Thử nghiệm khả năng ứng dụng Enzyme protease

Thử nghiệm khả năng ứng dụng Enzyme protease từ nội tạng tôm trong sản xuất Chitin (74 trang)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************************** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG PROTEASE TỪ NỘI TẠNG TÔM TRONG SẢN XUẤT CHITIN Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện : TRẦN THỊ NGỌC HÀ Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************************** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP VĂN BẰNG KỸ SƢ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG PROTEASE TỪ NỘI TẠNG TÔM TRONG SẢN XUẤT CHITIN Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS - TS. NGUYỄN TIẾN THẮNG TRẦN THỊ NGỌC HÀ ThS. NGUYỄN LỆ HÀ Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 iii LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn: Ba mẹ và những ngƣời thân trong gia đình đã giúp con có sự thành đạt nhƣ hôm nay. Ban giám hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm TP. HCM, ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trƣờng. PGS – TS. Nguyễn Tiến Thắng, ThS. Nguyễn Lệ Hà, CN. Đỗ Thị Tuyến đã hết lòng hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp. Các anh chị tại phòng Các chất có hoạt tính sinh học đã tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian thực tập tốt nghiệp. Bạn Lê Minh Thông, Trƣơng Minh Dũng, Ngô Thị Thu Ngân và Cao Thị Thanh Loan. Các bạn bè thân yêu của lớp CNSH K29 đã chia xẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng nhƣ hết lòng hổ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập. iv TÓM TẮT Đề tài nghiên cứu “Thử nghiệm khả năng ứng dụng Enzyme protease từ nội tạng tôm trong sản xuất Chitin” đƣợc tiến hành tại phòng thí nghiệm Viện Sinh học nhiệt đới, thời gian từ tháng 4 đến tháng 7/2007 với mục đích xem xét Enzyme từ nội tạng tôm có thể dùng để thủy phân, loại protein thay thế cho việc dùng NaOH hay không. Thử nghiệm sản xuất Chitin đƣợc bố trí trên cả 2 loại nguyên liệu là vỏ tôm khô và tƣơi, dƣới cả 2 hình thức khử: khử khoáng trƣớc và khử protein trƣớc. Công đoạn khử khoáng thực hiện bằng cách: xử lý với HCl 10%; trong 5 giờ; ở nhiệt độ phòng; tỷ lệ giữa nguyên liệu vỏ tôm tƣơi và dung dịch HCl là 1:5 (W/V), đối với vỏ tôm khô là 1:10 (W/V). Đối với công đoạn tẩy màu: với KMnO4 1%, H2SO4 10%; trong 1,5 giờ và với Na2S2O3 2%; trong 15 phút. Kết quả đã xác định đƣợc các thông số thích hợp cho quá trình thủy phân protein vỏ tôm bằng chế phẩm protease thô từ nội tạng tôm nhƣ sau:  Đối với quá trình sản xuất Chitin thực hiện thủy phân protein trƣớc: - Nồng độ Enzyme thủy phân tốt nhất ở cả vỏ khô và vỏ tƣơi là 6%. - Nhiệt độ thủy phân tốt nhất: ở vỏ khô là 550C, ở vỏ tƣơi là 600C. - pH thủy phân tốt nhất ở cả vỏ khô và vỏ tƣơi là 7 - Thời gian thủy phân tốt nhất ở cả 2 loại vỏ là 4 giờ.  Đối với quá trình sản xuất Chitin thực hiện khử khoáng trƣớc: - Nhiệt độ thủy phân tốt nhất: ở vỏ khô là 600C, ở vỏ tƣơi là 550C. - pH thủy phân tốt nhất ở cả vỏ khô và vỏ tƣơi là 7. - Thời gian thủy phân tốt nhất ở cả 2 loại vỏ là 4 giờ. v MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm ơn iii Tóm tắt iv Mục lục . v Danh sách các hình viii Danh sách các bảng . ix Chƣơng 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề . 1 1.2. Mục đích nghiên cứu . 2 Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Những khái niệm chung về Enzyme . 3 2.1.1. Đại cƣơng về Enzyme 3 2.1.1.1. Lịch sử phát triển 3 2.1.1.2. Định nghĩa 4 2.1.1.3. Bản chất của Enzyme . 4 2.1.1.4. Phân loại . 5 2.1.1.5. Hoạt tính Enzyme . 6 2.1.2. Đại cƣơng về Enzyme protease 6 2.1.2.1. Định nghĩa 6 2.1.2.2. Nguồn thu nhận 7 2.1.2.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến tốc độ phản ứng thủy phân bằng Enzyme 8 2.1.2.4. Ứng dụng 10 2.2. Đại cƣơng về tôm và Enzyme protease từ tôm 11 2.2.1. Đại cƣơng về tôm . 11 2.2.2. Thành phần hoá học trong các phần của tôm . 14 2.2.3. Enzyme protease từ tôm . 15 2.2.3.1. Tính chất . 15 2.2.3.2. Phân loại . 17 2.3. Chitin . 17 vi 2.3.1. Đại cƣơng về Chitin . 17 2.3.2. Đặc tính lý hoá học 19 2.3.3. Sự tổng hợp Chitin ở loài giáp xác . 20 2.3.4. Ứng dụng của Chitin . 21 2.3.5. Tình hình nghiên cứu Chitin trên thế giới và ở Việt Nam . 23 2.3.5.1. Tình hình nghiên cứu, sản xuất và tiêu thụ Chitin trên thế giới 23 2.3.5.2. Tình hình nghiên cứu Chitin ở Việt Nam 24 2.3.6. Các phƣơng pháp chiết tách Chitin 26 2.3.6.1. Phƣơng pháp hóa học . 26 2.3.6.2. Phƣơng pháp sinh học 30 Chƣơng 3. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Địa điểm thí nghiệm 32 3.2. Nguyên liệu . 32 3.3. Hóa chất và các thiết bị thí nghiệm chủ yếu đã sử dụng . 33 3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu . 34 3.4.1. Các phƣơng pháp sử dụng trong nghiên cứu 34 3.4.1.1. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng protein theo Bradford 34 3.4.1.2. Phƣơng pháp xác định hoạt tính Enzyme protease (phƣơng pháp Amano)36 3.4.2. Phƣơng pháp tách chiết và thu nhận Enzyme protease 38 3.4.3. Phƣơng pháp sản xuất Chitin bằng Enzyme protease từ nội tạng tôm 40 3.4.4. Bố trí thí nghiệm xác định điều kiện thủy phân vỏ tôm thích hợp bằng chế phẩm thô protease nội tạng tôm . 42 3.4.4.1. Xác định nồng độ Enzyme thủy phân thích hợp 42 3.4.4.2. Xác định nhiệt độ thủy phân thích hợp 43 3.4.4.3. Xác định pH thủy phân thích hợp . 43 3.4.4.4. Xác định thời gian thủy phân thích hợp . 44 3.5. Các phƣơng pháp xử lý số liệu 44 Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Quá trình thủy phân vỏ tôm bằng chế phẩm thô protease nội tạng tôm trên vỏ tôm đƣợc thủy phân protein trƣớc 45 4.1.1. Ảnh hƣởng của nồng độ Enzyme thủy phân 45 4.1.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ thủy phân . 47 vii 4.1.3. Ảnh hƣởng của pH thủy phân 49 4.1.4. Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân . 51 4.2. Quá trình thủy phân vỏ tôm bằng chế phẩm thô protease nội tạng tôm trên vỏ tôm đƣợc khử khoáng trƣớc . 52 4.2.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ thủy phân . 52 4.2.2. Ảnh hƣởng của pH thủy phân . 54 4.2.3. Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân 55 4.3. Kết quả so sánh hiệu suất và đánh giá cảm quan giữa các mẫu sản phẩm Chitin thu đƣợc 56 Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận . 58 5.2. Đề xuất ý kiến . 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO . 60 PHỤ LỤC 61 viii DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1: Tôm 12 Hình 3.1: Nội tạng tôm . 33 Hình 3.2: Máy ly tâm lạnh . 33 Hình 3.3: Bể ổn nhiệt . 33 Hình 3.4: Máy đo quang phổ UV- Vis . 34 Hình 4.1a: Ảnh hƣởng của nồng độ Enzyme trong dịch thủy phân đến sự giảm hàm lƣợng protein hòa tan và hoạt tính Enzyme protease trong quá trình thủy phân vỏ tôm khô . 46 Hình 4.1b: Ảnh hƣởng của nồng độ Enzyme trong dịch thủy phân đến sự giảm hàm lƣợng protein hòa tan và hoạt tính Enzyme protease trong quá trình thủy phân vỏ tôm tƣơi 46 Hình 4.2a: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô 48 Hình 4.2b: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi 48 Hình 4.3a: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô . 50 Hình 4.3b: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi 50 Hình 4.4a: Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô 51 Hình 4.4b: Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi . 51 Hình 4.5a: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô sau khử khoáng 52 Hình 4.5b: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi sau khử khoáng . 53 ix Hình 4.6a: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô sau khử khoáng 54 Hình 4.6b: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi sau khử khoáng 54 Hình 4.7a: Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô sau khử khoáng . 55 Hình 4.7b: Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi sau khử khoáng 56 Hình 4.8: Nguyên liệu và sản phẩm . 57 Hình 3.5: Đƣờng chuẩn protein 61 Hình 3.6: Đƣờng chuẩn protease 61 x DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 4.1a: Ảnh hƣởng của nồng độ Enzyme trong dịch thủy phân đến sự giảm hàm lƣợng protein hòa tan và hoạt tính Enzyme protease trong quá trình thủy phân vỏ tôm khô . 62 Bảng 4.1b: Ảnh hƣởng của nồng độ Enzyme trong dịch thủy phân đến sự giảm hàm lƣợng protein hòa tan và hoạt tính Enzyme protease trong quá trình thủy phân vỏ tôm tƣơi 62 Bảng 4.2a: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô 63 Bảng 4.2b: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi 63 Bảng 4.3a: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô . 64 Bảng 4.3b: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi 64 Bảng 4.4a: Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô 65 Bảng 4.4b: Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi . 65 Bảng 4.5a: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô sau khử khoáng 66 Bảng 4.5b: Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi sau khử khoáng . 66 Bảng 4.6a: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô sau khử khoáng . 67 Bảng 4.6b: Ảnh hƣởng của pH đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm tƣơi sau khử khoáng 67 Bảng 4.7a: Ảnh hƣởng của thời gian thủy phân đến hoạt tính Enzyme protease và hàm lƣợng protein hòa tan trong dịch thủy phân vỏ tôm khô sau khử khoáng . 68 [...]... tận dụng nguồn Chitin dồi dào trong phế liệu tôm, chúng tôi thực hiện đề tài: “ Thử nghiệm khả năng ứng dụng Enzyme protease nội tạng tôm trong sản xuất Chitin” 1.2 Mục đích nghiên cứu Mục đích chung của đề tài là: Nghiên cứu khả năng ứng dụng chế phẩm thô protease nội tạng tôm để thủy phân vỏ tôm sản xuất Chitin Để đạt đƣợc các mục đích này, các mục tiêu cụ thể nhƣ sau: - Xác định nồng độ chế phẩm Enzyme. .. phản ứng, pH hoạt động thích hợp,…Harley (1960) đã phân loại các protease vi sinh vật thành 4 nhóm cơ bản nhƣ sau: - Protease serine - Protease kim loại - Protease acid - Protease tiol 2.1.2.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến tốc độ phản ứng thủy phân bằng Enzyme [3] -Ảnh hƣởng của nồng độ Enzyme Trong điều kiện thừa cơ chất, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ Enzyme Nhƣng nếu tăng nồng độ Enzyme. .. hoặc protease serine dạng trypsin và có khả năng hoạt động rất cao Một số protease tiêu biểu nhƣ: cathepsin, dipeptidase, carboxypeptidase, trypsin … (Nguồn: Bộ nội thƣơng, 1982 Trƣờng đại học Thƣơng nghiệp thƣơng phẩm học hàng thực phẩm, tập II HN) Khả năng hoạt động của các Enzyme tiêu hoá protein khác nhau tuỳ theo loài Chuang (1985) nhận thấy khả năng hoạt động của protease thô đƣợc xác định nhƣ khả. .. chất + H2O Sản phẩm) Nhƣ vậy, phản ứng thủy phân bởi Enzyme là phản ứng lƣỡng phân Nhƣng do trong phản ứng thủy phân lƣợng nƣớc rất lớn và coi nhƣ không đổi trong suốt quá trình, nên tốc độ phản ứng chỉ phụ thuộc nồng độ cơ chất, nghĩa là phản ứng thủy phân bởi Enzyme là phản ứng đơn phân có thứ bậc 1 Trong quá trình phản ứng, các phân tử cơ chất ban đầu sẽ phản ứng một cách độc lập, không phụ thuộc... sung, quả vả Từ vi sinh vật Nhiều loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh protease Các Enzyme này có thể ở trong tế bào (protease nội bào) hoặc đƣợc tiết vào trong môi trƣờng nuôi cấy (protease ngoại bào) Cho đến nay các protease ngoại bào đƣợc nghiên cứu kỹ hơn các protease nội bào Một số protease ngoại bào đã sản xuất ở quy mô công nghiệp và đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành kỹ nghệ khác nhau... vai trò xúc tác của Enzyme trong các quá trình trao đổi chất của tế bào Đã tinh sạch đƣợc hàng ngàn Enzyme và nhờ vậy đã làm sáng tỏ cấu trúc không gian và chức năng xúc tác của hàng trăm Enzyme khác nhau 2.1.1.2 Định nghĩa Enzyme là protein xúc tác sinh học, do tế bào sống sản xuất ra, có tác dụng tăng tốc độ và hiệu suất phản ứng hóa sinh, mà sau phản ứng vẫn còn giữ nguyên khả năng xúc tác (Theo... phải xác định bằng thực nghiệm và kinh nghiệm thực tế cho từng quá trình thủy phân cụ thể - Ảnh hƣởng của lƣợng nƣớc Với phản ứng thủy phân bởi Enzyme thì nƣớc vừa là môi trƣờng để phân tán Enzyme và cơ chất, lại vừa trực tiếp tham gia phản ứng Nƣớc có ảnh hƣởng đến tốc độ và chiều hƣớng của phản ứng thủy phân bởi Enzyme Vì thế, nƣớc là một yếu tố điều chỉnh phản ứng thủy phân bởi Enzyme, nó có thể tăng... Hydrolase: Enzyme xúc tác cho quá trình thủy phân  Liase: Enzyme tham gia xúc tác cho phản ứng loại CO2 (Pyruvate decarboxylase) hay phản ứng tách thuận nghịch phân tử nƣớc (Fumarate hydrolase)  Isomerase: Enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển hóa tƣơng hổ phức tạp giữa galactose và glucose  Ligase: Enzyme xúc tác cho phản ứng carboxyl hóa pyruvic acid, tạo thành oxaloacetid acid 2.1.1.5 Hoạt tính Enzyme Enzyme... gọi Enzyme, theo quy ƣớc quốc tế, tên Enzyme thƣờng có 2 phần: phần đầu là tên cơ chất, phần sau chỉ tên kiểu phản ứng mà chúng xúc tác Năm 1960, Hiệp hội hóa sinh quốc tế đã thống nhất xây dựng hệ thống phân loại Enzyme quốc tế Trong hệ thống phân loại này, tất cả các Enzyme đƣợc phân thành 6 lớp:  Oxydoreductase: Enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa khử  Transpherase: Enzyme xúc tác cho phản ứng. .. nhất là Enzyme Đặc biệt Buchner vào 1897 đã chứng minh chính dịch chiết nấm men (chứ không phải toàn bộ tế bào nấm men) có khả năng lên men đƣờng thành rƣợu Đó là bằng chứng xác thực về sự tham gia của chính bản thân Enzyme trong quá trình lên men Năm 1926, lần đầu tiên Sammer nhận đƣợc tinh thể Enzyme urease Năm 1930, Northrop nhận đƣợc tinh thể pepsin và trypsin và đã chứng minh bản chất của Enzyme . Đề tài nghiên cứu Thử nghiệm khả năng ứng dụng Enzyme protease từ nội tạng tôm trong sản xuất Chitin” đƣợc tiến hành tại phòng thí nghiệm Viện Sinh học. cầu trên và tận dụng nguồn Chitin dồi dào trong phế liệu tôm, chúng tôi thực hiện đề tài: “ Thử nghiệm khả năng ứng dụng Enzyme protease nội tạng tôm