Khảo sát phương pháp vi gói vi khuẩn lactic và ứng dụng

Đại học quốc gia Tp Hồ Chí Minh TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA - BÙI HÀ TUYẾT VI KHẢO SÁT PHƯƠNG PHÁP VI GÓI VI KHUẨN LACTIC VÀ ỨNG DỤNG Chuyên ngành: Công nghệ sinh học LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, tháng 08 năm 2010 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HỒ CHÍ MINH Cán hướng dẫn khoa học : TS Nguyễn Thúy Hương Chữ ký:……………………………………………………………………… Cán chấm nhận xét : Chữ ký:……………………………………………………………………… Cán chấm nhận xét : Chữ ký:………………………………………………………………………… Luận văn thạc sĩ bảo vệ Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM ngày tháng năm Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: Xác nhận Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV Bộ môn quản lý chuyên ngành sau luận văn sửa chữa (nếu có) Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV Bộ môn quản lý chuyên ngành TRƯỜNG ĐH BÁCH KHOA TP.HCM PHÒNG ĐÀO TẠO SĐH CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc Tp HCM, ngày tháng năm 2010 NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Bùi Hà Tuyết Vi Phái: Nữ Ngày, tháng, năm sinh: 14- 05- 1984 Nơi sinh: Khánh Hịa Chun ngành: Cơng nghệ sinh học MSHV: 03108153 I- TÊN ĐỀ TÀI: KHẢO SÁT PHƯƠNG PHÁP VI GÓI VI KHUẨN LACTIC VÀ ỨNG DỤNG II- NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Vi gói vi khuẩn lactic Khảo sát hiệu vi gói nhằm nâng cao hoạt tính Probiotic Ứng dụng lên men sữa chua III- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : ngày 15 tháng năm 2010 IV- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: ngày 15 tháng 07 năm 2010 V- CÁN BỘ HƯỚNG DẪN : TS Nguyễn Thúy Hương Nội dung đề cương luận văn thạc sĩ Hội đồng chuyên ngành thông qua CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TS Nguyễn Thúy Hương CN BỘ MÔN QL CHUYÊN NGÀNH PGS.TS Nguyễn Đức Lượng LỜI CÁM ƠN Đầu tiên, tơi xin trân trọng kính gửi lời cám ơn đến tất quý thầy cô khoa kỹ thuật hóa học, đặc biệt thầy môn Công nghệ sinh học, trường đại học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm cho suốt trình học tập tạo điều kiện thuận lợi cho thực luận văn Tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến Tiến sĩ Nguyễn Thúy Hương – người Thầy dành nhiều thời gian tâm huyết hướng dẫn, động viên giúp hồn thành luận văn Đồng thời, cịn người chia kinh nghiệm sống quý báu, kinh nghiệm làm việc cho tôi, giúp cảm thấy tự tin vào Tơi xin cám ơn ba mẹ, gia đình người thân u ln bên cạnh chia sẻ, động viên giúp đỡ cho mặt vật chất lẫn tinh thần suốt thời gian theo học thực luận văn Cuối cùng, xin chân thành cám ơn bạn lớp cao học Cơng nghệ sinh học khóa 2008 khóa 2009 bạn sinh viên ngành Công nghệ sinh học, trường đại học Bách Khoa Tp Hồ Chí Minh nhiệt tình giúp đỡ chia sẻ vui buồn với thời gian thực luận văn Đây thật khoảnh khắc mà nhớ lịng TĨM TẮT Mục tiêu nghiên cứu đề tài tiến hành thử nghiệm vi gói vi khẩn Lactobacillus bulgaricus gel gelatin kết hợp với alginate phương pháp nhũ tương Sau đó, khảo sát hoạt lực lên men hiệu Probiotic chế phẩm ứng dụng lên men sữa chua Trong phạm vi đề tài, thực nghiên cứu cụ thể đạt số kết Đó xác định nồng độ tối ưu gelatin 10% alginate 2%, tạo hạt có kích thước nhỏ 0,4–0,5 mm chứa khoảng 0,9.108 tế bào/g Kết khảo sát điều kiện cực đoan: chế phẩm vi gói bảo vệ vi khuẩn tốt so với tế bào tự khoảng thời gian 30 phút (≈ 72%), 60 phút (≈ 48%), 90 phút (≈ 30%) Đồng thời, ứng dụng lên men sữa chua, chế phẩm có tương đồng so với tế bào tự hoạt lực lên men tối ưu 420C 6h, tạo sản phẩm có chất lượng cảm quan tốt ABSTRACT Research objectives of this subject has trials of Lactobacillus bulgaricus encapsulation using gelatin gel combined with alginate gel by emulsion method Then, we surveyed work force and the effective fermentation of probiotic preparations and fermented yogurt applications Within the project, we had made specific studies and achieved some results It was determined the optimal concentration of gelatin is 10% and 2% alginate, creating particle sized beads from 0.4 to 0.5 mm containing about 0,9.108 cells/g Survey results in extreme conditions (simulated gastric juice - SGJ, bile salt enviroment): these beads protect bacteria to survive better than non-encapsulated bacterial cells in the free 30minute period (about 72%), 60 minutes (about 48%), 90 minutes (about 30%) Simultaneously, the yoghurt fermentation applications, these products have similarities compared with free cell fermentation regarding the optimal force in 42 0C in hours, to create products with good organoleptic quality MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Vi khuẩn lactic trình lên men 1.1.1 Đặc điểm chung hệ vi khuẩn lactic 1.1.2 Vi khuẩn Lactobacillus bulgaricus 1.1.3 Cơ chế trình lên men lactic 1.2 Phương pháp vi gói 1.2.1 Tổng quan vi gói 1.2.2 Cấu trúc hạt vi gói 10 1.2.3 Nguyên vật liệu cho vi gói 11 1.2.3.1 Gelatin 12 1.2.3.2 Alginate 16 1.2.3.3 Các hợp chất vi gói khác 18 1.2.4 Ứng dụng vi gói 22 1.2.5 Các phương pháp vi gói 24 1.2.5.1 Phương pháp nhũ tương hóa 25 1.2.5.2 Phương pháp nén ép 26 1.3 Những nghiên cứu nước 27 1.3.1 Các nghiên cứu nước 27 1.3.2 Các nghiên cứu nước 27 Chương 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Trang thiết bị dụng cụ 30 2.2 Hóa chất 30 2.3 Vật liệu 30 2.4 Nội dung phương pháp nghiên cứu 30 2.4.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 30 2.4.2 Bố trí thí nghiệm 32 2.4.2.1 Hoạt hóa, tăng sinh giữ giống vi khuẩn L burgaricus 32 2.4.2.2 Khảo sát sinh học giống vi khuẩn L burgaricus 32 2.4.2.3 Thu sinh khối tế bào 33 2.4.2.4 Nghiên cứu tạo vi gói vi khuẩn Lactic với loại chất vi gói 34 2.4.2.5 Khảo sát chất lượng hạt vi gói 35 a Khảo sát khả tồn vi khuẩn vi gói môi trường dày nhân tạo SGJ 35 b Khảo sát khả phóng thích chế phẩm vi gói mơi trường muối mật nhân tạo 36 c Khảo sát khả lên men hình thức tiếp giống tế bào tự chế phẩm vi gói 36 d Đánh giá chất lượng sản phẩm 37 2.4.2.6 Các phương pháp khác 38 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 Khảo sát đặc tính sinh học giống vi khuẩn L bulgaricus 41 3.1.1Tăng sinh giữ giống môi trường MRS 41 3.1.2 Quan sát đại thể vi thể vi khuẩn L bulgaricus 42 3.1.3 Lập đường chuẩn sinh khối 43 3.1.4 Đường cong sinh trưởng 44 3.2 Tạo chế phẩm vi gói vi khuẩn Lactic với loại chất vi gói 45 3.3 Khảo sát chất lượng hạt vi gói 48 3.3.1 Khả tồn L.bulgaricus môi trường acid dày nhân tạo (SGJ) 48 3.3.2 Khả tồn L.bulgaricus môi trường muối mật 53 3.3.3 So sánh khả lên men hình thức tiếp giống tế bào tự chế phẩm vi gói 55 3.3.4 Đánh giá chất lượng cảm quan sữa chua 57 Chương : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận 59 4.2 Kiến nghị 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 PHỤ LỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 4.2 Kiến nghị Sau trình thực nghiệm, điều kiện quỹ thời gian có hạn nên chúng tơi có số kiến nghị sau: - Đánh giá thời gian bảo quản chế phẩm vi gói kiểm nghiệm tiêu hóa lý, vi sinh sản phẩm sữa chua - Thực vi gói theo phương pháp khác nêu phần tổng quan tài liệu luận văn để so sánh với phương pháp nhũ tương - Thực phối trộn gelatin với chất tạo gel khác như: chitosan, agar, κ-carrageenan,…để so sánh với hỗn hợp phối trộn gelatin alginate, xem xét hỗn hợp bảo vệ vi khuẩn lactic tốt - Nghiên cứu khả phóng thích tế bào vi khuẩn lactic mơi trường hệ tiêu hóa nhân tạo để khảo sát đầy đủ hiệu vi gói vi khuẩn probiotic - Khảo sát ảnh hưởng tốc độ khuấy lắc đến hạt vi gói 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo nước Nguyễn Lân Dũng cộng (1980), Vi sinh vật học, tập 2, NXB Đại học trung học chuyên nghiệp Nguyễn Lân Dũng, 1998 Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học – tập Nhà xuất khoa học kỹ thuật, Hà Nội Võ Huy Dâng (2002), Công nghệ vật liệu y sinh học, trang 350-358 Trần Lê Bảo Hà (2004), Thiết kế đánh giá màng gelatin-alginate điều trị tổn thương bỏng, Luận văn thạc sĩ, Trường Đại học Khoa học tự nhiên TP HCM Trần Hùng (2004), Bài giảng dược liệu học, trang 38-39, 86-87, 144-145 Lê Duy Linh ( chủ biên), Trần Thị Hường, Trịnh Thị Hồng, Lê Duy Thắng, Thực tập vi sinh sở, Nhà xuất đại học Quốc Gia, TP.HCM-2001 Nguyễn Đức Lượng (2000), Cơ sở vi sinh học công nghiệp, Nhà xuất Đại Học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết (2006), Thí nghiệm Cơng nghệ sinh học, tập 2: Thí nghiệm vi sinh vật học, NXB Đại học Quốc gia TP HCM Nguyễn Đức Lượng (2006) Công nghệ vi sinh tập 2- Vi sinh vật học công nghiệp, NXB D9HQG TP.HCM 10 Lê Văn Việt Mẫn (2004), Công nghệ sản xuất sản phẩm từ sữa thức uống, tập 1: Công nghệ sản xuất sản phẩm từ sữa, NXB Đại học Quốc gia TP HCM 11 Lê Quan Nghiệm, Huỳnh Văn Hóa (2007), Bào chế sinh dược học, tập 2, NXB Giáo dục 12 Lương Đức Phẩm (2000), Vi sinh vật học an toàn vệ sinh thực phẩm, NXB Nông nghiệp Hà Nội 13 Phạm Văn Sổ, Bùi Thị Như Thuận, Kiểm nghiệm lương thực thực phẩm, Nhà xuất khoa học kỹ thuât Hà Nội 62 14 Lâm Xn Thanh (2004), Giáo trình cơng nghệ sản phẩm từ sữa, NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội 15 Lê Thị Liên Thanh, Lê Văn Hồng (2002), Cơng nghệ chế biến sữa sản phẩm sữa, NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội 16 Hà Duyên Tư (1996), Quản lý kiểm tra chất lượng thực phẩm, Đại học Bách Khoa Hà Nội 17 Hà Duyên Tư, Lưu Duẩn (1998), Đánh giá thực phẩm phương pháp kiểm nghiệm cảm quan, Nhà xuất Khoa Học Kỹ Thuật, Hà Nội Tài liệu tham khảo nước 18 Adamson AW (1982) Viability of microencapsulated bifidobacteria in set yogurt during refrigerat-ed storage Physical Chemistry of Surfaces, New York: Wiley, J Dairy Sci 83 (1946-1951) 19 Amir Mortazavian-Seyed Hadi Razavi-Mohammad Reza Ehsani-Sara Sohrabvandi (2007), Principles and methods of microencapsulation of probiotic microorganisms, Iranian journal of biotechnology, 5(1), 1-17 20 Anil Kumar Anal, Harjindersingh (2007).Recent advances in microencapsulation of probiotics for industrial applications and targeted delivery Trends in food Science and Technology, page240-251 21 Arnauld JP, Laroix C, Choplin L (1992), Effect of agitation rate on cell release raye and metabolism during continues fermentation with entrapped growing Lactobacillus casei subsp casei Biotech Tech, 261-265 22 Audet P, Paquin C, Lacroix C (1988), Immobilized growing lactic acid bacteria with κ-carrageenan-locust bean gum gel, Appl Microbiol Biotechnol, 11-18 23 Benlitz – Grosch (1999), Food Chemistry Springer, Germany 24 Canh Le-Tien*†, Mathieu Millette†, Mircea-Alexandru Mateescu* and Monique Lacroix† (2003), Modified alginate and chitosan for lactic acid bacteria Immobilization- Biotechnology and applied biochemistry, 2004 (347-353) 63 25 Caroline L Hyndman, Anne F Groboillot, Denis Poncelet, Claude P Champagne, Ronald J Neufeld - Microencapsulation of Lactococcus lactis within cross-linked gelatin membranes- Journal of Chemical Technology & Biotechnology 2007 (259-263) 26 Champagne CP, Morin N, Couture R, Gagnon C, Jelen P, Lacroix C (1992), The potential of immobilized cell technology to pro-duce freeze-dried, phageprotectd cultures of Lactococcus latis, Food Res Int 25: 419-427 27 Chandramouli V, Kalasapathy K, Peiris P, Jones M (2004), An improved method of microencapsulation and its evaluation to protect Lactobacillus spp In simulated gastric conditions J Microbiol Meth 56 (27 – 35) 28 Charles W Bamford (2005), Food fermentationand micro-organisms,31-33 USA: Blackwell publishing 29 Dave RI, Shah NP (1997), Viability of yoghurt and probiotic bacte-ria in yoghurts made from commercial starter cultures Int Dairy J (31 – 41) 30 Dimantov A, Greenberg M, Kesselman E, Shimoni (2003), Study of high amylase corn starch as food grade enteric coating in a microcapsule model systems Innov Food Sci Eng Technol (93 – 100) 31 Doktor Ingenieur, Hohen Landwirtschaftlichen Fakultät, Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität, Sameh Hassan Mosilhey (2003), Influence of Different Capsule Materials on the Physiologica Properties of Microencapsulated Lactobacillus acidophilus, page 1-113 32 Eikmeier H, Rehm HJ (1987), Stability of calcium-alginate during citric acid production of immobilized Aspergillus niger Appl Microbiol Biotechnol 26(105 – 111) 33 Ellenton JC (1998), Encapsulation bifidobacteria, Master thesis, University of Guelph 34 E Waagner Nielsen, JensA Ullum (1989), Dairy technology Danish Turnkey Dairies Ltd 35 Filomena Nazzaroa, Florinda Fratianni, Raffaele Coppolaa, Alfonso Sadaa, 64 Pierangelo Orlandob (2009), Fermentative ability of alginate-prebiotic encapsulated Lactobacillus acidophilus and survival under simulated gastrointestinal conditions Journal of functional foods page 319 – 323 36 Groboillot AF, Champagne CP, Darling GD, Poncelet D (1993), Membrane formation by interfacial cross-linking of chitosan for encapsulation of Lactobacillus lactis Biotechnol Bioeng 37 Gunduz (2005), Lactic acid production by Lactobacillus casei NRRL B-441 immobilized in chitosan stabilized Ca- alginate beads.Izmir 38 Haralampu SG (2000), Resistant starch-a review of the physical properties and biological impact of RS3, Carbohydrate Polymers, 285-292 39 Hojo K, Ohshima T, Yashima A, Gomi K, Maeda N (2001), Effects of Yoghurt on the Human Oral Microbiota and Halitosis 40 Jankowski T, Zielinska M (1997), Encapsulation of lactic and bacteria with alginate/starch capsules, Biotechnol Technol, 31-34 41 J S Lee, D S Cha, and H J Park (2004), Survival of Freeze-Dried Lactobacillus bulgaricus KFRI 673 in Chitosan-Coated Calcium Alginate Microparticles- Journal of agricultural and food chemistry- biotech.korea.ac.kr (7300- 7305) 42 Khalida Sultana, Georgia Godward, N Reynolds, R Arumugaswamy, P Peiris and Kaila Kailasapath (2000), Encapsulation of probiotic bacteria with alginate–starch and evaluation of survival in simulated gastrointestinal conditions and in yoghurt- International journal of food microbiology (4755) 43 Khalil AH, Mansour EH (1998), Alginate encapsulated bifidobac-teria survival in mayonnaise J Food Sci 63 (702 – 705) 44 Krasaekoopt W, Bhandari B, Deeth H (2003), Evaluation of encap-sulation techniques of probiotics for yoghurt Int Dairy J 13 (3 – 13) 65 45 Krasaekoopt W, Bhandari B, Deeth H (2004), The influence of coating materials on some properties of alginate beads and sur-vivability of microencapsulated probiotic bacteria Int Dairy J 14 (737 – 743) 46 Lacroix C, Paquin C, Arnaud JP (1990), Batch fermentation with entrapped cells of Lactobacillus casei: optimization f the rheo-logical properties of the entrapment gel matrix Appl Microbiol Biotechnol 32 (403 – 408) 47 Lan-szu Chou, Bart Weimer (1999), Isolation and Characterization of Acid- and Bile-Tolerant Isolates from strains of Lactobacillus acidophilus Dairy Sci, page 23-31 48 M Kalab, A F Yang and Denise Chabot (2008), Conventional Scanning Electron Microscopy of Bacteria Proceedings of the Royal Microscopical Society, the UK (42 – 61) 49 Martinsen A, Skjak-Braek C, Smidsrod (1989), Alginate as immo- bilization material: correlation between chemical and physical properties of alginate gel beads Biotechnol Bioeng 33 (79 – 89) 50 Mattila-Sandholm T, Myllarinen P, Crittenden R, Mogensen G, Fonden R, Saarela M (2002), Technical challenges for future probiotic foods Int Dairy J.12: 173-182 51 Mortazavian AM, Ehsani MR, Mousavi SM, Reinheimer JA, Emamdjomeh Z, Sohrabvandi S, Rezaei K (2006a) Preliminary investigation of the combined effect of heat treatment incubation temperature on the viability if the probiotic microorganisms in freshly made yoghurt Int J Dairy Technol 59 (8 – 11) 52 Mortazavian AM, Sohrabvandi S, Mousavi SM, Reinheimer, JA (2006a) Combined effects of heating variables on the viability of Probiotic microorganisms in yogurt 53 Mortazavian, AM, Sohrabvandi S (2006b) Combined effects of heating variables on the viability of Probiotic microorganisms in yogurt 66 54 Malm CJ, Emerson J, Hiatt GD (1951), Cellulose acetate phthalate as enteric coating material, J American Pharm Assoc Sci 10, 520-522 55 N.T Annan, A.D Borza and L Truelstrup Hansen 92008), Encapsulation in alginate-coated gelatin microspheres improves survival of the probiotic Bifidobacterium adolescentis 15703T during exposure to simulated gastrointestinal conditions-Food Research International (184-193) 56 Picot A, Lacroix C (2003a), Effect of micronization on viability and thermotolerance of probiotic freeze-dried cultures Int Dairy J 13 (455 – 462) 57 Picot A, Lacroix C (2004), Encapsulation of bifidobacteria in whey protein microcapsules and survival in simulated gastrointestinal conditions and in yoghurt Int Dairy J page 505-515 58 Rail University, Organic acids- lactic acid, industrial biotechnology 6, 9499 59 Roy D, Goulet J, Leduy A (1987), Continues production of lactic acid from whey permeate by free and calcium-alginate entrapped Lactobacillus helveticus J Dairy Sci 70 (506 – 513) 60 Shah NP, Lankaputhra WEV, Britz M, Kyle WSA (1995), Survival of Lactobacillus acidophilus 61 Sheu TY, Marshall RT (1993), Microentrapment of lactobacilli in calcium alginate gel J Food Sci 54 (557 – 561) 62 Smidsrod O, Skjak-Braek G (1990), Alginate for cell immobiliza-tion Trends in Food Sci Technol (71 – 75) 63 Sultana K, Godward G, Reynolds N, Arumugaswamy R, Peiris P, Kailasapathy K (2000), Encapsulation of probiotic bacteria with alginatestarch and evaluation of survival in simulated gastroin-testinal conditions and in yoghurt 64 Sung Woo Kim (2004), The study of chitosan/gelatin based films crosslinked by proanthocyanidins as biomaterial, UMI number: 1421773 67 65 Truelstrup-Hansen L, Allan-wojtas PM, Jin YL, Paulson AT (2002), Survival of free and calcium-alginate microencapsulated Bifidobacterium 66 Wunwisa Krasaekoopt (2002), Evaluation of encapsulation techniques of probiotics for yoghurt International Dairy Journal 67 W.K Ding and N.P Shah (2009), Effect of Various Encapsulating Materials on the Stability of Probiotic Bacteria- Journal of Food Science ( M100M107) Tài liệu internet 68 http://en.wikipedia.org/wiki/Gelatin#searchInput 69 www.gelatine.org 70 http://www.gmap-gelatin.com/ 71 http://www.kimica.ip/eng-Manufacturing-P6.htm 72 fmcbiopolymer.com/ingredients/alginate%20PGA/gelation/tabid/2412/defaul t Aspx 73 www.thuviencongdong.org -Influence of Different Capsule Materials on the Physiological Properties of Microencapsulated Lactob Phụ lục MẪU PHIẾU TRẢ LỜI ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG CẢM QUAN SẢN PHẨM Phương pháp so sánh cặp Họ tên người thử: Giới tính:…… Nghề nghiệp: Tuổi:………… Ngày thử: Bạn nhận cặp mẫu sản phẩm Bạn đánh giá mẫu có khác tính chất sau đây: Tính chất cảm quan Trạng thái sản phẩm (mịn, sệt, đồng nhất) Màu sắc Mùi Vị Ghi chú: Nếu đặc tính mẫu tốt mẫu (kí hiệu >) Nếu đặc tính mẫu mẫu (kí hiệu