HOẠT TÍNH TRAO ĐỔI MẠCH DNA VÀ BẮT CẶP DNA CỦA CshA TỪ VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS PHỤ THUỘC C-TERMINUS

Kết quả điện di trên gel agarose trong phản ứng kiểm tra khả năng liên kết với cơ chất mạch đơn DNA của CshA và CshA-CTE cho thấy sau khi loại bỏ phần C-terminus, khả năng liên kết vớ[r]

Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, Số 39B, 2019 HOẠT TÍNH TRAO ĐỔI MẠCH DNA VÀ BẮT CẶP DNA CỦA CshA TỪ VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS PHỤ THUỘC C-TERMINUS PHẠM TẤN VIỆT, NGUYỄN THỊ DIỆU HẠNH Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Trường Đại học Công Nghiệp Tp Hồ Chí Minh, nguyenthidieuhanh@iuh.edu.vn Tóm tắt Protein DEAD-box CshA có vai trị quan trọng hoạt động biểu gen tế bào Chức domain protein DEAD-box cần nghiên cứu để hiểu rõ hoạt động protein Trong nghiên cứu này, protein tái tổ hợp CshA CshA-CTE (loại bỏ C-terminus) tinh kiểm tra hoạt tính khả hình thành liên kết với chất DNA mạch đơn mạch đơi Các hoạt tính trao đổi mạch DNA bắt cặp DNA điều kiện có khơng có diện ATP xác định CshA thể hoạt tính liên kết với chất DNA theo phương thức không phụ thuộc vào ATP, CshA-CTE thể lực liên kết thấp không chặt chẽ với chất mạch đơn mạch đôi DNA Sự loại bỏ C-terminus CshA làm hoạt tính trao đổi mạch DNA hoạt tính bắt cặp DNA CshA Như vậy, C-terminus đóng vai trị quan trọng việc gia tăng lực liên kết với chất DNA đảm bảo hoạt tính trao đổi mạch DNA hoạt tính bắt cặp DNA CshA Từ khóa Protein DEAD-box, CshA, liên kết DNA, trao đổi mạch DNA, bắt cặp DNA DNA STRAND EXCHANGE AND DNA ANNEALING ACTIVITIES OF STAPHYLOCOCCUS AUREUS CSHA DEPEND ON C-TERMINUS Abstract DEAD-box protein CshA plays an important role in cellular gene expression activities The function of domains in the DEAD-box protein needs to be studied to get more insights into the function of this protein In this study, recombinant CshA and CshA-CTE (C-terminus truncated CshA) were purified and tested the DNA binding activity with single-stranded DNA and double-stranded DNA substrates DNA exchange and DNA annealing activities with and without the present of ATP were determined We have shown that CshA displayed DNA binding activity in an ATP-independent manner, while CshA-CTE exhibited low and non-tight binding affinity with both single and double-stranded DNA subtrates The loss of C-terminus resulted in absence of DNA exchange activity and CshA DNA annealing activity Thus, C-terminus plays an important role in increasing DNA binding affinity and DNA exchange activity as well as DNA annealing activity of CshA Key words DEAD-box Protein, CshA, DNA binding, DNA strand exchange, DNA annealing GIỚI THIỆU Protein DEAD-box họ protein lớn xếp vào nhóm RNA helicase với chứa chín motif bảo tồn có vai trị việc hình thành liên kết với RNA, hoạt tính ATPase phụ thuộc RNA, hoạt tính tháo xoắn RNA phụ thuộc ATP tham gia vào hầu hết trình hoạt động RNA, bao gồm phiên mã, ghép nối, vận chuyển RNA, sinh tổng hợp ribosome, dịch mã, phân hủy RNA [1-4] Các nghiên cứu chức protein DEAD-box thực nhiều với ghi nhận hoạt tính sinh học chức hoạt động sống tế bào Protein DEAD-box CYT-19 Neurospora crassa Mss116p Saccharomyces cerevisiae biết đến RNA chaperon thúc đẩy phân cắt intron nhóm I II ty thể kích hoạt dịch mã RNA [5, 6] DEAD-box CshA RhlB xác định thành phần RNA helicase phức hợp phân hủy RNA vi khuẩn Staphylococcus aureus Escherichia coli có vai trị quan trọng việc điều hòa phiên mã chuyên biệt để đáp ứng điều kiện môi trường [7-12] Nghiên cứu cấu trúc CshA cho thấy chế hoạt động protein © 2019 Trường Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh 202 HOẠT TÍNH TRAO ĐỔI MẠCH DNA VÀ BẮT CẶP DNA CỦA CshA TỪ VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS PHỤ THUỘC C-TERMINUS chất RNA với hình thành cấu trúc dimer liên kết với RNA thúc đẩy hoạt tính tháo xoắn RNA phụ thuộc ATP, đồng thời, phần C-terminus CshA xác định có chức gia tăng lực liên kết với chất RNA [13] Bên cạnh chức tham gia vào chế hoạt động RNA, protein DEAD-box cịn có vai trị hoạt động DNA Dbp9p, protein DEAD-box có vai trị trình sinh học ribosome nấm men, thể hoạt tính tháo xoắn DNA [14], protein DDX43 thể hoạt tính tháo xoắn hai chất DNA RNA [15], protein DEAD-box DDX1 tìm thấy nhân thường xuất vị trí DNA mạch đơi bị gãy vỡ giai đoạn đầu sửa chữa sai hỏng DNA [16] Các protein khác DHH1 MPH1 có nấm men cho thấy vai trò hệ thống sửa chữa sai hỏng gen DNA trình chép [17, 18] CshA từ S aureus thể hoạt tính chất DNA với khả liên kết chất DNA mạch đơn mạch đơi với lực khác Các hoạt tính trao đổi mạch DNA bắt cặp DNA để hình thành sản phẩm DNA mạch đôi theo phương thức không phụ thuộc ATP CshA xác nhận nghiên cứu trước [19] Tuy nhiên, chế hoạt động protein DNA mức phân tử chưa làm rõ, đó, việc nghiên cứu chức sinh học domain trình tự acid amin protein với chất DNA giúp làm sáng tỏ chế hoạt động protein tế bào Trong nghiên cứu này, tiến hành tạo dòng tinh protein CshA với việc loại bỏ phần C-terminus trình tự so sánh đặc tính khả liên kết với chất DNA, hoạt tính trao đổi mạch, bắt cặp DNA protein CshA đủ trình tự CshA khơng có C-terminus Các tính chất sinh học xác định khơng có diện domain C-terminus trình tự tiên đốn chức domain giúp làm rõ hoạt động vai trò CshA hoạt động DNA tế bào VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu 2.1.1 Tạo dòng, biểu tinh protein DEAD-box CshA CshA loại bỏ C-terminus (CshACTE) Protein DEAD-box CshA từ vi khuẩn S aureus Mu50 (NCBI accession number NP_372605.1) có chiều dài 506 acid amin tạo dịng biểu theo phương pháp trình bày nghiên cứu trước [19] Cặp mồi chuyên biệt cho CshA thiết kế theo trình tự 5′-CATATGCAAAATT TTAAAGAACTAGGG-3′ 5′-CTCGAGTTTTTGATGGTCAGCAAATG-3′ tương ứng cho mồi xuôi mồi ngược Tương tự vậy, đoạn gen mã hóa cho protein CshA loại bỏ phần C-terminus chứa trình tự acid amin 1-367 (CshA-CTE) khuếch đại phản ứng PCR (polymerase chain reaction) với cặp mồi chuyên biệt theo trình tự 5′-CATATGCAAAATTTTAAAGAACTAGGG-3′ cho mồi xuôi 5′CTCGAGACGAAGTGCACTCATTTTTCT-3′ cho mồi ngược Đoạn gen sau PCR chèn vào plasmid pET-22b (Novagen, Darmstadt, Germany) Plasmid tái tổ hợp biến nạp vào vi khuẩn E coli Rosetta (DE3) (Novagen, Darmstadt, Germany) Tế bào E coli chứa plasmid có gen ni mơi trường LB (Luria broth) có bổ sung ampicillin (50 µg/mL) nhiệt độ 37°C lắc 180 vòng/phút Chất cảm ứng IPTG (isopropyl-D-1-thiogalactopyranoside) thêm vào môi trường nuôi cấy với nồng độ cuối đạt 0,5mM để biểu protein mật độ quang bước sóng 600 nm đạt 0,6 tiếp tục nuôi ủ 16°C Các tế bào sau nuôi cấy thu nhận ly tâm Protein tái tổ hợp CshA CshACTE tinh sắc ký lực Ni2+ (GE Healthcare, Sweden), sau tiếp tục tinh phương pháp sắc ký lọc gel Superdex 75 gel filtration columns (GE Healthcare, Sweden) mô tả nghiên cứu trước Kết tinh kiểm tra gel SDS-PAGE (sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis) [20] 2.1.2 Các chất mạch đơn DNA mạch đôi DNA Các phân đoạn DNA tổng hợp phương pháp hóa học cung cấp từ cơng ty Cosmo Genetech (Seoul, Korea), trình tự phân đoạn DNA trình bày bảng Các phân đoạn đánh dấu với đồng vị phóng xạ 32P đầu 5′ enzyme T4 polynucleotide kinase (10 U, Takara, Tokyo, Japan) [-32P] ATP (3,000 Ci/mmol, GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) © 2019 Trường Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh HOẠT TÍNH TRAO ĐỔI MẠCH DNA VÀ BẮT CẶP DNA CỦA CshA TỪ VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS PHỤ THUỘC C-TERMINUS 203 trình bày nghiên cứu trước Các phân đoạn đánh dấu tinh phương pháp tách chiết phenol/chloroform kết tủa cồn lạnh [19] Các chất mạch đôi DNA chuẩn bị cách cho phản ứng bắt cặp hai mạch có trình tự bổ sung tương ứng đốt nóng 95°C phút, sau làm lạnh từ từ nhiệt độ phòng 30 phút Các chất mạch đơi DNA có cấu trúc đầu (blunt end dsDNA), đuôi 3 (3 tail dsDNA), đuôi 5 (5 tail dsDNA) chĩa ba (forked dsDNA) chuẩn bị cách cho phản ứng phân đoạn 1+2, 3+2, 1+4, 3+4 tương ứng Bảng Trình tự phân đoạn DNA sử dụng nghiên cứu Số thứ tự phân đoạn (chiều dài nucleotide) 1* (35) (35) 3* (45) (50) Trình tự (5 →3 ) TTGACTTCATGACCTATAGTGAGTCGTATTAGTCC GGACTAATACGACTCACTATAGGTCATGAAGTCAA TTGACTTCATGACCTATAGTGAGTCGTATTAGTCCTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTGGACTAATACGACTCACTATAGGTCATGAAG TCAA (*) Phân đoạn DNA đánh dấu đầu 5′-32P 2.2 Phƣơng pháp 2.2.1 Phương pháp xác định khả kết nối chất DNA Khả kết nối với chất mạch đơn mạch đôi DNA CshA CshA-CTE xác định phương pháp EMSA (Electrophoresis Mobility Shift Assay) gel agarose 1% Phản ứng thực môi trường chứa 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 25 mM NaCl, mM DTT, 0,15 mg/mL BSA với µM loại chất mạch đơn mạch đôi DNA không đánh dấu 5′-32P µM CshA/CshA-CTE mM ATP thêm vào phản ứng để xác định nhu cầu lượng CshA/CshA-CTE hoạt tính liên kết DNA Phản ứng ủ nhiệt độ phòng 10 phút Hỗn hợp sau phản ứng phân tách gel agarose 1% nhận diện khả kết nối chất cách nhuộm với SYBR Gold 30 phút, sau quan sát kết đèn UV [21] 2.2.2 Phương pháp xác định hoạt tính trao đổi mạch DNA Hoạt tính chuyển mạch DNA kiểm tra mơi trường phản ứng có chứa 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 25 mM NaCl, mM DTT, 0,15 mg/mL BSA Phản ứng thực điều kiện có khơng có mM ATP khoảng thời gian khác thích hình ảnh Các chất mạch đơi DNA (10 nM) có cấu trúc khác đánh dấu 5′-32P cho phản ứng với CshA CshA-CTE (1 M) mơi trường có chứa phân đoạn DNA mạch đơn (100 nM) không đánh dấu tương ứng (phân đoạn cho phản ứng chất mạch đôi DNA đầu mạch đôi DNA đuôi 3; phân đoạn cho phản ứng chất mạch đôi DNA đuôi 5 mạch đôi chĩa ba) Các phản ứng thực nhiệt độ phòng thời gian tương ứng ngừng dung dịch quenching buffer chứa 100 mM EDTA pH 8,0, 0,4% sodium dodecyl sulfate, 20% glycerol, 0,1% bromophenol blue, 0,1% xylene cyanol Hỗn hợp sau phản ứng kiểm tra điện di gel polyacrylamide khơng biến tính 15% (non-denaturing polyacrylamide gel-PAGE) nhận diện tín hiệu thơng qua thiết bị PhosphorImager (Packard Instrument Co., Meriden, CT, USA) Đối chứng âm (-) thực tương tự phản ứng khơng có protein Đối chứng dương (+) thực cách đốt nóng dung dịch phản ứng 95°C phút [19] 2.2.3 Phương pháp xác định hoạt tính bắt cặp DNA Hoạt tính bắt cặp DNA protein tái tổ hợp CshA CshA-CTE xác định môi trường chứa 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 25 mM NaCl, mM DTT, 0,5 mg/mL BSA, 0,1 nM phân đoạn mạch đơn DNA đánh dấu 5′-32P (phân đoạn 1), 0,25 nM phân đoạn mạch đơn DNA không đánh dấu đồng vị phospho (phân đoạn 4) Các phản ứng thực điều kiện có khơng có 0,1 M CshA/CshA-CTE khoảng thời gian 1, 2, 5, 10 phút Sau thời gian phản ứng, dung dịch © 2019 Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh 204 HOẠT TÍNH TRAO ĐỔI MẠCH DNA VÀ BẮT CẶP DNA CỦA CshA TỪ VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS PHỤ THUỘC C-TERMINUS quenching buffer phản ứng trao đổi mạch DNA thêm vào đề ngừng phản ứng Hỗn hợp phản ứng phân tách trên gel polyacrylamide khơng biến tính 15% (PAGE) sản phẩm bắt cặp dị tìm thiết bị PhosphorImager (Packard Instrument Co.) [19] 2.2.4 Phương pháp phân tích so sánh cấu trúc khơng gian chiều protein Trình tự acid amin DEAD-box CshA so sánh với trình tự protein khác chương trình NCBI Protein Blast công cụ ESPript để xác định độ tương đồng vị trí bảo tồn tương ứng Cấu trúc không gian ba chiều protein dự đốn chương trình dự đốn cấu trúc Swiss-model website www.expasy.org [22-26] Tiếp theo, cấu trúc không gian ba chiều dự đoán từ Swiss-model so sánh với cấu trúc không gian protein tương ứng thông qua chương trình PyMOL, từ đề xuất vùng hoạt động protein CshA [27] KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tinh protein DEAD-box CshA CshA- CTE Protein DEAD-box CshA vi khuẩn S aureus Mu50 dự đốn thuộc nhóm enzyme RNA helicase Các trình tự bảo tồn gen cho thấy chức tiềm tàng protein So sánh với trình tự protein khác NCBI, vùng N-terminus (acid amin 1-212) protein DEAD-box CshA chứa trình tự bảo tồn DEAD-box có chức liên kết với ATP, liên kết Mg2+ kết nối với nucleotide, trình tự bảo tồn HELIC (acid amin 213-367) dự đoán chứa hoạt tính helicase kết nối ATP, vùng C-terminus (acid amin 368-506) khơng cho thấy hoạt tính tiềm (hình 1A) Để xác định vai trị vùng C-terminus protein DEAD-box CshA, protein CshA CshA loại bỏ vùng Cterminus tạo dòng, biểu tinh trình bày phía Kết tinh protein tái tổ hợp kiểm tra gel SDS-PAGE (hình 1B 1C) Hình 1: Kết tinh protein DEAD-box CshA CshA loại bỏ C-terminus (CshA-CTE) vi khuẩn S aureus (A) Dự đoán cấu trúc chức dựa trình tự acid amin CshA xác định phần C-terminus CshA (B) (C) Kết điện di sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) 12% CshA CshA-CTE sau tinh sắc ký Ni2+ sắc ký lọc gel; Lane 1-2 phân đoạn sau tinh M thang chuẩn protein © 2019 Trường Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh HOẠT TÍNH TRAO ĐỔI MẠCH DNA VÀ BẮT CẶP DNA CỦA CshA TỪ VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS PHỤ THUỘC C-TERMINUS 205 CshA với đầy đủ trình tự 506 acid amin trọng lượng tương ứng khoảng 57 kDa CshA-CTE sau boại bỏ phần C-terminus cịn 367 acid amin có trọng lượng khoảng 41 kDa Kết sau tạo dòng, tinh kiểm tra gel SDS-PAGE, protein sau tinh thể kích thước mong đợi cho thấy sản phẩm protein tái tổ hợp tạo thành protein cần thiết Quan sát vạch điện di gel SDS-PAGE, diện vạch mong đợi không đáng kể, kiểm tra phần mềm gel analyzer, kết cho thấy độ tinh sản phẩm protein CshA đạt 98%, độ tinh CshA-CTE đạt 96% Protein tinh không chứa tạp chất hạn chế hoạt tính khơng mong muốn xuất diện phản ứng nghiên cứu Với độ tinh 96%, protein tái tổ hợp CshA CshA-CTE sử dụng cho nghiên cứu hoạt tính acid nucleic 3.2 CshA CshA- CTE có khả liên kết với chất DNA khác CshA thuộc nhóm protein DEAD-box với chức dự đốn enzyme RNA helicase, nghiên cứu trước, hoạt tính trao đổi mạch DNA bắt cặp DNA enzyme CshA ghi nhận [19] Việc liên kết với chất acid nucleic hoạt tính cần thiết cho chức enzyme Do đó, khả liên kết với chất DNA kiểm tra theo phương pháp EMSA Sau thời gian cho phản ứng với chất, hình thành phức hợp enzyme chất DNA kiểm tra gel agarose 1% (hình 2) Hình 2: Khả liên kết với loại chất DNA mạch đơn (A) mạch đôi chĩa ba DNA (B) CshA CshACTE thể qua điện di gel agarose 1% M thang chuẩn DNA; ssDNA DNA mạch đơn; dsDNA DNA mạch đôi Phức hợp tạo thành liên kết protein DNA có trọng lượng phân tử cao tốc độ di chuyển chậm so với chất DNA ban đầu, so sánh tốc độ di chuyển DNA q trình © 2019 Trường Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh 206 HOẠT TÍNH TRAO ĐỔI MẠCH DNA VÀ BẮT CẶP DNA CỦA CshA TỪ VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS PHỤ THUỘC C-TERMINUS điện di xác định khả liên kết DNA protein Kết điện di gel agarose phản ứng kiểm tra khả liên kết với chất mạch đơn DNA CshA CshA-CTE cho thấy sau loại bỏ phần C-terminus, khả liên kết với chất mạch đơn giảm rõ rệt với vạch xuất có cường độ phát sáng khơng cao, chất DNA khơng hình thành liên kết quan sát thấy phía gel điện di, CshA với đủ trình tự acid amin thể khả liên kết triệt để với phức hợp hình thành rõ ràng không quan sát thấy chất mạch đơn DNA cịn lại sau phản ứng (hình 2A) Bên cạnh đó, diện ATP khơng ảnh hưởng đến hoạt tính liên kết chất mạch đơn DNA CshA/CshA-CTE với vạch tương ứng cho phức hợp chất-DNA khơng có thay đổi điều kiện có khơng có ATP Quan sát khả liên kết với chất DNA mạch đôi, kết điện di cho thấy protein CshA CshA-CTE có khả hình thành liên kết tạo phức hợp enzymeDNA Tuy nhiên, hình thành phức hợp enzyme-DNA khơng chặt chẽ nên vạch tương ứng thể theo vệt dài, đồng thời khơng có khác biệt phản ứng có diện ATP khơng có ATP (hình 2B) Kết phù hợp kết báo cáo nghiên cứu trước với khả liên kết chất RNA không phụ thuộc vào ATP [13] hoạt tính trao đổi mạch DNA bắt cặp DNA không phụ thuộc vào lượng ATP enzyme CshA [19] Quan sát trình tự acid amin CshA, vị trí vùng liên kết với nucleotide dự đoán vùng acid amin 150-200 (hình 1A), việc loại bỏ phần C-terminus khơng ảnh hưởng đến hoạt tính liên kết với chất acid nucleic CshA Tuy nhiên, giảm lực liên kết điều kiện thử nghiệm với mạch đơn mạch đôi chĩa ba DNA CshA-CTE cho thấy khả liên kết yếu độ bền phức hợp liên kết không cao thiếu phần C-terminus trình tự protein Trong nghiên cứu cấu trúc CshA Geobacillus stearothermophilus, nhóm tác giả Jennifer Huen kiểm tra vai trò C-terminus lên khả kết nối CshA lên chất RNA mạch đơn RNA mạch đôi, kết cho thấy khả kết nối CshA giảm mạnh loại bỏ phần C-terminus cấu trúc với số liên kết CshA CshA-CTE 0,2 13,68 µM chất RNA mạch đơi, trường hợp chất mạch đơn, số liên kết 0,36 28,05 µM cho CshA cho CshA-CTE, thể tương tác C-terminus hình thành liên kết chặt chẽ với chất DNA [13] Tuy nhiên, nghiên cứu khả liên kết với chất RNA DEAD-box Mss116p Saccharomyces cerevisiae, phần C-terminus protein không ảnh hưởng đến liên kết với chất RNA dù mạch đơn hay mạch đơi có vai trị quan trọng việc kích hoạt q trình dịch mã ghép nối RNA [28], nghiên cứu với Hera-RecA thu kết tương tự với hoạt tính liên kết với RNA mạch đôi không phụ thuộc vào C-terminus [29] Vai trò C-terminus protein DEADbox việc liên kết với acid nucleic tổng hợp nghiên cứu Pavan Umate cho thấy domain vùng C-terminus Helic C họ DEAD/H có vai trò liên kết RNA tháo xoắn, domain RQC HRDC RecQ có vai trị việc hình thành liên kết Holliday sửa chữa DNA, domain HA2 DHX9/DHX36 dự đốn có vai trị việc liên kết với acid nucleic [30-32] 3.3 CshA khơng thể hoạt tính trao đổi mạch DNA loại bỏ phần C-terminus Khả kết nối với chất DNA mạch đôi CshA không bị ảnh hưởng phần C-terminus xác định, liệu phần C-terminus có ảnh hưởng đến hoạt tính trao đổi mạch DNA bắt cặp mạch DNA CshA Để kiểm tra khả này, CshA CshA-CTE kiểm tra phản ứng thí nghiệm có chứa loại chất mạch đơi DNA có cấu trúc khác với diện không mM ATP thời gian 10 phút Tương ứng với loại chất mạch đơi có đánh dấu đồng vị 5-32P, mạch đơn không đánh dấu bổ sung vào với lượng thừa (cao gấp 10 lần chất mạch đôi) nhằm quan sát sản phẩm phản ứng mạch đơn đánh dấu sau chuyển mạch Con đường phản ứng chuyển mạch mô tả sơ đồ hình ảnh thể kết điện di nhận chất phản ứng cụ thể (hình 3) © 2019 Trường Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh HOẠT TÍNH TRAO ĐỔI MẠCH DNA VÀ BẮT CẶP DNA CỦA CshA TỪ VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS PHỤ THUỘC C-TERMINUS 207 Hình 3: Hoạt tính chuyển mạch DNA CshA CshA-CTE chất DNA có cấu trúc khác nhau; mạch đôi DNA đầu - blunt end dsDNA (A), mạch đôi DNA chĩa ba - forked dsDNA (B), mạch đôi DNA đuôi 3 - 3 tail dsDNA (C) mạch đôi DNA đuôi 5 - 5 tail dsDNA (D) Phản ứng thực 10 phút, kết phân tích gel polyacrylamide khơng biến tính 15% (PAGE) Dấu cho thấy vị trí đánh dấu đồng vị 5-32P mạch DNA Con (-) đối chứng âm thực phản ứng khơng có protein; Con (+) đối chứng dương thực cách đốt nóng phản ứng 95C điều kiện phản ứng tương tự Hoạt tính trao đổi mạch CshA từ S aureus không phụ thuộc vào lượng ATP, khác biệt với hoạt tính tách mạch helicase cần phải cung cấp lượng cho phản ứng xảy Mặc dù CshA-CTE có khả liên kết với chất mạch đôi DNA kết kiểm tra sau điện di cho thấy CshACTE hoạt tính trao đổi mạch sau thời gian phản ứng 10 phút chất khác nhau, điều cho thấy phần C-terminus có vai trị quan trọng xúc tác phản ứng trao đổi mạch CshA Trong thí nghiệm khảo sát khả trao đổi mạch để hình thành sản phẩm mạch đơi DNA sơ đồ thể hình 4A, trao đổi mạch sau phản ứng hình thành sản phẩm DNA mạch đôi đuôi 3 từ chất ban đầu DNA mạch đôi chĩa ba Phản ứng kiểm tra khoảng thời gian khác từ 60 phút kiểm tra gel khơng biến tính polyacrylamide (hình 4B) © 2019 Trường Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh 208 HOẠT TÍNH TRAO ĐỔI MẠCH DNA VÀ BẮT CẶP DNA CỦA CshA TỪ VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS PHỤ THUỘC C-TERMINUS Hình 4: Hoạt tính trao đổi mạch DNA CshA CshA-CTE chất DNA mạch đôi DNA chĩa ba theo thời gian (A) Sơ đồ phản ứng hoạt tính chuyển mạch DNA chất mạch đơi DNA chĩa ba; (B) Sản phẩm phản ứng phân tích gel polyacrylamide khơng biến tính 15% (PAGE) Dấu cho thấy vị trí đánh dấu đồng vị phóng xạ mạch DNA S chất phản ứng; H phân đoạn mạch đơn đánh dấu chất; P sản phẩm mong đợi hoạt tính chuyển mạch sau phản ứng Sau khoảng thời gian phản ứng (5-60 phút), sản phẩm trao đổi mạch quan sát thấy thí nghiệm có diện CshA Trong thí nghiệm với CshA-CTE khơng có enzyme, sản phẩm phản ứng khơng có thay đổi so với chất ban đầu Sản phẩm mạch đơn không quan sát thấy sau phản ứng, cho thấy khơng có hình thành loại sản phẩm chứng minh đặc tính trao đổi mạch xảy đồng thời, khơng có diện hoạt tính tháo xoắn Mặc dù thời gian phản ứng gia tăng kết khác biệt, điều khẳng định CshA hoạt tính trao đổi mạch khơng có diện C-terminus trình tự acid amin Hoạt tính trao đổi mạch protein DEAD-box có vai trị quan trọng việc hình thành liên kết nối Holliday sửa chữa sai hỏng DNA trình chép [33] Trong nghiên cứu Michael D.Huber công sự, domain RQC HRDC C-terminus protein DEAD-box RecQ có chứa vị trí chun biệt cho hình thành liên kết Holliday, loại bỏ C-terminus trình tự CshA dẫn đến việc đánh hoạt tính trao đổi mạch DEAD-box CshA [32] 3.4 CshA hoạt tính bắt cặp DNA loại bỏ phần C-terminus Ngồi hoạt tính trao đổi mạch, Csh A cịn xác định có hoạt tính bắt cặp DNA, hình thành sản phẩm DNA mạch đôi từ mạch đơn có trình tự bổ sung Để xác định vai trị phần Cterminal, hoạt tính bắt cặp CshA-CTE kiểm tra điều kiện chứa chất mạch đơn phân đoạn phân đoạn có trình tự bổ sung Thí nghiệm thực khoảng thời gian khác phân tách sản phẩm gel khơng biến tính polyacrylamide (hình 5) Sau thời gian phản ứng, sản phẩm mạch đôi DNA quan sát thấy phản ứng có diện CshA với đủ trình tự, vắng mặt enzyme hay thiếu phần C-terminus không quan sát thấy sản phẩm mạch đơi DNA hay sản phẩm hình thành khơng đáng kể sau thời gian phản ứng Sự giảm hoạt tính bắt cặp khơng có C-terminus giải thích lực liên kết CshA-CTE chất DNA mạch đơn yếu quan sát thấy thí nghiệm khả kết nối (hình 2A), khó khăn việc hình thành liên kết với chất hạn chế việc thúc đẩy phản ứng bắt cặp xảy Do đó, CshA khơng thể khả bắt cặp DNA đoạn C-terminus trình tự Ngồi ra, nghiên cứu hoạt tính bắt cặp Mss116p, nhóm tác giả Georg Mohr quan sát thấy giảm đáng kể hoạt tính bắt cặp Mss116p loại bỏ phần C-terminus với số tốc độ phản ứng 16 x 109 M- © 2019 Trường Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh HOẠT TÍNH TRAO ĐỔI MẠCH DNA VÀ BẮT CẶP DNA CỦA CshA TỪ VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS PHỤ THUỘC C-TERMINUS 209 min-1 cho Mss116 8,4 x 109 M-1min-1 cho Mss116p loại bỏ C-terminus, kết cho thấy phần Cterminus tối đa hóa hoạt tính bắt cặp Mss116p [28] Hình 5: Hoạt tính bắt cặp mạch đơn DNA tạo sản phẩm mạch đôi DNA CshA CshA-CTE theo thời gian (A) Sơ đồ phản ứng hoạt tính bắt cặp DNA để hình thành sản phẩm mạch đôi DNA đuôi 5; (B) Sản phẩm phản ứng sau thời gian ủ khác phân tích gel polyacrylamide khơng biến tính 15% (PAGE) Dấu cho thấy vị trí đánh dấu đồng vị phóng xạ mạch DNA P sản phẩm mong đợi hoạt tính bắt cặp DNA Chương trình NCBI Protein Blast (tập trung vào việc so sánh vị trí bảo tồn) sử dụng để so sánh trình tự acid amin CshA từ S aureus với trình tự acid amin DEAD-box protein khác Kết cho thấy trình tự acid amin CshA từ S aureus tương đồng cao với trình tự acid amin CshA từ Geobacillus stearothermophilus (56,03%) Đồng thời, xác định tương đồng trình tự acid amin C-terminus CshA từ S aureus với trình tự acid amin khác ngân hàng liệu NCBI, kết cho thấy trình tự acid amin tương đồng cao với Mss116 – DEAD-box protein khác từ Saccharomyces cerevisiae (33,66%) Kết phân tích cơng cụ ESPript cho thấy đoạn acid amin bảo tồn CshA S aureus G stearothermophilus có độ trùng lập cao (hình 6A), kết tương tự phân tích tương đồng trình tự C-terminal CshA từ S aureus Mss116 từ S cerevisiae (hình 6B) [27] © 2019 Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh 210 HOẠT TÍNH TRAO ĐỔI MẠCH DNA VÀ BẮT CẶP DNA CỦA CshA TỪ VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS PHỤ THUỘC C-TERMINUS Hình 6: Mức độ tương đồng trình tự acid amin CshA từ G stearothermophilus S aureus (A) mức độ tương đồng trình tự acid amin Mss116 từ S cerevisiae CshA C-terminus từ S aureus (B) Hình 7: (A) Sự tương đồng cấu trúc CshA từ G stearothermophilus CshA từ S aureus (B) Sự tương đồng cấu trúc CshA từ G stearothermophilus CshA đoạn C-terminus từ S aureus (C) Sự tương đồng cấu trúc CshA từ G stearothermophilus Mss116 từ S cerevisiae (D) Sự tương đồng cấu trúc CshA từ G stearothermophilus, CshA đoạn C-terminus từ S aureus Mss116 từ S cerevisiae (E) Cấu trúc không gian Mss116 từ S cerevisiae với diện chất trung tâm hoạt động [13, 34] Cấu trúc không gian chiều phân tử CshA phân tử CshA đoạn C-terminus từ S aureus xây dựng theo chương trình dự đốn cấu trúc Swiss-model [22-26] Cấu trúc khơng gian dự đốn phân tử CshA phân tử CshA đoạn C-terminus từ S aureus có độ tương đồng cao với cấu trúc không gian CshA từ G stearothermophilus (PDB ID: 5ivl) (hình 7A, 7B) So sánh cấu trúc khơng © 2019 Trường Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh HOẠT TÍNH TRAO ĐỔI MẠCH DNA VÀ BẮT CẶP DNA CỦA CshA TỪ VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS PHỤ THUỘC C-TERMINUS 211 gian Mss116 từ S cerevisiae (PDB ID: 4tyw) (hình 7E) với cấu trúc khơng gian nêu trên, thấy cho thấy trung tâm hoạt động CshA hình thành phần cịn lại CshA (hình 7C, 7D) Căn cấu trúc không gian giả định CshA, loại bỏ C-terminus ức chế hình thành cấu trúc dimer cần thiết cho hoạt động xúc tác phản ứng chất acid nucleic (hình 7D) dẫn đến việc vắng mặt hoạt tính trao đổi mạch bắt cặp DNA Như vậy, C-terminus không chứa motif cần thiết cho việc hình thành liên kết với chất acid nucleic có vai trị quan trọng việc gia tăng lực liên kết, hình thành dimer thúc đẩy phản ứng sinh học CshA [13, 34] KẾT LUẬN Protein DEAD-box CshA thuộc họ RNA helicase có vai trị quan trọng nhiều hoạt động biệu gen phiên mã, dịch mã, ghép nối RNA, sửa chữa DNA, hoạt động chaperon [1] Vai trò domain trình tự acid amin protein DEAD-box có vai trò quan trọng chức chúng, việc nghiên cứu chức domain góp phần hiểu rõ hoạt động protein tế bào Hoạt tính trao đổi mạch DNA hoạt tính bắt cặp DNA CshA xác định nghiên cứu trước [19] Để xác định chức C-terminus trình tự CshA, protein tái tổ hợp CshA CshA loại bỏ C-terminus tạo dòng biểu hiện, kết tinh protein đạt 96% Các hoạt tính hình thành liên kết với chất DNA kiểm tra cho thấy giảm lực liên kết khơng có C-terminus trình tự Ngồi ra, hoạt tính trao đổi mạch DNA hoạt tính bắt cặp DNA CshA khơng quan sát thấy thí nghiệm thiếu C-terminus Dựa kết thu được, C-terminus đóng vai trị quan trọng việc hình thành liên kết chặt chẽ với chất DNA tham gia vào hoạt tính trao đổi mạch DNA hoạt tính bắt cặp DNA CshA LỜI CẢM ƠN Kết nghiên cứu thực phòng thí nghiệm Nucleic Acid Biochemistry phịng thí nghiệm Global, đại học Konkuk, Seoul, Hàn Quốc Do đó, tơi xin chân thành cảm ơn giáo sư Kang Lin-Woo giáo sư Kim Dong-Eun, tạo điều kiện thuận lợi cho thực nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO Jarmoskaite I., and Russell R., RNA helicase proteins as chaperones and remodelers Annual Review of Biochemistry, 2014 83: p 697–725 Linder P., Dead-box proteins: a family affair active and passive players in RNP-remodeling Nucleic Acids Res, 2006 34(15): p 4168-80 Rocak S., Linder P., DEAD-box proteins: the driving forces behind RNA metabolism Nat Rev Mol Cell Biol, 2004 5(3): p 232-41 de la Cruz J., Kressler D., and Linder P., Unwinding RNA in Saccharomyces cerevisiae: DEAD-box proteins and related families Trends Biochem Sci, 1999 24(5): p 192-8 Mohr S., Stryker J.M., Lambowitz A.M., A DEAD-box protein functions as an ATP-dependent RNA chaperone in group I intron splicing Cell, 2002 109: p 109:769–779 Huang H.R., Rowe C.E., Mohr S., Jiang Y., Lambowitz A.M., Perlman P.S., The splicing of yeast mitochondrial group I and group II introns requires a DEAD-box protein with RNA chaperone function Proc Natl Acad Sci USA, 2005 102: p 163–168 Roux C.M., DeMuth J.P., and Dunman P.M., Characterization of components of the Staphylococcus aureus mRNA degradosome holoenzyme-like complex J Bacteriol, 2011 193(19): p 5520-6 Jankowsky E., Methods in Enzymology- Volumn 511: RNA Helicase Academic Press, USA, 2012: p 369- 381 Giraudy C., Hausmann S., Lemeille S., Prados J., Redder P., Linder P., The C-terminal region of the RNA helicase CshA is required for the interaction with the degradosome and turnover of bulk RNA in the opportunistic pathogen Staphylococcus aureus RNA Biology, 2015 12(6): p 658-673 © 2019 Trường Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh HOẠT TÍNH TRAO ĐỔI MẠCH DNA VÀ BẮT CẶP DNA CỦA CshA TỪ VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS PHỤ THUỘC C-TERMINUS 212 10 Kaberdin V.R., Blasi U., Bacterial helicases in post-transcriptional control Biochim Biophys Acta 2013 11 1829: p 878-883 Laalami S., Zig L., and Putzer H., Initiation of mRNA decay in bacteria Cell Mol Life Sci , 2014 71: p 12 Oun S., Redder P., Didier J.P., Francois P., Corvaglia A.R., Buttazzoni E., Giraud C., Girard M., Schrenzel 1799–1828 J., and Linder P., The CshA DEAD box RNA helicase is important for quorum sensing control in 13 Staphylococcus aureus RNA Biology, 2013 10: p 157–165 Huen J., Lin C.L., Golzarroshan B., Yi W.L., Yang W.Z., Yuan H.S., Structural Insights into a Unique 14 Dimeric DEAD-Box Helicase CshA that Promotes RNA Decay Cell Press, 2017 25: p 469–481 Kikuma T., Ohtsu M., Utsugi T., Koga S., Okuhana K., Eki T., Fujimori F., Murakami Y., Dbp9p, a member 15 of the DEAD box protein family, exhibits DNA helicase activity J Biol Chem, 2004 279(20): p 20692-8 Talwar T., Vidhyasagar V., Qing J., Guo M., Kariem A., Lu Y., Singh R.S., Lukong K.E., Wu Y., The DEAD-box protein DDX43 (HAGE) is a dual RNA-DNA helicase and has a K-homology domain required 16 for full nucleic acid unwinding activity J Biol Chem, 2017 292(25): p 10429–10443 Li L., Monckton E.A., and Godbout R., A role for DEAD box at DNA double-strand breaks Mol Cell Biol, 2008 28(20): p 6413-25 17 Schurer K.A., Rudolph C., Ulrich H.D., Kramer W., Yeast MPH1 gene functions in an error-free DNA damage bypass pathway that requires genes from Homologous recombination, but not from postreplicative repair Genetics, 2004 166(4): p 1673-86 18 Bergkessel M., and Reese J.C., An essential role for the Saccharomyces cerevisiae DEAD-box helicase 19 Hanh Thi Dieu N., Ngoc An N.-A.N., Gia-Buu Tran,Tan-Viet Pham, The DEAD-box protein CshA in DHH1 in G1/S DNA-damage checkpoint recovery Genetics, 2004 167(1): p 21-33 Staphylococcus aureus contains ATP-independent DNA strand annealing and exchange activities Journal of Sciences and Technology-Industrial University in Ho Chi Minh City, 2019 (in press) 20 Lee S.Y., Jung H.Y., Kim T.O., Im D.W., You K.Y., Back J.M., Kim Y., Kim H.J., Shin W., Heo Y.S., Cloning, purification, crystallization and preliminary X-ray crystallographic analysis of the N-terminal domain of DEAD-box RNA helicase from Staphylococcus aureus strain Mu50 Acta Crystallogr Sect F 21 Struct Biol Cryst Commun, 2010 66(Pt 12): p 1674-6 Hellman L.M., and Fried M.G., Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic 22 acid interactions Nat Protoc, 2007 2(8): p 1849-61 Waterhouse A., Bertoni M., Bienert S., Studer G., Tauriello G., Gumienny R., Heer F.T., de Beer T.A.P., Rempfer C., Bordoli L., Lepore R., Schwede T., SWISS-MODEL: homology modelling of protein structures and complexes Nucleic Acids Research, 2018 46(W1): p W296-W303 23 Bienert S., Waterhouse A., de Beer T.A.P., Tauriello G., Studer G., Bordoli L., Schwede T., The SWISS- 24 MODEL Repository - new features and functionality Nucleic Acids Research, 2017 45: p D313-D319 Guex N., Peitsch M.C., Schwede T., Automated comparative protein structure modeling with SWISS- 25 Benkert P., Biasini M., Schwede T., Toward the estimation of the absolute quality of individual protein 26 structure models Bioinformatics, 2011 27: p 343-350 Bertoni M., Kiefer F., Biasini M., Bordoli L., Schwede T , Modeling protein quaternary structure of homo- 27 Xavier Robert P.G., Deciphering key features in protein structures with the new ENDscript server Nucleic MODEL and Swiss-PdbViewer: A historical perspective Electrophoresis, 2009 30: p S162-S173 and hetero-oligomers beyond binary interactions by homology Scientific Reports 2017 7(10480) Acids Research, 2014 42(W1): p W320–W324 © 2019 Trường Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh HOẠT TÍNH TRAO ĐỔI MẠCH DNA VÀ BẮT CẶP DNA CỦA CshA TỪ VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS PHỤ THUỘC C-TERMINUS 28 213 Mohr G., Del Campo M., Mohr S., Yang Q., Jia H., Jankowsky E., Lambowitz A.M., Function of the Cterminal Domain of the DEAD-Box Protein Mss116p Analyzed In Vivo and In Vitro Journal of Molocular Biology, 2008 375(5): p 1344–1364 29 Samatanga B., Klostermeier D., DEAD-box RNA helicase domains exhibit a continuum between complete functional independence and high thermodynamic coupling in nucleotide and RNA duplex recognition Nucleic Acids Research, 2014 42(16): p 10644–10654 30 Umate P., Tuteja R., Tuteja N., Architectures of the unique domains associated with the DEAD-box helicase motif Cell Cycle, 2010 9(20): p 4228-4235 31 Grohman J.K., Del Campo M., Bhaskaran H., Tijerina P., Lambowitz A.M., Russell R., Probing the Mechanisms of DEAD-box Proteins as General RNA Chaperones: The C-terminal Domain of CYT-19 32 Mediates General Recognition of RNA Biochemistry, 2007 46(11): p 3013–3022 Huber M.D., Duquette M.L., Shiels J.C., Maizels N., A Conserved G4 DNA Binding Domain in RecQ Family Helicases Journal of Molecular Biology 358(4): p 1071-1080 33 Sidorova J.M., Li N., Folch A., Monnat R.J Jr, The RecQ helicase WRN is required for normal replication fork progression after DNA damage or replication fork arrest Cell Cycle, 2008 7(6): p 796–807 34 Mallam A.L., Sidote D.J., Lambowitz A.M., Molecular insights into RNA and DNA helicase evolution from the determinants of specificity for a DEAD-box RNA helicase eLife 2014 3(e04630) Ngày nhận bài: 17/10/2019 Ngày chấp nhận đăng: 06/12/2019 © 2019 Trường Đại học Cơng nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh ... Minh 208 HOẠT TÍNH TRAO ĐỔI MẠCH DNA VÀ BẮT CẶP DNA CỦA CshA TỪ VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS PHỤ THUỘC C-TERMINUS Hình 4: Hoạt tính trao đổi mạch DNA CshA CshA-CTE chất DNA mạch đôi DNA chĩa ba... phố Hồ Chí Minh HOẠT TÍNH TRAO ĐỔI MẠCH DNA VÀ BẮT CẶP DNA CỦA CshA TỪ VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS PHỤ THUỘC C-TERMINUS 207 Hình 3: Hoạt tính chuyển mạch DNA CshA CshA-CTE chất DNA có cấu trúc... phố Hồ Chí Minh 204 HOẠT TÍNH TRAO ĐỔI MẠCH DNA VÀ BẮT CẶP DNA CỦA CshA TỪ VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS PHỤ THUỘC C-TERMINUS quenching buffer phản ứng trao đổi mạch DNA thêm vào đề ngừng phản