Nghiên cứu thu nhận protein từ tảo spirulina

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA -000 - HỒ KHOA NAM NGHIÊN CỨU THU NHẬN PROTEIN TỪ TẢO SPIRULINA LUẬN VĂN THẠC SĨ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ: 60 42 80 TP.HỒ CHÍ MINH, THÁNG 8/2008 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH Cán hướng dẫn khoa học: PGS-TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG Cán chấm nhận xét 1: Cán chấm nhận xét 2: Luận văn thạc sĩ bảo vệ HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ngày 30 tháng năm 2008 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHIÃ VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc -oOo - Tp HCM, ngày tháng năm 2008 NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: HỒ KHOA NAM Giới tính : Nam Ngày, tháng, năm sinh : 25-01-983 Nơi sinh : Tiền Giang Chuyên ngành : Cơng Nghệ Sinh học Khố (Năm trúng tuyển) : 2006 1- TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU THU NHẬN PROTEIN TỪ TẢO SPIRULINA 2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN: ¾ Lựa chọn phương pháp phá vỡ tế bào ¾ Khảo sát, lựa chọn phương pháp thích hợp để tủa protein từ tảo Spirulina ¾ Khảo sát hịa tan protein tảo đệm ¾ Ứng dụng thu nhận protein màu phycocyanin 3- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 25/02/2008 4- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ : 30/06/2008 5- HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS-TS NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG Nội dung đề cương Luận văn thạc sĩ Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH LỜI CẢM ƠN Lời xin chân thành cảm ơn tất quý thầy cô bạn bè hướng dẫn, giúp đỡ động viên để tơi hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Đức Lượng định hướng, giúp đỡ hướng dẫn suốt q trình nghiên cứu hồn thành luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn tất quý thầy cô môn Công nghệ Sinh học giúp đỡ luôn tạo điều kiện thuận lợi trình tiến hành thực nghiệm để tơi hồn thành luận văn Xin cảm ơn giúp đỡ, ủng hộ động viên bạn lớp CHCNSH06 Và cuối tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đến Cha-Mẹ-gia đình tơi ln quan tâm, ủng hộ giúp sức suốt thời gian làm luận văn tốt nghiệp Hồ Khoa Nam TÓM TẮT Để phát huy tiềm tăng giá trị sử dụng tảo Spirulina, nghiên cứu đưa phương pháp tách chiết protein hiệu quả, bước hoàn thiện quy trình thu nhận protein từ thực phNm quý giá để ứng dụng nhiều chế biến thực phNm, y học mỹ phNm Chúng tiến hành khảo sát ba phương pháp phá vỡ tế bào (phá vỡ sốc nhiệt, thNm thấu dung dịch đường nồng độ cao sóng siêu âm) để lựa chọn phương thu nhận dịch chiết sinh khối protein hiệu Sau khảo sát phương pháp thu tủa protein tảo (phương pháp tủa muối, tủa cồn tủa điểm đẳng điện) để lựa chọn phương pháp tối ưu ứng dụng thu nhận phycocyanin có tảo Spirulina ABSTRACT We have already investigated and brought the effect way out to separate protein in Spirulina to develop potential and using value of this algae, then step by step improving on protein receiving process from this valuable food to apply more and more to processing foods, medicines and comestics We have studied three Spirulina algae cell broken-method (heat-shock, endosmosing by high concentration sugar liquid and by ultrasound wave) so choosing the best one to get the protein biomass abstraction After that, we investigated some ways to receive Spirulina’s protein (salting precipitation, precipitation by alcohol and by isoelectric point) then getting the optimal way to carry phycocyanin out from Spirulina algae MỤC LỤC CHƯƠNG I: MỞ ĐẦU CHƯƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu tảo Spirulina - 2.1.1 Phân loại - 2.1.2 Cấu tạo tế bào - 2.1.3 Đặc điểm sinh sản tảo Spirulina - 2.1.4 Đặc điểm sinh lý tảo Spirulina - 2.1.4.1 Các yếu tố vật lý, hóa học ảnh hưởng đế phát triển Spirulina 2.1.4.2 N guồn dinh dưỡng tảo Spirulina 2.1.5 Công nghệ sản xuất tảo Spirulina -10 2.1.5.1 Công nghệ nuôi trồng -10 2.1.5.2 Điều kiện cần thiết cho việc nuôi tảo -11 2.1.5.3 Quy trình cơng nghệ ni thu sinh khối tảo -11 2.2 Giá trị dinh dưỡng tảo Spirulina 12 2.2.1 Protein -13 2.2.2 Acid amin -14 2.2.3 Lipid -15 2.2.4 Sắc tố 16 2.2.5 Vitamin 19 2.2.6 Chất khoáng 21 2.2.7 Carbohydrate tảo Spirulina 23 2.2.8 Enzyme tảo Spirulina 23 2.2.9 Các nhóm hoạt chất có hoạt tính sinh học tảo Spirulina 23 2.3 Các ứng dụng tảo Spirulina 26 2.3.1 Ứng dụng Spirulina phòng chống bệnh phục hồi sức khỏe -27 2.3.1.1 Giúp giảm cholesterol 27 2.3.1.2 Phòng chống bệnh ung thư tăng cường hệ miễn dịch -27 2.3.1.3 Tác dụng kháng virus -30 2.3.1.4 Tác động tốt bệnh tiểu đường cao huyết áp -30 2.3.1.5 Hiệu làm lành vết thương kháng sinh 31 2.3.1.6 Khả cung cấp sắt điều trị bệnh thiếu máu 31 2.3.1.7 Lợi ích Spirulina trẻ em suy dinh dưỡng -32 2.3.2 Spirulina sử dụng làm nguồn thức ăn bổ sung cho gia súc, gia cầm, tằm vật nuôi khác -33 2.3.3 Spirulina ứng dụng làm phân bón sinh học 34 2.3.4 Ứng dụng công nghệ thực phNm 34 2.3.5 Ứng dụng xử lý môi trường -35 2.4 Tổng quan protein 35 2.4.1 Đặc điểm protein 36 2.4.2 Tính chất protein -36 2.4.2.1 Hình dạng protein phân tử lượng protein -36 2.4.2.2 Tính hịa tan 36 2.4.2.3 Tính chất quang học protein 38 2.4.2.4 Tính chất biến tính protein 39 2.4.2.5 Tính chất sinh học protein -40 2.4.2.6 Tính chất lưỡng tính protein 40 2.4.2.7 Các phản ứng màu đặc trưng protein 41 2.5 Công nghệ protein 44 2.5.1 Các nguồn thu nhận protein 44 2.5.2 Tinh protein -44 2.5.3 Thu nhận sinh khối protein thô 48 2.5.3.1 Phá vỡ tế bào -48 2.5.3.2 Loại bỏ vách mảnh vỡ tế bào 50 2.5.4 Tủa protein bước đầu tinh protein -52 2.5.4.1 Tủa muối -52 2.5.4.2 Tủa dung môi hữu 53 2.5.4.3 Tủa điểm đẳng điện -54 2.5.4.4 Tủa protein polymer 54 2.5.4.5 Tủa protein chất đa điện phân 55 CHƯƠNG III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 56 3.1 N guyên vật liệu -56 3.2 Máy móc thiết bị sử dụng 57 3.3 Sơ đồ nghiên cứu -60 3.4 Phương pháp nghiên cứu 61 3.4.1 Phương pháp phá vỡ tế bào -61 3.4.1.1 Phương pháp sốc nhiệt 61 3.4.1.2 Phương pháp phá vỡ tế bào sóng siêu âm -61 3.4.1.3 Phương pháp dùng trình thNm thấu dung dịch đường nồng độ cao 61 3.4.2 Phương pháp tủa protein 62 3.4.2.1 Tủa cồn ethanol 96% 62 3.4.2.2 Tủa muối -63 3.4.2.3 Tủa điểm đẳng điện 65 3.4.3 Khảo sát hòa tan tủa protein dung dịch đệm 66 3.5 Các phương pháp phân tích -66 3.5.1 Xác định đạm tổng số -66 3.5.2 Định lượng protein hòa tan phưong pháp Lowry -67 3.5.3 Ước lượng hàm lượng sắc tố Chlorophyll 69 3.5.4 Ước lượng hàm lượng protein màu pbycocyanin -69 CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN -70 4.1 Kết khảo sát đánh giá hiệu suất trích ly phương pháp phá vỡ tế bào -70 4.1.1 Hiệu suất trích ly phương pháp sốc nhiệt 70 4.1.2 hiệu suất trích ly phương pháp dùng áp suất thNm thấu -71 4.1.3 Hiệu suất trích ly phương pháp dùng sóng siêu âm 72 4.1.4 N hận xét chung hiệu suất trích ly phương pháp 73 4.2 Kết phân tích hàm lượng protein hịa tan dịch chiết 74 4.2.1 Kết phân tích hàm lượng protein hòa tan dịch chiết thu xử lý phương pháp sốc nhiệt -74 4.2.2 Kết phân tích hàm lượng protein hòa tan dịch chiết thu xử lý phương pháp áp suất thNm thấu -75 4.2.3 Kết phân tích hàm lượng protein hòa tan dịch chiết thu xử lý phương pháp dùng sóng siêu âm -76 4.2.4 N hận xét hàm lương protein dịch chiết thu 77 4.3 N hận xét chung trình xử lý thu sinh khối tảo 78 4.4 Kết khảo sát phương pháp tủa protein tảo Spirulina -82 4.4.1 Kết phương pháp tủa cồn -82 4.4.2 Kết phương pháp tủa muối 84 4.4.3 Kết phương pháp tủa điểm đẳng điện -86 4.5 Kết khảo sát hòa tan tủa protein môi trường đệm -87 4.5.1 Sự hòa tan tủa protein cồn dung dịch đệm -88 4.5.2 Sự hòa tan tủa protein muối dung dịch đệm -89 4.5.3 Sự hòa tan tủa protein điểm đẳng điện dung dịch đệm -90 4.6 Ứng dụng thu nhận protein phycocyanin -91 4.6.1 Cách tiến hành 91 4.6.2 Kết 92 4.6.2.1 Kết khảo sát tách loại bỏ tạp chất 92 4.6.2.2 Kết thu tủa phycocyanin -93 CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHN 95 Kết luận -95 Đề nghị 96 TÀI LIỆU THAM KHẢO -97 Chương IV 82 Kết bàn luận 4.4 Kết khảo sát phương pháp tủa protein tảo Spirulina Tất mẫu sử dụng có hàm lượng sinh khối mẫu 40g/l, lượng mẫu sử dụng có khối lượng m = 2g, thể tích V = 50ml Tất mẫu xử lý phá vỡ tế bào sóng siêu âm tổng thời gian phút, ngưng 30 giây sau phút Ly tâm loại bã thu dịch chiết protein hòa tan giữ nhiệt độ lạnh – 50C, sau tiến hành khảo sát tủa thu nhận protein phương pháp khác xem xét khả hòa tan tủa thu Tủa protein thu nhận sấy khô, cân xác định khối lượng (phụ lục 4) Xem xét khả hịa tan trở lại vào mơi trường nước tủa protein thu (phụ lục 5) 4.4.1 Kết phương pháp tủa cồn Sau tiến hành thực nghiệm thu tủa xem xét khả hòa tan tủa protein vừa thu được, thu kết bảng sau: Bảng 4.8: Hàm lượng khả hòa tan nước tủa protein thu tủa cồn Khối OD dịch Hàm lượng Hàm lượng tủa tủa hòa tan protein Mẫu tủa cồn thu nước (mg) protein hòa (pha dịch tủa hịa tan tan lỗng 10 lần) nước (g/l) lượng tủa 50ml nước (mg) Tỷ lệ 1/2,5 845 0,654 7,036 352 Tỷ lệ 1/3 892 0,680 7,316 365 Tỷ lệ 1/3,5 918 0,669 7,197 360 Tỷ lệ 1/4 943 0,647 6961 348 Chương IV 83 1000 900 918 892 845 Kết bàn luận 943 800 hàm lượng protein tủa hòa tan 50ml nước mg protein 700 600 500 400 352 365 360 348 khối lượng tủa thu từ 50ml dịch chiết 300 200 100 Tỷ lệ 1/2,5 Tỷ lệ 1/3 Tỷ lệ 1/3,5 Tỷ lệ 1/4 phương pháp tủa cồn Hình 4.5: Khối lượng protein tủa khả tủa hòa tan nước phương pháp tủa cồn Từ đồ thị ta thấy khối lượng tủa protein thu tỷ lệ với nồng độ cồn sử dụng, nồng độ cồn cao khối lượng tủa thu lớn Tuy nhiên, khơng có tỷ lệ hàm lượng protein thu cho tủa protein hòa tan trở lại vào nước cất Khối lượng tủa thu cao tỷ lệ dịch chiết/cồn 1/4 (943 mg) hàm lượng protein hịa tan cao tỷ lệ 1/3 (365 mg) Điều lý giải cồn tác nhân làm biến tính protein ảnh hưởng đến cấu trúc làm cho tủa protein dạng bất thuận nghịch xảy nên khả hòa tan trở lại protein Trong khoảng giới hạn nồng độ cồn lượng protein tủa nhiều bị tác động làm biến tính phân hủy Tuy nhiên, nồng độ cồn cao dần nồng độ protein cần tủa dịch chiết dần khả làm biến tính phân hủy lại tăng, khối lượng tủa thực chất có tăng theo nồng độ cồn làm khả hòa tan trở lại tủa protein thu Chương IV 84 Kết bàn luận Như vậy, dịch chiết protein tảo với nồng độ tủa theo tỷ lệ dịch chiết/cồn 1/3 cho hiệu tốt nhất, trường hợp khối lượng tủa thu cao khả biến tính bắt đầu xảy Tuy nhiên xét mặt màu sắc dịch sau tủa, phương pháp này, cồn bên tác nhân gây tủa protein nói chung lại tác nhân hịa tan chlorophyll dịch chiết protein tảo Spirulina, khơng tủa chlorophyll mà hịa tan dịch chiết sau tủa làm dịch chiết có màu xanh (hình 4.6) Dịch chiết chứa protein hịa tan Dịch sau tủa Hình 4.6: Màu sắc dịch chiết protein dich sau tủa cồn 4.4.2 Kết phương pháp tủa muối Tiến hành thực nghiệm với tác nhân tủa muối (NH4)2SO4 nồng độ khác nhau, thu kết sau: Chương IV 85 Kết bàn luận Bảng 4.9: Hàm lượng khả hòa tan nước tủa protein thu tủa muối Mẫu Khối lượng OD dịch Hàm lượng Hàm lượng protein tủa tủa muối (g) thu tủa hòa nước tan protein (pha dịch tủa hịa tan lỗng 10 lần) nước (g/l) hòa tan 50ml tủa nước (mg) 30% 873 0,677 7,284 364 40% 966 0,734 7,897 395 50% 994 0,758 8,155 408 60% 1.012 0,775 8,338 417 1200 mg protein 1012 994 966 1000 873 800 hàm lượng protein tủa hòa tan 50ml nước 600 400 364 395 408 412 khối lượng tủa thu từ 50ml dịch chiết 200 30% 40% 50% phương pháp tủa muối 60% Hình 4.7: Khối lượng protein tủa khả tủa hòa tan nước phương pháp tủa muối Qua biểu đồ ta thấy rõ khối lượng tủa thu tỷ lệ thuận với nồng độ muối sử dụng Muối (NH4)2SO4 tác nhân gây tủa protein khơng tác động làm biến tính protein mà làm ổn định hầu hết loại protein, nồng độ muối Chương IV 86 Kết bàn luận cao khối lượng tủa nhiều đồng thời khơng làm biến tính protein nên khả hòa tan trở lại protein tủa cao phương pháp khác Bên cạnh ta thấy chênh lệch khối lượng tủa sử dụng hàm lượng muối 40%và 50% độ bão hịa khơng cao lắm, để hạn chế lượng muối dư thừa cịn tồn mẫu gây khó khăn cho trình tinh protein sau sử dụng nồng độ 40% độ bão hịa thích hợp Hơn nữa, theo dõi so sánh màu sắc dịch sau ly tâm, từ nồng độ 30% sang 40% độ bão hịa thấy khơng cịn màu xanh dịch sau tủa Như mặt cảm quan hàm lượng protein tủa gần hết protein chủ yếu tảo protein màu 4.4.3 Kết phương pháp tủa điểm đẳng điện Tiến hành thực nghiệm tủa dịch chiết protein điểm đẳng điện, khảo sát mức pH khác thu kết sau: Bảng 4.10: Hàm lượng khả hòa tan nước tủa protein thu tủa điểm đẳng điện Mẫu tủa Khối đẳng điện OD dịch tủa hòa Hàm lượng Hàm lượng tủa tan nước ( pha protein thu loãng 10 lần) (mg) dịch lượng protein hòa tủa hòa tan tan nước (g/l) tủa 50ml nước (mg) pH = 687 0,203 2,184 109 pH = 675 0,217 2,335 117 pH = 710 0,231 2,485 124 pH = 714 0,190 2,044 102 pH = 696 0,182 1,958 98 Chương IV 800 700 87 687 675 710 Kết bàn luận 714 696 mg protein 600 500 hàm lượng protein tủa hòa tan 50ml nước 400 300 200 109 100 117 124 102 98 khối lượng tủa thu từ 50ml dịch chiết pH = pH = pH = pH = pH = phương pháp tủa điểm đẳng điện Hình 4.8: Khối lượng protein tủa khả tủa hòa tan nước phương pháp tủa điểm đẳng điện Khối lượng tủa thu phụ thuộc vào mức pH mà loại protein nhiều dịch chiết có pI với mức pH Trong dịch chiết tảo có nhiều loại protein khác mà đa phần protein màu Hình 4.8 cho thấy pH = thu khối lượng tủa nhiều (714 mg) màu tủa không bị biến đổi so với màu tảo ban đầu Tuy nhiên, với phương pháp khả hịa tan tủa protein lại vào nước thấp Như vậy, qua hai phương pháp tủa cồn điểm đẳng điện ta thấy việc hòa tan tủa protein trở lại mơi trường nước cho hiệu thấp lượng protein hịa tan Do đó, chúng tơi tiến hành khảo sát q trình hịa tan tủa protein mơi trường đệm để đánh giá xác khả kết tủa phương pháp 4.5 Kết khảo sát hòa tan tủa protein môi trường đệm Lượng tủa protein thu phương pháp loại bỏ tạp chất hòa tan 50ml dung dịch đệm, khảo sát dung dịch đệm đệm acid acetic – amoniac đệm phosphat mức pH = 5, 6, 7, Chương IV 88 Kết bàn luận 4.5.1 Sự hòa tan tủa protein cồn dung dịch đệm Tủa thu từ 50ml dịch chiết sinh khối sau phương pháp tủa tác nhân cồn tỷ lệ 1/3, tiến hành khảo sát hòa tan tủa protein dung dịch đệm phosphat đệm acid acetic-amoniac Sau đo hàm lượng protein hòa tan dung dịch đệm kết bảng sau (phụ lục 6): Bảng 4.11: Hàm lượng protein cho tủa thu cồn hòa tan đệm Hàm lượng protein hòa tan Hàm lượng protein hòa dịch đệm phosphat (mg) tan dịch đệm acid acetic – amoniac (mg) pH pH = pH = pH = pH = 487 514 510 476 402 457 446 406 600 mg protein/50ml đệm 500 400 514 487 510 457 446 402 476 406 đệm acid acetic - amoniac 300 đệm phosphat 200 100 pH = pH = pH pH = pH = Hình 4.9: Hàm lượng protein cho tủa thu cồn hòa tan đệm Chương IV 89 Kết bàn luận Từ đồ thị thấy khả hòa tan tủa protein đệm tốt nước tan tốt đệm phosphat đệm acetic – amoniac Khoảng pH đệm cho khả hòa tan tốt pH = – (510 – 514 mg protein hòa tan 50ml dung dịch đệm phosphat) 4.5.2 Sự hòa tan tủa protein muối dung dịch đệm Tủa thu muối 40% rửa loại muối tạp chất cho hòa tan vào dung dịch đệm, tiến hành khảo sát thu kết sau: Bảng 4.12: Hàm lượng protein cho tủa thu muối hòa tan đệm Hàm lượng protein hòa Hàm lượng protein hòa tan tan dịch đệm phosphat dịch đệm acid acetic – (mg) amoniac (mg) pH pH = pH = pH = pH = 581 649 718 691 525 596 688 643 800 mg protein/50ml đệm 700 600 688 649 525 581 718 691 643 596 đệm acid acetic - amoniac 500 400 đệm phosphat 300 200 100 pH = pH = pH = pH = pH Hình 4.10: Hàm lượng protein tủa thu muối hòa tan đệm Chương IV 90 Kết bàn luận Như khả tủa protein tác nhân muối cho khả hòa tan dung dịch đệm cao, cao pH = 7, 50ml dịch đệm mức pH = có lượng protein hịa tan 668 mg (đệm acetic – amoniac) 718 mg (đệm phosphat) 4.5.3 Sự hòa tan tủa protein điểm đẳng điện đệm Chúng cho tủa thu phương pháp đẳng điện pH = hòa tan vào dung dich đệm khảo sát thu kết bảng sau: Bảng 4.13: Hàm lượng protein cho tủa thu điểm đẳng điện hòa tan đệm pH Hàm lượng protein hòa tan Hàm lượng protein hòa tan tủa 50ml dịch đệm tủa 50ml dịch đệm acid phosphat (mg) acetic – amoniac (mg) pH = pH = pH = pH = 236 253 252 240 139 157 169 117 300 mg protein/50ml đệm 253 236 250 252 200 169 157 150 240 đệm acid acetic amoniac 139 117 100 đệm phosphat 50 pH = pH = pH = pH = pH Hình 4.11: Hàm lượng protein cho tủa điểm đẳng điện hòa tan đệm Chương IV 91 Kết bàn luận Tủa thu phương pháp đẳng điện có khả hịa tan thấp, mơi trường đệm lượng protein hòa tan thấp so với khối lượng tủa thu nhận Khả hòa tan tủa protein đệm phosphat tốt đệm acid acetic - amoniac, cao pH = – (252 – 253 mg protein hòa tan) Như vậy, qua việc khảo sát tủa protein hòa tan đệm chúng tơi rút kết luận sau: ¾ Tủa protein tan tốt dung dịch đệm phosphat đệm acid acetic – amoniac ¾ Tủa tan tốt đệm có pH = ¾ Khi tủa thu điểm đẳng điện khả hịa tan trở lại môi trường đệm ¾ Tủa muối cồn dễ hòa tan môi trường đệm 4.6 Ứng dụng thu nhận protein phycocyanin Qua khảo sát phương pháp trích ly thu tủa protein từ tảo Spirulina nêu trên, tiến hành khảo sát thực nghiệm thu nhận phycocyanin, loại protein sắc tố có nhiều ứng dụng chiếm hàm lượng cao protein tảo Spirulina 4.6.1 Cách tiến hành ¾ Hịa tan 2g bột tảo 50 ml đệm phosphat pH = đem phá vỡ tế bào sóng siêu âm tổng thời gian phút Ly tâm 5000 vòng 10 phút thu dịch chiết sinh khối protein ¾ Tách phân đoạn loại bỏ tạp chất muối (NH4)2SO4 độ bão hòa thấp Chúng khảo sát nồng độ muối mức 5%, 10%, 15% 20% độ bão hịa ¾ Khảo sát thu nhận tủa phycocyanin muối (NH4)2SO4 30% đến 40% độ bão hịa Chúng tơi khảo sát thu nhận phycocyanin nồng độ muối 30% - 40% độ bão hịa thí nghiệm tủa protein (mục 4.4.2), quan sát tủa protein màu nồng độ muối 30% dịch sau ly tâm thu tủa màu xanh sang nồng độ muối 40% dịch sau ly tâm khơng cịn xuất màu Điều chứng tỏ protein màu Chương IV 92 Kết bàn luận dich chiết sinh khối bị tủa gần hoàn toàn sử dụng nồng độ muối 40%, protein màu tủa có chứa phần lớn phycocyanin 4.6.2 Kết 4.6.2.1 Kết khảo sát tách loại bỏ tạp chất Chúng tiến hành tách phân đoạn protein dịch chiết sinh khối muối (NH4)2SO4 độ bão hòa thấp nhằm loại bỏ protein tạp xem xét nồng độ muối phycocyanin bắt đầu bị tủa nhiều (phụ lục 7), thu kết bảng sau: Bảng 4.14: Nồng độ muối loại tạp chất cường độ màu bước sóng 620 nm Nồng độ muối OD620 (lỗng 10 lần) 5% 10% 15% 20% 0,019 0,023 0,031 0,056 0.06 0.056 0.05 OD 0.04 0.031 0.03 0.02 0.023 0.019 0.01 0% 5% 10% 15% nồng độ muối 20% 25% Hình 4.12: Đồ thị biểu diễn nồng độ muối loại tạp chất cường độ hấp thu màu phycocyanin có protein tạp Qua đồ thị thấy nồng độ muối tăng từ 5% lên 15% tủa protein thu nhận có hàm lượng phycocyanin không cao Tuy nhiên mức tăng nồng độ muối từ 15% lên 20% hàm lượng phycocyanin tủa thu tăng Chương IV 93 Kết bàn luận lên đáng kể thông qua OD620 tăng từ 0,031 (ở nồng độ muối 15%) lên 0,056 (ở nồng độ muối 20%) Như vậy, nồng độ muối 15% trở lên phycocyanin dịch bắt đầu tủa nhiều, để loại bỏ tạp chất protein tạp q trình thu nhận phycocyanin chúng tơi chọn nồng độ (NH4)2SO4 15% 4.6.2.2 Kết thu tủa phycocyanin Sau tủa phân đoạn muối (NH4)2SO4 15%, ly tâm loại tủa protein tạp thu dịch chiết giàu protein tiến hành tủa thu nhận phycocyanin muối (NH4)2SO4 có nồng độ cao (phụ lục 8), kết sau: Bảng 4.15: Nồng độ muối thu tủa cường độ hấp thu màu phycocyanin Nồng độ muối 32% 34% 36% 38% 40% OD620 (pha loãng 10 lần) 0,124 0,133 0,164 0,167 0,169 Hình 4.13: Tủa phycocyanin thu nhận Chương IV 94 Kết bàn luận 0.18 0.17 0.169 0.164 0.16 0.167 OD 0.15 0.14 0.133 0.13 0.12 0.124 0.11 0.1 30% 32% 34% 36% 38% 40% 42% nồng độ muối Hình 4.14: Đồ thị biểu diễn nồng độ muối cường độ hấp thu màu phycocyanin thu nhận Qua đồ thị trên, nhận thấy cường độ hấp thu màu phycocyanin tăng mạnh khoảng nồng độ muối sử dụng từ 32% - 36% (OD620 tăng từ 0,124 lên 0,164), có nghĩa phycocyanin tủa nhiều nồng độ muối Thử nghiệm tăng nồng độ muối khoảng 36% đến 40%, thấy hấp thu màu phycocyanin không tăng mạnh (OD620 tăng từ 0,164 lên 0,169) lúc lượng muối sử dụng nhiều Như vậy, để đảm bảo việc thu nhận phycocyanin đạt hiệu suất cao độ tinh cao chọn nồng độ muối 36% để tủa phycocyanin thích hợp đảm bảo khối lượng thu tủa hạn chế lượng muối có tủa phycocyanin Chương V 95 Kết luận đề nghị CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHN Kết luận 1.1 Từ kết khảo sát phương pháp phá vỡ tế bào thu nhận dịch chiết sinh khối protein tảo Spirulina, chúng tơi rút số kết luận sau: ¾ Phương pháp tốt để xử lý thu nhận sinh khối tảo phương pháp xử lý sóng siêu âm, tổng thời gian xử lý phút ngưng 30 giây sau phút ¾ Phương pháp xử lý sốc nhiệt hiệu không cao gây biến tính thành phần sắc tố màu dịch chiết sinh khối ¾ Phương pháp xử lý thNm thấu không ảnh hưởng nhiều đến chất lượng dịch chiết sinh khối hiệu suất trích ly khơng cao Nồng độ đường cao hiệu suất trích ly tốt khơng triệt để, thích hợp cho quy trình sử dụng dịch chiết đường – tảo quy trình chế biến 1.2 Đối với phương pháp tủa thu nhận protein ¾ Phương pháp tủa tốt để thu nhận protein tảo sử dụng muối (NH4)2SO4, nồng độ 40% ¾ Phương pháp tủa cồn cho hiệu cao thể tích dịch chiết sinh khối/cồn 1/3 Nhược điểm cồn tác nhân hịa tan số protein màu dễ làm biến tính, phân hủy protein ¾ Tủa điểm đẳng điện khơng triệt để khối lượng tủa thu phụ thuộc vào mức pH mà loại protein nhiều dịch chiết có pI với mức pH 1.3 Sự hòa tan tủa protein tảo dung dịch đệm ¾ Tủa protein thu hòa tan tốt ổn định dung dịch đệm nước Khả hòa tan đệm phosphat tốt đệm acid acetic – amoniac Chương V 96 Kết luận đề nghị ¾ Tủa protein thu phương pháp tủa muối tủa cồn hòa tan tốt đệm phosphat, pH = ¾ Tủa protein thu phương pháp đẳng điện khó hịa tan môi trường đệm 1.4 Ứng dụng thu nhận phycocyanin ¾ Tách phân đoạn loại protein tủa (NH4)2SO4 15% độ bão hịa ¾ Thu tủa phycocyanin tốt (NH4)2SO4 36% Đề nghị ¾ Lượng sinh khối cịn sót sau xử lý cịn cao với quy trình xử lý mẫu sốc nhiệt thNm thấu dung dịch đường Cần kết hợp sản xuất bổ sung vào viên nén dinh dưỡng, phối trộn vào bột ngũ cốc hay thức ăn gia súc để tận dụng nguồn sinh khối giàu dinh dưỡng ¾ Nghiên cứu hồn thiện quy trình thu nhận protein nói chung phycocyanin nói riêng từ Spirulina quy mô công nghiệp nhằm ứng dụng quy mơ sản xuất lớn để góp phần hạ giá thành sản phNm ¾ Tiếp tục nghiên cứu tiềm ứng dụng tảo Spirulina ¾ Khảo sát phương pháp tinh protein tảo nghiên cứu phương pháp bảo quản chế phNm hiệu sấy khơ, bảo quản dịch đệm thích hợp… ... việc nghiên cứu thu nhận protein cần thiết để tăng giá trị sử dụng tảo Spirulina Chương I Mở đầu Vì lý chúng tơi thực đề tài ? ?Nghiên cứu thu nhận protein từ tảo Spirulina? ?? nhằm mục đích thu nhận. .. phương pháp đến protein thu nhận dịch chiết protein tảo Spirulina ¾ Khảo sát phương pháp tủa protein tảo Spirulina ¾ Khảo sát hịa tan protein tảo đệm ¾ Ứng dụng thu nhận phycobiliprotein (phycocyanin)... TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU THU NHẬN PROTEIN TỪ TẢO SPIRULINA 2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN: ¾ Lựa chọn phương pháp phá vỡ tế bào ¾ Khảo sát, lựa chọn phương pháp thích hợp để tủa protein từ tảo Spirulina ¾