH (Schenk Hildebrandt, 1972) THÀNH PHẦN MS SH Đa lượng mg/l mg/l NH4NO3 1650 – KNO3 1900 2500 CaCl2.2H2O 440 200 MgSO4.7H2O 370 400 – 300 KH2PO4 170 – Vi lượng mg/l mg/l KI 0,83 H3BO3 6,2 MnSO4.H2O 22,3 10 ZnSO4.7H2O 8,6 Na2MoO4 0,25 0,1 CuSO4.5H2O 0,025 0,2 CoCl2.6H2O 0,025 0,1 Na2.EDTA 37,3 20 FeSO4.7H2O 27,8 15 Vitamin mg/l mg/l Myo-Inositol 100 1000 Nicotinic acid 0,5 Pyridoxine HCl 0,5 0,5 Thiamine HCl 0,1 Glycine 2,0 – NH4H2PO4 SUMMARY Polygonum multiflora Thunb (belong to Polygonaceae family) is a medicinal plant of economic value and should be protected, according to the Red Book of Vietnam Many studies have shown that P multiflora Thunb was effective for many diseases such as hair loss, premature gray hair, lower back pain, knee weakness, muscle weakness, hemiplegia, nervousness, dizziness, insomnia, etc Propagation and preservation of this herbal species are significantly important because of increased demand Adventitious root biomass culture has been successful on a number of plant species, and that it has potential for P multiflorum breeding In this study, the effect of explants, plant growth regulators and different culture systems on adventitious root formation were investigated The adventitious roots were induced from the explants and the optimum culture medium were transferred to four different culture systems (3liter triangular flask, shaking triangle, bioreactor self-generated and Korean bioreactor) containing g adventitious roots per liter medium The results showed that the leaf cultured on SH medium supplemented with 1.5 mg l-1 IBA, 30 g l-1 sucrose, 8.5 g l-1 agar and pH 5.8 gave the higher of adventitious root regeneration rate (100%), root number/explant (24.33 roots), fresh weight (130.67 mg) and dry weight 13.45 mg) compared to those cultured on other condition after weeks of culture The adventitious root multiplication in the Korea bioreactor system is more effective than other culture systems shown in the fresh biomass (17.04 g), dry biomass (1.56 g) and proliferation rate (3.40 fold) after weeks of culture Through this thesis, the best sources of explants, plant growth regulators and some medium factors for the regeneration of adventitious roots of Polygonum multiflora Thunb were described; from there, it is possible to use adventitious roots as the source material for multiplication in the bioreactor system and quantify the 2, 3, 5, 'tetrahydroxystilbene 2-O -d-glucoside and emodin in adventitious roots Adventitious roots can be used as a source of material for obtaining beneficial compounds in a short time Keywords: adventitious root, culture system, explant, plant growth regulators, Polygonum multiflora Thunb ... DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG HỒ HOÀNG ANH KHA NHÂN NHANH SINH KHỐI VÀ ĐỊNH LƯỢNG THÀNH PHẦN HOẠT CHẤT CHÍNH TRONG NI CẤY RỄ BẤT ĐỊNH CỦA CÂY HÀ THỦ Ô ĐỎ (Polygonum multiflorum Thunb. ). .. đề tài ? ?Nhân nhanh sinh khối định lượng thành phần hoạt chất ni cấy rễ bất định Hà Thủ Ô đỏ (Polygonum Multiflorum Thunb. )? ?? cơng trình nghiên cứu tơi Những kết số liệu luận văn chưa công bố hình... 200 0) Tuy nhiên, đối tượng Hà Thủ Ô đỏ chưa có nhiều nghiên cứu ni cấy RBĐ nuôi cấy thu nhận sinh khối rễ Hà Thủ Ô đỏ hệ thống bioreactor Vì vậy, thực đề tài: ? ?Nhân nhanh sinh khối định lượng thành