Nghiên cứu này được tiến hành nhắm mục đích lựa chọnpH thích hợp và phương thức bổ sung M gC03 trong quá trình niioi cấy vi khuân Lactobacillus acidophillus đề đi[r]
(1)trị thấp nhiều so với liều độc nên dược liệu xem an tồn nghiên cứu tiểp íheo triển vọng phát triền thành thuốc
KẾT LUẠN
Cao chiết phân đoạn cửa Mán đỉa (Archidendron clypearía, họ Mimosaceae)
nohiên cứu tài'- riụng r.hống nỵv hrtg ị n ụ ị t m Kốt nnả cao chiết phân đoạn ethyi acetat thể hoạt tính mạnh với giá trị ED50 0,63 Mg/ml Từ phân đoạn ethyl aceíat đa chiết xuat phân lập, xác định cấu trúc ổược hợp chất tinh khiết bao gồm Daucosterol, Methyl galiate, Quercetin-3-O-a-rhamnopyranosid, 7- O-Gailoytricetiflavan, 1-octacosanol acid docosenoic Methyl galỉate, Quercetin-3-O-a- rhamnopyranosid, 7-0-Galloricetiflavan có íác dụng chống oxy hóa thử nghiệm in vitro, 7-0- Galloytricetiflavan thể tác dụng mạnh với ED50- 1,02 pg/ml Cao chiết eíhyl aceíat liều 500 1000 mg/kg/ngày íhề rõ tác dụng bảo vệ gan íiều 2000 mg/kg/ngày có tác dụng bảo vệ gan tương đương với Silymarin
TAI LIỆU THAM KHẢO
1 Nguỳễn Thị Hoài (2012-2013), Nghiên cứu cấc cây thuốc đồng bào Pako Vân Kiều Miền Trung theo hướng tác dụng chống oxy hóa, diệt tế bào ung
thư, Đề tài cấp Bộ GD&ĐT.
2 Viện đừợc iiệu (2006), Phương phấp nghiên cứu tâc dụng dược lý thuốc từ thảo dược, NXB Khoa học va kỹ thuật, ír 171 -183, tr 279-292
3 Burdon R H, (1993,), Carcinogenesis and Free Radicals, In Free Radicals: from basis science to medicine, molecular and cs!! biology updates, Basel, pp.187-193
4 Collins A R (2005), “Assays for oxidatives stress an antioxidant status: application research into the biological effectiveness of polyphenol”, Am J Clin
Nutr, 81, pp.261-267 _
5 Gupta R Sbarma M., Lakshmy R., Prabhaharan D., Reddy K s (2009), Improved method of total antioxidant assay”, Indian J Biochem Biophys., 46, pp.126-129
6 Haimin c., Xiaojun Y., Peng Z-, Jing L (2006), "Antioxidant activity and hepatoprotective potential of agaro-oiigosaccharides invitro and invivo", Nutrition Journal, 5(31).
7 Zacurazi Facurazi s., Hairuszah I., Nanthini u (2008), "Moringa oleifera Lam prevents acetaminophen induced liver through restoration of glutathione level”, Food Chem Toxicol, 46(8), pp.2611-2615
NGHIÊN c ứ u LÊN MEN LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS ĐẺ SẢN XUÁT MAGNESI LACTAT
Ths Nguyễn Minh Ngọc (Trường Cao đẳng Dược Hải Dương) Ts Nguyễn Thị Hường (Trường Cao đẳng Dược Hải Dương) Ts Đàm Thanh Xuân (Trường Đại học Dược Hà Nội) ĐẶT VẮN ĐỀ
Magnesi nguyên tố đa lượng vai trò thiết yếu thể, thiếu Magnesi dẫn đến thay đổi sinh hóa triệu chứng nghiêm trọng, liên quan đến bệnh bệnh tim mạch, loãng xương bệnh hen suyễn Các dạng Magnesi vồ có sinh khả dụng thấp đạng muối Magnesi hữu có Magnesi íactai Magnesi íactat cịn sư dụng làm nguyên liệu sản xuất Caici lacỉat, axit lactic, nhựa sinh học polylactic Sản xuất Magnesi lactat cách lền men vi khuẩn lactic íừ nguồn nguyên liệu hỵdratcarbon bổ sung M gC03vào môi trường nuôi cay íà hướng nghiên cứu quan tâm [1J Nghiên cứu tiến hành nhắm mục đích lựa chọnpH thích hợp phương thức bổ sung M gC03 trình niioi cấy vi khuân Lactobacillus acidophillus đề điều chế Magnesi lactat, đồng thời kiểm tra tiêu chuẩn, định tínhT định iuợng sản phẩm Magnesì lactat tạo thành
ĐÓI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN u
1 Đối tứợng nghiên cứu
Chùng Lactobacillus acidophillus ATCC 4356 Mơi trường MRS có bổ sung sữa bột, MgC03, Magnesi lactat nguyên liệu số hóa chat đạt tiêu chùẳn phân tích
Thiềt bị đo phổ hồng ngoại, phổ cộng hường từ hạt nhân1H-NMR Bruker AV500 (Phòng NMR Viện Hóa
học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam), máy đo phổ khối lượng (MS) LCMS - 2010EV (Shimadzu) phịng Thí nghiệm Hố vậí liệu - Khoa Hố học - Trường ĐHKHTN - ĐHQGHN ‘
2 Phương pháp nuôi cấy vi sinh vậ t thu Magnesi lactat
Nuôi cấy Lactobacillus acidophillusở 37°c kiện vi hiếu khí 100ml mơi trường MRS có bồ sung sữa bộí[6], MgC03 Sau 96h, đun cách thủy dịch lên men írong 20 phút Ly tâm 4.000 vịng/phút vịng 15 phút, lọc nóng, ỉhu dịch Cơ cách íhủy cịn 30% thể tích Để kết tỉnh lạnh - 10°c, 12h tủ iạnh Thu tinh thể, rửa lần nước cất đe lạnh Dịch rửa tiếp đến cịn 30% thể tích, để kết tinh lạnh qua đêm c sấy tinh thể thu nhiệt độ 40°c 24h thu sản phẩm thô Hàm lượng Magnesi lactat sản phẩm thô (q) xác định theophương pháp complexon [2].TÍnh hiệii suất tạo sản phẩm Magnesi lactat theo cơng íhức:
m q.n00-h).i80.lQ 0% (a-b).238,45
Trong đó: H: hiệu suất (%),
(2)a: nồng độ glucose ban đầu (%)
b: nồng độ glucose kết thúc lên men (%) h: hàm ẩm Magnesi lactat (%)
3 Phương pháp tin h chế, xác định cấu trúc Magnesỉ lacỉaỉ
* Hịa tan Magnesi lacỉat thơ nước cấí (tỷ lệ 1:6) cho tan hết, thêm ỉhan hoạt, đun tiếp 15 phút, lọc ỉhu dịch Để kết tinh nhiệt độ phịng 24 giờ, lọc íhu tinh thể, sấy nhiệt đọ 40ỏc đến khối lượng khơng đồi Định tính Magnesi lacíat theo phương pháp SKLM theo DĐVN IV [2]
» Cấu trúc cua sản phẩm Magnesỉ iacíat sinh tổng hợp xác định phương pháp phổ: Pho hòng ngoại (IR), phổ khối lượng phân ỉử (ESl-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR).Phổ IR ghi ỉrên máy Shimadzu vùng 4000 - 400 cm'1 Phồ MS ghi ỉheo phương pháp ESI (ỉon âm) máy Shimadzu LCMS dung môi Methanol Phổ 1H-NMR ghi D20 máy Brucker Av - 500 MHz, chất chuẩn ỉeiramethylsilan
4 Phương pháp kiểm nghiệm
• Sản phẩm tinh chế kiểm tra chất lượng íheo chuyên luận Magnesi iactaí Dược điến Anh BP 2010 [3],
5 Phương pháp xác định m ật độ vỉ sinh vật theo nguyên tắc đo độ đục ODeoo[7]
Ly tâm 10ml dịch ien men sau 24h (4.000 vòng/phút 15 phút), thu sinh khối Rửa sinh khối nước muối sinh lý Thêm nước muối sinh lý vào sinh khối cho đủ 10ml írong ly tâm Vortex cho phân tán Tiến hành pha loãng mẫu với hệ số pha loãng khác đo giá trị OD600tương ứng với hệ số pha lỗng Độ đục ODgoo tỷ lệ thuận với mật độ vi sinh vật có dịch ni cấy
KẾT QUẢ
, 1 Lựa chọn pH thích hợp cho q trình ni
cấy L acidophilus
Ni cấy L acidophiìlus mơi trường MRS có bổ sung 2,6% sữa với pH ihay đổi từ 3,5 đến 8,0 (Chỉnh pH môi trường nuôi cấy dung dịch HCI 3N) Sau thời gian 24h xác định mậỉ độ tế báo vi sinh vật qua giá trị độ đục ODeoo cùa dịch nuôi cấy bước sóng 600nm Kết biến thiên mật độ tế bào vi sinh vật dịch nuôi cấy sau 24h (thể ODeoo dịch ni cấy) íheo pH dịch !ên men thể hiện hình 1.
Hình Biến thiên mật độ vi sinh vật (ODeoo) theo pH môi trường nuôi cấy
Kết hình cho thấy giá trị ODeoo sau 24h nuôi cấy môi trường CO pH ỉừ 5,5 đến 8,0 cao môi trường có pH từ 3,5 đến 5,0 Do mật độ vi
sinh vật íỷ lệ thuận với mật độ quang ODeoo khoảng độ pha loãng vi sinh vật phù h ợ p m nên sơ kết luận rằna vi sinh vật phát trien tốt íại khoảng pH từ 5,5 đen 8,0 ODeoo đạt giá trị cao ỉại pH = 6,0 Vì giá ỉrị pH = 6,0 iựa chọn cho thí nghiệm
2 Lựa chọn cách bổ sung Magnesicarbonat
vào môi trường nuôỉ cấy L acidoph iilu s
Nuôi cấy L acidophillusATCỔ 4356 mơi trường MRS có 2,6% sữa bộỉ, bồ sung MgC03vào môi trường nuôi cấy Lacidophillus theo hai phương pháp: 1) Thêm M aC03 vào môi trường nuôi cấy thời điểm ban đau; 2) Bổ sung dần M gC03 đề tri pH 6,0 vào thời điểm sau 24h Lượng M gC03 thêm M gC03 vào môi trường nuôi cấy thời điểm ban đầu 2,0g - tương đương với tồng lượng M gC03 bổ sung dần Sau thời gian 96h thu sản phấm Kếì qua tính tổng lượng MgCỐ3 sử dụng, hiệu suất tạo sản phểm Magnesi lactat thơ hàm lượng Magnesi lact trong sản phẩm thơ írinh bày bảng 1.
Bảng Tổng lượng M gC03 sư dụng, hiệu suất tạo Magnesi lactat hàm lượng Magnesi lactat sẩn phạm thô thay đổi cách bổ sung M gC03 vào môi
Thống số
Cách bổ sunq MqCOs Thời ổiêm ban
đầu
Sau moi 24h
Lượng MgC03 sử dụng
<g)
2,0± 0,2 2,2 ±0,3
Hiệu suất (%) 22,1 ±1,6 67,9 ±2,6
Hàm lượng Magnesi lactat {%)
91,0 ±2,5 98,7 ±3,1
ĩ
ổương vởitổng ỉưựng M gC03 bổ sung (khoảng 2g), sau 96h hàm lượng Magnesĩ lactat sản p h im thô hai phương pháp đạt 90% Tuy nhiên hiệu suất íạo Magnesi lactaí phương pháp bổ sung M gC03 lớn hiệu suấỉ phương pháp cho M gC 03 vào môi trường nuôi cấy từ đầu có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) _
3 Đ ịnh tinh Magnesi iacỉat sắc ký lớp
mỏng
San phầm sau tinh chế định tính sắc ký lớp mỏrìỊp theo chuyên luận nêu Duợc điển Việt Nam IV [2], Ket cho thấy vết thu írên sắc ký đồ dung dịch thử tương ứng vị trí, màu sắc giá trị RfVỚi vết sắc ký đồ dung dịch chuần (Rị = 0,67)v
4 Xác định cấu trú c
• Kết phân tích cấu trúc sản phầm Magnesi lactat ihu đừợc từ môi trường nuôi cấy phổ IR, 1H- NMR MS thể (phụ lục 1,2,3): IR (KBr), Umax (em'1): 1610 (C O ), 1184 1128 (C-O) ESI-MS, m/z: 200.90 ([M-H]') H-NMR (500 MHz, D20 ), ổ (ppm): 1,28 (6H, 2s, 2CH3), 4,09 (2H, 2q, J = 7,0 Hz, CH)
(3)tương ứng với cấu trúc ngậm phân tử nước Magrtesí lactat dỉhydrat[3]
6 Kiềm nghiệm sản phẩm Magnesi lactat.
Sản phẩm kiểm tra đạt yêu cầu tiêu chí thử theo dược điển Anh BP 2010 (phụ lục 4)
Dựa vào kết thu số nghiên
*1 Iir I í Ầ m I I I Ằ • « # k U Ắ (\ Am l U i a a » ! I n n ỉ i i t ỉ _ _l _
luận sau:
BÀN LUẬN
1 về định tính sản phẩm Magnesi lactat sinh
tổng hợp
Khi nuồi cấy chủng vi khuẩn Lactobacillus acidophillus ATCC 4356 mơi trường MRS có bổ sung MgC03 có íhề thu Magnesi lactat Sản phẩm sau tinh chế tinh thề co màu trắng, hình kim (ảnh tinh thể - hình 2), kếí phù hợp với nghiên cứu J V Krrieken(2005) cơng’ bố[5] Kết định tính Magnesi lactat thu bẵng sắc ký tóp mỏng [2] cho thấy vểí chinh thu sắc kỷ đồ dung dịch thử tương ứng vị trí, màu sắc va giá trị Rf với vết í ìc ký đồ dung dịch chuẩn (Rf = 0,67)
-S i i W I n
Hình Hình ảnh tinh thể Magnesỉ lactat chụp qua kính vi quang học 10x
2 v ề cấu trúc sản phầm Magnesi lactat sinh tổng hợp
Trên phổ hồng ngoại quan sát thấy dải hấp thụ đặc trưng cua nhóm COO' 1610 (C=0), 1184 1128cm'1 (C-O) Phổ khối lượng cho pic phân tử m/z 200,9 phù hợp với công thức phân tử Magnesi lactat C6H10MgO6 (với m = 202) Phổ cộng hường íừ hạt nhân proton cho tín hiệu đặc trưng mảnh lactat: tín hiệu Doublet hydro nhóm -C H (0=1,28 ppm), tín hiệu quartet hydro nhóm -C.H- (5=4,09 ppm) Hằng số tương tác spin - spin hydro giống (J = 7,0 Hz)
Ket xác định số phân tử nước sản phẩm cho thấy cấu trúc sồn phầm chứa phân tử nước
Từ phân tích khắng định sân phầm thu la Magnesi íactat dihydrat co cơng thức cấu tạo sau:
0 h20
' ° M g + - 1
h20 ° T ^ o h
0
HO
Kết kiểm nghiệm cho thấy sần phẩm đạt tiêu chuẩn chất lượng dược điển Anh (BP 2010) [3], Trong trinh lên men sau tinh chế khơng có tạp hữu khác axit lactic, axit acetic, axit formic, ethanol - sản phẩm phụ trình lên men, điều chứng tỏ chùng Lactobacillus
í / / í *y*v A T z* ' A o C ỡ Ị £ d —> _ £ J ** ì " « _ 1 *
phấm chủ yếu ià acid lactic, kết hợp với Magnesi carbonat có môi trường nuôi cấy để tạo thánh Magnesi lactat Đă tìm qui trình lên men thu sản phẫm íinh khiết đơn giản, dễ thực hiện, áp dụng để sản xuẩt nguyên liệu giá rẻ dùng công nghiệq Y tế
3 về điều kiện lên men sinh tổng hợp Magnesỉ
lactat.
Kết nghiên cứu pH thích hợp cho q trình rtuồi cấy cho thấy với mơi trường MRS có bổ sung sữa, pH tri = 6,0, sau 24h nuôi cấy mật độ vi sinh vật dịch nuôi cấy đạỉ giá trị cao Điều phù hợp với nghiên cứu cống bố sinh lý của L acidophilus cho thầy pH 6,0 thích hợp cho trinh phát triển vồ sinh tổng hợp acid lactic [4] Bản chất cùa L acidophilus vi khuẩn sinh acid lacỉic nên môi trường ni cấy có pH írung tính kiềm (pH = 7,0 - 8,5) thỉ acid lactic vi sinh vật sinh làm giảm dần pH cùa môi trường tác động đến khả sinh ìrưởng tế bào Trường hợp mơỉ trường ni cấy có pH acid (< 5) acid lactic sinh làm pH môi trường acid tác động bất lợi đến khả sinh trưởng tế bào, lồm giảm mạnh mật độ tế bào
Kết so sánh hai phương pháp bổ sung MgC03ngay thời điểm ban đầu sau 24h nuồi cấy (duy trì pH 6) cho thắy phương pháp bổ sung dần MgC03 cho hỉệusuất thu san phẩm cao hơn, đạt tới 67,9% hiệusuất thu Magnesi lactat bổ sung MgCỐ3 thời điểm ban đầu chì đạt 22,1% Kết phù hợp với nghiên cứu cồng bố [1], [5] Tuy MgC03 không tan dung dịch nước lại tạo pH kiểm Bổ sung lượng lớn MgC03 vào môi trường nuôi cáy thời điểm ban đầu tạo pH kiềm điều kiện bất lợi cho vi sinh vật tạo acid lactic, bổ sung dần M gC03vừa không tạo pH kiềm, tạo điều kiện thuận lợi cho trình sinh acid iactic vi khuần, đồng íhời lượng acid lactic sinh iàm giảm pH môi trường lại phản ứng với MgCÕ3 mớibồ sung vào dễ tạo ổn định pH trình ni cấy
KẾT LUẬN
(4)và bổ sung dần Magnesi carbonat vào thời điểm sau 24h lên men; hiệu suất tạo Magnesi lacíat với môi trường MRS bồ sung 2,6% sữa 67,9%
TÀI LIỄU THAM KHAO
1 P J M Baets (2013), "Process for the fermentative production of lactic acid from a pianỉ extract the presence of a caustic magnesium salt” WIPO Patent Application, EP2604696 A1
2 Bộ Y Tế (2012), Dược điển việt Nam IV, tr 375. British Pharmacopoeia Commission (BPC) (2010), Bristish Phaunacopedia, pp 1325
4 A M Eyal, p R Gruber, p McWilliams and D R Witkze, (1998), A process for the recovery of lactic acid, PCT Int, Appl, (Cargill incorporated USA) 26 pp.
5 J V Krrieken, R Otto, G N Nanninga, J j De Vries (2005), "Process for the preparation of lactic acid or lactate from a magnesium lactate comprising medium", United States Patent Office,u s 7705180 B2
6 Đàm Thanh Xuân, Lê Ngọc Khánh, Lê Thị Thu Hiền (2012) Nghiên cứu sử dụng tế bào vi khuần L acidophilus cố định chất mang alginaỉ lên men sản xuất calci iactat Tạp chí Hóa học, 50 (50A) pp117-121
7 F Widdei (2010), "Theory and Measurement of Bacterial Growth", Grvndpraktikum Mikrobiologie, Sem (BSc), Universitat Bremen, pp 4-11.
Phụ lục
Mg£.-D20-lí!
¥ t r ™
0SH1MAOZU
;£iil ™ty,gi*v/!CU m ' ' 'mì' ‘ “ m" ' ')í^ J
Phụ lục Phổ hồng ngoại sản phẩm
■rỉ\sỳ
Phụ lục Phổ khối lượng MS sản phâm
Phụ lục Phổ cộng hường từ hat nhân proton sản phầm
, cực QUÂN V CỘNG HÒA XÀ.ilộl Cilú NGHĨA VIỆT NAM vẰmMrniiKiBvrtcmvNix')!
IB-Trán HiMTSng-HS Nội ĐT: 009555071.- 069553105
PIHẾỤ KIỂM NGHIỆM
(Kèi Qktỉlỉrh '«! «‘ifn<tlh()
SỐKN: 1SN-ŨỈ
Mâu để kiểm nxhiệm: MACNKSIUM LACTATE DiIIYDRA TE
iVn/ sàn xì: Bộ mơn Cống njjliiip Duọc-Dịì i lục Dược I lồ Nội
Sá lô; SSX: hạn đùng: Klùmj.cú SÍĐKSX; Khơng «ỏ
Nịịuờì rà mágiií m áu: Nguyen Miĩiíi Học in.iC I!à Nội Ngái nhận mẫu: 21/10/2014 Kgttùi Ithệit mâu: !)S Vưungllửu QuJn
Yỉu cảu k tm nghiệm.' Kídm lr.1 clitị lưựHg
nứtheo: ÌÌR20I0 ịị
T in h Irọng m ấu th i Iiliiịn I'd k h i n iỡ m é n ip l m g t lí k ìỉ iu ttịihiiịiừl
Màn dóng trọng lúi Itiiun kill Nirâi rị rÌMg |r~ Y ẩ ĩỉc A Íi ” ™ “ " Ĩ C T \ \
1 Ttiili chái: iiội kei tinh líiing gỉỉi 'rihir ĩtỉĩig Dệ lan; Tan nirốc, liì lan Irong nước sủi II
lan Uong Kihaiiol %% -V tíịnli líitli: ■ Kíiàii ủng cùa ion Lacliii
- Pháiiú^ửrkmyíltíiái
4 Cóc p!(íj) lliír S : \ \ - Bị ironạ & rail! sắỉ^iíìts'Hichì livw
• C^ísỉUỈỊỊỊipiu
- sãl.tQ prill l ì ■ Kim ÌKỊĨĩìỷtigỵĩŨ ppírt
s Mái filioiwjiig liu lỉim khù: Từ RO-17,0%
6 lỉịnhlMợngiHimlin.mgMagncsi líictat (C6H!3MgOs)lừ
98.9-102,%, tinh ihcochố plàm tlíĩ làm kliỏ Đạt <98,25%)
KếUtiỊn; Máu kiíin tea đạt yiucấiciiciisuchidií Ihừiheo BP2010
Ha »ÍJJỈ 07 liuiii'i l ì nám WIJ , " ciìỉyi.n ố c
Ii0w;
'muNG
Phục lục Phiếu kiểm nghiệm sản phẩm