Nghiên cứu phát hiện và định lượng một số đột biến của hội chứng động kinh, giật cơ với sợi cơ không đều – MERRF ở người Việt Nam

Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Sàng lọc 3 đột biến thuộc hội chứng MERRF bằng mẫu máu ngoại vi cùa 312 bệnh nhân nghi mắc bệnh cơ não ty the, được lấy từ bệnh viện Nhi Trvng ươn[r]

(1)

KẾT LUẬN

- Trên chuộí cống ĐTĐ typ thực nghiệm, thân chuối tiêu có tác dụng làm giam nồng độ glucose máu, cholesterol toàn phần, ỉriglycerid huyết thanh, ức chế hoạt độ G

6

- Dự đoán chế tác dụng thân chuối tiêu là: ức chế tân tạo đường thơng qua ức chế G

6

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Võ Văn Chi (2012), Từ điển thuốc Việt nam, Nhà xuất Y học, Tr.467,468

2 Nguyễn Thị Đông (2013), "Nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết địch chiết phân đoạn chloroform thâii Ý dĩ động vật thực nghiệm", Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ, Trung ỉâm thông íin thư viện trường Đại học dược Hà Nội, Tr.20-40

3 Đỗ Thị Nậuyệt Quế (2013), "Nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyễt cua rễ cay choc mau Nam (salasia cochinchinensis L., Celasíraceae) thực nghiệm", Luận án ỉiến sĩ dược học, Trung tâm Thư viện Quốc gia, Viện Dược iiệu, tr.7, 28 -32

4 Enechi

c

5 IDF (2013), Diabes Aiias, International diabetes federation, pp 7-15, 27

6

7 Virginia D, Kappei !, H Luisa (2013), "Beneficial effects of banana leaves (Musa xparadisiaca) on glucose homeostasis: multiple sites of action", Revista Brasileira de Farmacognosia, 23(4), pp 706-715

NGHIÊN c ứ u PHÁT HIỆN VÀ ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ ĐỘT BIẾN

CỦA HỘJ CHỨNG ĐỘNG KINH, GIẠT c VỚI SỢI c

KHÔNG ĐỀU - MERRF Ở NGỮỜI VIỆT NAM

Người ỉhực hiên: Bùi Thị Khánh Khoa Y học s - Trường Cao đắng Y tế Thái Bình Người hướng dẫn: GS.TS Phan Tuấn Nghĩa Phòng thí nghiệm trọng điểm Protein - Enzyme, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Ha Nội TÓM TÁT

Đặt vẩn đề: MERRF (myoclonic epilepsy with ragged-red fibres) hội chứng động kinh giật với sợi không đều, gây nên đột biến gen MT-TK DNA ty thề.

Mục tiêu: Sàng lọc phát đột biến MERRF bệnh nhân nghi mắc bệnh não ty thể Việt Nam, xây dựng phương pháp định lượng đột biến MERRF.

Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Sàng lọc đột biến thuộc hội chứng MERRF mẫu máu ngoại vi cùa 312 bệnh nhân nghi mắc bệnh não ty the, lấy từ bệnh viện Nhi Trvng ương với phương pháp PCR- RFLP, real-time PCR giải trình tự đoạn gen nghi ngờ mang đột biến nghiên cứu.

Kết quả: Không phát trường hợp mang đột biến 312 bệnh nhân lấy mẫu nghiên cứu, thiết kế thành cồng mẫu dị Taqman mang nucleotide dạng khóa cầu methyl thiết lập điều kiện đề phân tích định lượng đột biến A8344G cửa hội chứng MERRF real-time PCR Kết nghiên cứu tái khẳng định bằng ỹià i trình tự vùng gert quan tâm cho kết âm tính cho đột biến A8344G, T8356C, G8363A.

Kết luận: Tuy không phát đột biển, chúng tồi hy vọng với phương pháp sàng lọc định lượng thiết lập cồng cụ hữu ích cho nghiên cứu sau đọt biến này.

Từ khóa: MERRF, động kính giật cơ, sợi khơng đều. SUMMARY

Background: MERRF - syndrome myoclonic epilepsy with ragged-red fibres, affecting the nervous system and skeletal muscles as well as other systems o f the body, caused by mutations in (he genes MT-TK o f mitochondrial DNA Screening and quantitative some mutations o f myoclonic epilepsy with ragged-red fibers - MERRF in Việt Nam patients.

Materials and method: We conduct mutation screening o f MERRF syndrome peripheral blood form o f 312 patients with suspected brain mitochondrial myopathy, was taken from the Central Pediatrics Hospital by PCR- RFLP, real-time PCR and sequencing nucleic acid fragments suspected mutated gene research.

(2)

successful baseline mutation A8344G MERRF syndrome, baseline is established, can bs applied to quantitative analysis A8344G mutation in patients with the mutation pattern with a detection limit to 0.1%, R2 = 0.997 confidence.

Conclusion: still undetected mutations, but we hope with the screening methods and quantitative tool set will be useful for future research on those mutations.

Keyw ords: MERRF, myoclonic epilepsy, ragged-red fibres.

ĐẶT VẮN ĐỀ

MERRF (myoclonic epilepsy with ragged - red fibres) hội chứng động kinh giật với sợi không đều, anh hưởng đển hệ thần kinh xương hệ thống khác thể, gây nên bời đột biến gen MT-TK DNA ty thể Ngoài ra, người mang hội chứng MERRF cỏ thê kèm theo động kinh, điều hịa vận động, suy nhược trí nhớ Triệu chứng thường khởi phát trẻ em sau giai đoạn phát triển bỉnh thường, kết hay gặp íà điếc, thấp bé, thối hóa thần kinh thị giác, quan sát u mỡ khu trú da Tế bào bát thường xuất sợi màu đỏ bị xé rách nham nhở nhuộm với Gomori trichrome quan sát kính hiển vi

Hiện nay, giới có nhiều công trinh nghiên cứu hội chứng MERRF để xác đính nguyên nhân, chế biểu bệnh tính di truyền bệnh Tuy nhiên, tính phức tạp tác động !âm sàng, mô bệnh học, chể phát sinh biểu bệnh nên việc chẩn đoán phương pháp thăm khám lâm sàng hay xét nghiệm thường quy khó khăn, nhiều bệnh nhân MERRF chưa phát khơng có phương pháp điều trị hiệu

• Việt Nam, gần chưa có cơng trinh sâu nghiên cứu phát định lượng đột biến MERRF người Việt Nam.

Nhằm góp phần vào việc chẩn đốn, điều trị tư vấn di truyền bệnh nhân, gia đình bệnh nhân mang hội chứng MERRF chúng tôỉ tiến hành đề tài: “Nghiên cứu phát định lượng số đột biến cua hội chưng động kinh, giật với sợi không - MERRF người Việt Nam"

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯỚNG PHÁP NGHIÊN

cứu

1 Nguyên liệu 1.1 Mấu bệnh phẩm

Mâu máu ngoại vi cùa 312 bệnh nhân người Việt Nam nghi bị bệnh ty thể lẩy từ Bệnh viện Nhi Trung ương, bệnh nhân nghi ngờ mắc hội chứng MERRF dựa có mặt cùa hai ba đặc điểm sau:

Tác động lâm sàng liên quan đến nhiều quan: hệ thần kỉnh trung ương, xương tỉm, tuyến nội tiết, mắt hệ tiêu hóa

Tăng acid lactic máu dịch não tủy Hình ảnh chụp cộng hưởng từ não khơng bình thường

1.2 Các hóa chắt, nguyên liệu khác:

Plasmid chèn đoạn gen 8155 - 8366 có khơng mang đột biến A8344G íà sản phẩm cùa đề tài KC.04.10/11-15 Kit tách chiết DNA tổng số (Qiagen);

Các cặp mồi mẫu dò (Integrated DNA Technologies); Thang chuẩn DNA, hỗn hợp dNTP (Enzynomics); Enzyme giới hạn (Thermoscientitics); Kapa probe fast qPCR, Master Mix (Kapabiosystems) Các hóa chất cịn lậi mua từ hãng tin cậy (Sigma, Merk) đạt độ tinh khiếỉ cằn thiết cho nghiên cứu sinh học phân tử;

2 Mảy móc trang thiết bị

Các máy móc dừng nghiên cứu bao gồm: máy NanoDropTM 8000, máy PCR gradient (Eppendorf), máy real-time PCR ỈQTM cycler (Biorad), máy ly tâm iạnh 5417 R (Eppendorf), thiết bị điện di ngang, điện di đứng (Biorad) vả hệ thong chụp ảnh điện di Geldoc (Biorad)

3 Phương pháp nghiên cứu

3.1 Tách chiết DNA tổng số: DNA tổng số tách tinh từ máu ngoại vi bệnh nhân theo QIAamp DNA Mini Kit Qiagen

3.2 Kiểm tra định lượng DNA tách chiểt: Sự có mặt DNA kiểm tra điện di gei agarose 1% Nồng độ DNA tách chiết định lượng cách đo mật độ háp thụ ánh sáng tư ngoại acid nucleic bước sóng 260 nm (A260) máy Nano-Drop

3.3 Nhân đoạn gen ty thể kỹ thuật PCR: Đoạn gen ty thề mang đột bien MERRF khuếch đại phản ứng chuỗi polymerase (PCR) với cặp mồi đặc hiệu thiết kế chế độ nhiệt thích hợp

3.4 Kỹ thuậí PCR kết hợp với kỹ thuật đa hình chiều dài đoạn phân cắt giới hạn (PCR-RFLP): Sản phẩm PCR sau kiểm tra gel agarose

2

1

ụì đẹm enzyme

7,5 ụị sản phẩm PCR 6,25 Mi ddH20 cho tồng ihe

37°c,

12

(3)

fluorescence quencher)

2.6 Giải trình íự đoạn gen chứa đột biến: Trình tự đoạn gen xác định dựa theo phương pháp Sanger (kết thúc đầu tận chứa dideoxynucleotide - ddNTP)

KẾT QUẢ VÀ TH AO LUẬN

1 Tách chiết DNA tổ n g số mẫu

Kết điện di sản phẩm DNA tổng số từ mẫu máu bệnh nhân cho thấy che phẩm DNA tổng số từ mẫu máu bệnh nhân có băng DNA rõ nét, chứng tỏ DNA tổng số tách nguyên vẹn

Kết đo mậí độ hấp ìhụ ốnh sáng tử ngoại 260 nm chế phẫm DNA tổng số có tỷ số A260/A280 nằm khoảng 1,8-2,0; chứng tỏ chế phẩm DNA íẫn protein hay RNA Như vậy, thu sản phẩm DNA tổng số đạt yêu cẩu đề tiến hành bước thí nghiệm tiếp theo.

2 Sàng lọc đột biên gen thuộc hội chứng MERRF người V ỉẹt Nam phương pháp PCR-RFLP

2.1 Sàng lọc đột biến A8344G

Để xác định thay đổi nucleotide G thành A vị trí 8344 míDNA chúng tơi tiến hành nhân bàn đoạn gen có kích thước 212 bp kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu Kết điển kiểm tra sản phẩm PCR gel agarose 2% cho thấy sản pham DNA khuếch đại cùa đoạn gen có kích thước tính tốn lý thuyết

(212

12

2.2 Sàng lọc đột biến T8356C

Đoạn gen chưa đột biến T8356C phải khuếch đại kỹ thuật PCR với cặp moi đặc hiệu, Sản phẩm PCR cắt trực tiếp enzyme giới hạn Drai Điện di sản phảm cắt gel polyacrylamide

12

2

nhân nghiên cứu không mang đột bien T8356C 2.3 Sàng lọc đột biến G8363A

^ Chủng dùng kỹ thuật PCR với cặp mồi bắt cặp

đặc hiệu với sợi XUÔI sợi ngược đoạn mtDNA nghiên cứu Kiểm tra sản pham PCR phương pháp điện di gel agarose

2

12

cả mẫu sản phẩm PCR bệnh nhân bị cắt thành đoạn DNA 220 bp 21 bp, chứng íỏ mẫu bệnh nhân nghiên cứu không mang đột bien G8363A

Hiện có nhiều phương pháp áp dụng để phát có mặt đọt biến gen ty thể PCR-RFLP, SSCP, xác định írỉnh tự gen, DGGE, real time PCR Tuy nhiên, PCR-RFLP kỹ thuật phân tử đơn giản, hiệu quả, phù hợp cho việc sang lọc thông dụng iượng mẫu lớn Trương Thị Huệ tập thể nghiên cứu 106 bệnh nhân Việt Nam, không phát bệnh nhân mang đột biến A8344G T8356C Trên íhế giới có nhiều công bố sàng lọc đột biến A8344G bệnh nhân não ty thể với kết quà đáng ý nahiên cứu Qi cộng điều tra đột biến gen ty the 552 bệnh nhân Trung Quốc, phát bệnh nhân mang đột biến A8344G (chiềm 0,72%); Cũng nghiên cứu khác 124 bệnh nhân Trung Quốc, Zhang cộng phát bệnh nhân mang đột biến A8344G (1,61%); Kwon tập thể, nghiên cứu đột biến gen ty thể 65 bệnh nhân Hàn Quốc, phát trường hợp mang đột biến A8344G (4,6%) Như vậy, thấy tần suầt phát đột biến A8344G nghiên cứu ỉà khác Theo chúng tơi, khác Hên quan nhiều đến cách lấy mẫu điều tra ban đầu cịn ngun nhân khác cần íàm rỗ

3 Xây dựng đường chuẩn để định lượng đột biến A8344G bẫng kỹ th u ậ t real-time PCR

3.1 Thiết kế mẫu dò huỳnh quang Taqman LNA Việc íhiếí kế mồi cho real-time PCR dùng Taqmarì probe thực theo nguyên tắc ihiết kế mồi chung cho PCR Đột biến điểm A8344G (MERRF) nghiên cứu định lượng kỹ thuật real-time PCR sử dụng mẫu dổ Taqman khóa câu methyl

Bảng: Trình tự cùa mẫu dò dùng cho real-time PCR

Mẩu dò/Mồi Trỉnh tự Vị trí DNA ty thể RT8344-FW 5' AGC CCA CTG TAA AGC

TAAC3’ 8291 -8309

RT8344-RV 5’ GGC ATT TCA CTG TAA

AGA GGT 3’ 8370-8350

Wt-8344A-FAM

6

MÍ-8344G-HEX HEX-GAT +TA+A +GAG +A+GC C-IBFQ 8333 - 8346 Ghi chú: dau + ch? nucleotide LNA

3.2 Đánh giâ tính đặc hiệu mẫu dị đột biến A8344G

(4)

3.3 Xây dụng đường chuẩn đánh giá độ tin cậy phường pháp real-time PCR để đĩnh lừợng đột biến A8344G

Để xây dựng đường chuẩn đoạn gen mang đột biến A8344G thuộc hội chứng MERRF bang real-time PCR, píasmid mang DNA đột biến khơng đột biến A8344G pha lỗng nịng độ ià X

1010

10

dùng cho thí nghiệm Sử dụng khn ià hỗn hợp plasmid đột biến không đột biến theo tỷ íệ 1:1 có nồng độ 5x107 - 5x102 sao/ịil

Kết qua phân tích real-time PCR cho thấy đường chuẩn DNA không mang đột biến DNA mang đột biến, tạo việc sư dụng tỷ lệ nồng độ khác plasmid chứa đoạn gen ty thể mang đột biến A8344G không mang đột biến có độ tuyến tính cao, giá trị cùa hệ số tương quan R2 sổ DNA ty thề số chu kỳ ngưỡng với mẫu dò w t- 8344A-FAM (không mang đột biến) ià 0,999 Mt- 8344G-HEX (mang đột biên) íà 0,999, hiệu PCR nằm khoảng 94-100% Slope probe w t- 8344A-FAM -3,458, probe MÍ-8344G-HEX -3,317

Nhằm kiểm tra độ nhạy độ tin cậy phương pháp chủng tiến hành xây dựng đường chuẩn ty lệ đột biến cách pha mẫu chuẩn có tỷ lệ đột biến iả

0

01

100

tính phần trăm ty lẹ độ biền thực te lỉ thuyết

0

1

2012

3.4 Thử nghiệm khả phát định lượng đột biến A8344G

Trong 312 mẫu bệnh phẫm sàng lọc phương pháp PCR-RFLP, không phát trường hợp mang đột biến A8344G Để khẳng định thêm kết nàỹ chủng lựa chọn ngẫu nhiên mẫu bệnh phẩm (kí hiệu BN1, BN2, BN3, BN4, BN5) thử nghiệm phương pháp real time PCR thiet lập

Kết định lượng cho thấy mẫu bệnh phẩm thử nghiệm thu tín hiệu FAM, tín hiệu khơng đột biển tin hiệu HEX ià tín hiệu đột biến không phát Đường chuẩn xây dựng có độ tuyến tỉnh cao (R2 > 0,995) Thí nghiệm lặp lại lần cho kết giống Vì chúng tồi lần khẳng định mẫu bệnh phẩm không mang đột biến A8344G, phù hợp kết hai phương pháp PCR-RFLP real-time PCR sử dụng mẫu dò huỳnh

quang LNA

4 Sàng lọc đột biến gen thuộc hội chứng MERRF phương pháp giải trình tự trực tiếp

Đề lan khằng đỉnh kết qua nghiên cứu PCR-RFLP íà xác lựa chọn 29 mẫu bệnh nhân nghi ngờ mắc hội chửng MERRF với triệu chứng rõ nhat ổể giải trình tự đoạn gen 8155 - 9292 thuộc vùng đột biến

Đoạn gen ty thể 8155 - 9292 dài 1137 bp cùa 29 bệnh nhân nghi bị MERRF nhân gen từ phản ứng PCR với khuôn mẫu DNA bệnh phẩm nhân lên PCR giải trình tự nucleotide sử dụng mồi theo cồ hai chiều Kết phân tích trình tự thu cho thấy khơng có trường hợp mang đột biến Ấ8344G, T8356C G8363A cùa hội chứng MERRF Như vậy, kết xác định trinh tự rnột lần khẳng định kết phân tích PCR-RFLP íà xác đáng tin cậy

KẾT LUẬN

Đã sàng lọc đột biến thuộc hội chứng MERRF, írên bệnh nhân nghi mắc bệnh ty thể (312 bệnh nhân đột biến A8344G 182 bệnh nhân đột biển T8356C G8363A) phương pháp PCR- RFLP nhưnp không phát trường hợp mang đột bien

Đã thiết kể thành cơng mẫu dị Taqman mang nucleotide dạng khỏa cầu methyi thiết lập điều kiện để phân tích định lượng đột biến A8344G cùa hội chứng MERRF real-time PCR vởi giới hạn phát đến 0,1% với độ tin cậy cao (hệ số R2 = 0,997)

Đã giải trình tự trực tiếp đoạn gen ty thể 8155 - 9292 (1137 bp) 29 mẫu bệnh nhân số bệnh nhân có biểu bệnh íhần kinh cho kết âm tính đột biến A8344G, T8356C, G8363A PCR-RFLP tái khẳng định íất bệnh nhân không mang đột biến vừa nêu

KIẾN NGHỊ

Tiếp tục sàng lọc để phát đột biến MERRF trên bệnh nhân nghi mac bệnh thần kinh, não Việt Nam

Xâỵ dựng phương pháp phát hiện, định lượng đột biến gen ty thể khác nham hỗ trợ việc chần đoán lâm sàng nghiên cứu mối liên quan mức độ biểu bệnh với tỷ !ệ đột biến

TÀI LIỆÙ THAM KHẢO

1 Blakêly L E., Alston L c., Lecky B., Chakrabart B-, Falkous G Turnbull M D., Taylor w R., Gorman s G (2014), “Distal weakness with respiratory insufficiency caused by the m.8344A > G "MERRF" mutation”, Science Direct, 24, pp 533-536

2

s s.,

H., Kim S., Lee S H.,Ha c K.,Ahn M Y., Jeon B s

(5)

803-881

4 Qi Y., Zhang Y.,W ang z., Yang Y., Yuan Y., Niu S., Pei P., Wang

s.,

5 Szuhai K., Ouweiand J M., Dirks R w , Lemaĩtre M., Truffert J c., Janssen J M., Tanke H J., Holme E., Maassen J A., Raap A K (2001), “Simultaneous A8344G heteroplasmy and mitochondrial DNA copy number quantification in Myoclonus Epilepsy and Ragged- Red Fibers (MERRF) syndrome by a multiplex Molecular Beacon based reai-time fluorescence PCR , Nucleic Acids Research, 29(3), pp 1-6

6

V A., Phan T N (2014), “Screening of common point- mutations and discovery of new T14727C change in mitochondrial genome of Vietnamese encephaiomyớpaihy patients”, Mitochondrial DNA, 27, pp 441-448

7 Virgilio R., Ronchi D., Bordoni A., Fassone E., Bonato

s.,

c

M.,

8

NGHIÊN CỨU CHÁN ĐOÁN DI TRUYỀN

TRƯỚC CHUYẺN PHÔI BỆNH TEO c TỦY

Ths Nguyễn Thị Thanh Nga (Bộ môn Sinh học D i truyền Yhọc, Học viện Quânỵ)

' sv Trần Van Tuấn, SV Đồng Phú cấ u

(Sinh viên năm thứ hai, Học viện Quân y) BS Đào Hải Yên (Bênh viện Than khoáng sản) Hướng dắn: PGS.TS Trần Văn Khoa (Bộ môn Sinh học Di truyền Y học, Học viện Quân y) TÓM TẲT

Đặt vấn đề: Bệnh teo tủy bệnh thần kinh ơo bị đồng hợp exon gen SMNt nhiễm sắc thể số 5 Trẻ bị bệnh' teo tủy thường có tiên luựng xấu từ vong sơm Vì vậy, vẩn đề phịng tránh chủ động bệnh teo tủy phải ưu tiên hàng đầu Mục tiêu: mục tiêu nghiên cứu xây dựng quy trình chẩn đốn di truyền trước chuyền phơi bệnh teo tủy Đối tượng phương pháp nghiên cưu: 17 bệnh nhi chần đoán bị bệnh teo tủy đồng hợp tử exon gen SMNt va bố mẹ họ; 30 mẫu té bào phơi sính thiết từ phơi dư ngày 3; 04 gia ơình sinh bị bệnh SMA tự nguyện tham gia chẩn đôn di truyền trước chuyền phơi bệnh teo tủy Kỹ thuật PCR- RFLP minisequencing đế phát đột biến gen SMNt gây bệnh teo tủy Phương phâp nhân toàn bộ gen nhằm khuếch đại gen lên hàng nghìn lần Kết quả: Kỹ thuật PCR- RFLP chuẩn hóa để phát đột biến gen SMNt từ mấu toàn phần với hiệu suất la 100% Kỹ thuật có hiệu nhân exon gen SMNt từ tế bào phôi sinh thiết 93,33% Xây dựng đuực quỵ trình chẩn đốn di truyền trước chuyển phôi bệnh teo tủy kết hợp sử dụng hai kỹ thuật PCR-RFLP va minisequencing Áp dụng quy trình xây dựng 04 cặp vợ chồng tự nguyện tham gia chẩn đoàn di truyền bệnh teo tủy trước chuyển phơi có 03 phơi chuyển, cặp vợ chồng sinh em bé khỏe mạnh, cặp mang thai Kết luận: Lần Việt Nam, xây dựng áp dụng được quy trình chần ổoốn di truyền trước chuyển phôi bệnh teo tủy cách s dụng đồng thời hai kỹ thuật PCR-RFLP minisequencing.

Từ khóa: Bệnh teo tủy.

SUMMARY

PREIMPLANTATION GENETIC DIAGNOSIS OF SPINAL MUSCULAR ATROPHY