Khảo sát hoạt tính kháng phân bào in vitro của gossypol và plumbagin

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC SƢ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA SINH HỌC BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ NĂM 2000-2001 ĐỀ TÀI: KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG PHÂN BÀO IN VITRO CỦA GOSSYPOL VÀ PLUMBAGIN MÃ SỐ: CS 2000-15 CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI T.S Dƣơng Thị Bạch Tuyết Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 11 năm 2002 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC SƢ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA SINH HỌC BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ NĂM 2000-2001 ĐỀ TÀI: KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG PHÂN BÀO IN VITRO CỦA GOSSYPOL VÀ PLUMBAGIN MÃ SỐ: CS 2000-15 Nhóm thực hiện: Dƣơng Thị Bạch Tuyết * Nguyễn Đăng Quân ** Phan Kim Ngọc ** Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng * * Khoa Sinh học - Đại học Sƣ Phạm Tp Hồ Chí Minh ** Khoa Sinh học - Đại học Khoa học Tự nhiên Tp Hồ Chí Minh Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 11 năm 2002 MỤC LỤC PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU I NHỮNG KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ BỆNH UNG THƢ Bản chất bệnh ung thƣ 2 Sự khác loại ung thƣ: Có thể phòng ngừa đƣợc nhiều loại ung thƣ II ĐẠI CƢƠNG VỀ CƠ CHẾ SINH BỆNH UNG THƢ Đại cƣơng khối u lịch sử nghiên cứu Tế bào ung thƣ Sơ lƣợc sở sinh học phân tử ung thƣ III ĐẠI CƢƠNG VỀ THUỐC CHỮA UNG THƢ Cơ chế tác động thuốc chữa ung thƣ Sự kháng thuốc tế bào ung thƣ Độc tính thuốc chữa ung thƣ 10 IV ĐẠI CƢƠNG VỀ NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT 11 Đặc điểm tế bào động vật 11 Môi trƣờng nuôi tế bào động vật 12 PHẦN III: VẬT LIỆU - PHƢƠNG PHÁP 15 I VẬT LIỆU 15 Gossypol 15 Plumbagin 16 Các dòng tế bào ung thƣ 17 II PHƢƠNG PHÁP 18 Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào: 18 Phƣơng pháp đếm tế bào với trypan blue (Trypan blue exclusion assay): 18 Phƣơng pháp MTT (MTT assay): 19 Phƣơng pháp clonogenic (clonogenic assay): 20 Phƣơng pháp xử lý thống kê 20 PHẦN IV: KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 21 I TÁC ĐỘNG CỦA GOSSYPOL LÊN TẾ BÀO RD VÀ HEp2 21 II TÁC ĐỘNG CỦA PLUMBAGIN LÊN TẾ BÀO RD VÀ HEp2 23 PHẦN V: KẾT LUẬN 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO 28 PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thƣ bệnh phổ biến có tỷ lệ gây tử vong cao giới nhƣ Việt Nam Đây dạng bệnh lý có liên quan đến tƣợng rối loạn q trình điều hịa phân chia tế bào mô thể Khối u hình thành tế bào ung thƣ phân chia liên tục khơng đƣợc kiểm sốt, ban đầu khối u định vị mô nhƣng sau tế bào ung thƣ di khắp thể, làm thể suy kiệt dẫn đến tử vong Ung thƣ vấn đề nan giải Y học, ngƣời ta chƣa tìm hoạt chất hay phƣơng pháp điều trị hữu hiệu tất dạng ung thƣ Nghiên cứu bệnh ung thƣ cách chữa trị ung thƣ lĩnh vực đƣợc quan tâm giới Đã có nhiều tổ chức, viện nghiên cứu ung thƣ đƣợc thành lập nhiều quốc gia giới nhƣ: American Association Cancer Research, Australian Cancer Society, British Association for Cancer Research, National Cancer Institute of Canada, European Association for Cancer Research Nhiều nghiên cứu bệnh ung thƣ cách chữa trị ung thƣ đƣợc thực giới đạt đƣợc nhiều hiểu biết chế phân tử phân bào, chế phân tử bệnh ung thƣ, phƣơng thức hữu hiệu để tiêu diệt hay ngăn cản phát triển tế bào ung thƣ gần giải Nobel Sinh lý Y học năm 2001 phát liên quan đến protein tham gia vào trình phân bào ung thƣ Việt Nam nƣớc nhiệt đới với nguồn tài nguyên thuốc phong phú, có nhiều thuốc với hoạt chất kháng ung thƣ mạnh ứng dụng vào điều trị Tuy nhiên, nghiên cứu hoạt chất kháng ung thƣ nƣớc ta khơng nhiều Trƣớc tình hình đó, việc phát triển phƣơng pháp thử nghiệm nhằm xác định hoạt tính kháng ung thƣ chất chiết xuất từ thực vật cần thiết, từ nâng cao hiệu sử dụng nguồn tài nguyên thuốc Việt Nam làm sở cho nghiên cứu sâu Để bƣớc đầu thực mục tiêu trên, chúng tơi tiến hành khảo sát hoạt tính kháng phân bào hoạt chất gossypol plumbagin có nguồn gốc từ thuốc dân gian đƣợc biết có khả kháng ung thƣ [11,13] hai dòng tế bào ung thƣ ngƣời điều kiện in vitro PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU I NHỮNG KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ BỆNH UNG THƢ Bản chất bệnh ung thƣ Ung thƣ bệnh lý ác tính tế bào Khi bị kích thích tác nhân sinh ung thƣ, tế bào tăng sinh vô hạn độ, vô tổ chức không tuân theo chế kiểm soát phát triển thể Đa số ngƣời bị ung thƣ hình thành khối u Khác với khối u lành tính (chỉ phát triển cho thƣờng chậm, có vỏ bọc chung quanh), khối u ác tính (ung thƣ) xâm lấn vào tổ chức lành xung quanh giống nhƣ hình "con cua" với cua bám vào tổ chức lành thể giống nhƣ rễ lan đất Các tế bào khối u ác tính có khả di tới hạch bạch huyết hay tạng xa hình thành khối u cuối dẫn đến tử vong Đa số ung thƣ có biểu mãn tính, có q trình phát sinh phát triển lâu dài qua nhiều giai đoạn Trừ số nhỏ ung thƣ trẻ em có lẽ đột biến gen giai đoạn bào thai, cịn phần lớn ung thƣ có giai đoạn tiềm tàng lâu dài, có hàng chục năm khơng có dấu hiệu trƣớc phát thấy dƣới dạng khối u Khi khối u phát triển nhanh có triệu chứng ung thƣ Triệu chứng đau xuất ung thƣ vào giai đoạn cuối Sự khác loại ung thƣ: Ngƣời ta biết đƣợc có đến 200 loại ung thƣ khác thể ngƣời Những loại ung thƣ có điểm giống chất nhƣng chúng có nhiều điểm khác nhƣ sau: 2.1 Khác nguyên nhân Qua nghiên cứu dịch tễ học R.Doll Petro 80% tác nhân sinh ung thƣ bắt nguồn từ môi trƣờng sống, có tác nhân lớn là: 35% chế độ ăn uống gây nhiều loại ung thƣ đƣờng tiêu hóa khoảng 30% ung thƣ thuốc (gây ung thƣ phổi, ung thƣ đƣờng hô hấp ) Các tác nhân khác gồm: - Tia phóng xạ: gây ung thƣ máu, ung thƣ tuyến giáp - Bức xạ tử ngoại: gây ung thƣ da - Virus Epstein - Barr: gây ung thƣ vịm họng, u lympho ác tính - Virus viêm gan B (HBV), viêm gan C (HCV) dẫn đến ung thƣ gan - Các loại hóa chất đƣợc sử dụng công nghiệp, thực phẩm, chiến tranh, chất thải môi trƣờng nƣớc khơng khí tác nhân nhiều loại ung thƣ khác 2.2 Khác tiến triển Ung thƣ thƣờng xuất phát từ tổ chức thể: - Từ tế bào biểu mô tạng, quan (ung thƣ biểu mô: carcinoma) - Từ tế bào tổ chức liên kết thể (sarcoma) Ung thƣ quan tạo huyết (máu, hạch lympho) dạng đặc biệt ung thƣ tể chức liên kết (Hematosarcoma) Mỗi loại ung thƣ có hƣớng tiến triển khác Trong loại, loại ung thƣ cá thể khác nhau, xu hƣớng tiến triển khác - Có loại ung thƣ tiến triển nhanh (ung thƣ máu, hạch, ung thƣ hắc tố, ung thƣ liên kết .) - Có nhiều loại ung thƣ tiến triển chậm: ung thƣ da tế bào đáy, ung thƣ giáp trạng, ung thƣ cổ tử cung - Loại ung thƣ biểu mô thƣờng di theo đƣờng bạch huyết đến hạch khu vực - Loại ung thƣ liên kết (xƣơng, phần mềm) thƣờng di theo đƣờng máu tới tạng xa (vào gan, phổi, xƣơng) Thông thƣờng ung thƣ giai đoạn muộn, hay có di hạch khu vực di xa nhƣng đơi có di sớm, chí từ lúc chƣa phát thấy u nguyên phát Tốc độ phát triển ung thƣ tùy thuộc vào giai đoạn loại Ở giai đoạn sớm (insitu, giai đoạn 1) ung thƣ thƣờng tiên triển lâu dài, chậm chạp, nhƣng giai đoạn muộn (giai đoạn 3,4) ung thƣ tiến triển thƣờng nhanh gây tử vong Ung thƣ ngƣời trẻ, thƣờng tiến triển nhanh ngƣời già 2.3 Khác phƣơng pháp điều trị Trong y văn có nói đến tỷ lệ nhỏ ung thƣ tự khỏi (1/10.000) Có thể thể cá biệt, có hệ thống miễn dịch tự điều chỉnh, tiêu diệt đƣợc tế bào ung thƣ sau phát sinh Nhƣng không điều trị chắn bệnh nhân sớm dẫn đến tử vong Càng điều trị ung thƣ giai đoạn sớm, bệnh nhân có may trị khỏi bệnh ung thƣ Ở giai đoạn muộn cần điều trị để tạm thời ổn định kéo dài thời gian sống giảm triệu chứng ung thƣ Mỗi loại ung thƣ, giai đoạn bệnh có phƣơng pháp điều trị khác - Điều trị phẫu thuật: thƣờng áp dụng cho ung thƣ giai đoạn sớm chƣa có di - Điều trị tia xạ: thƣờng áp dụng cho ung thƣ giai đoạn tƣơng đối muộn Thƣờng phối hợp với phẫu thuật làm thu nhỏ bớt khối u để dễ mổ diệt tế bào u chỗ hạch khu vực mà mổ nghi ngờ chƣa lấy hết hạch, áp dụng tia xạ cho ung thƣ vị trí khơng thể mổ đƣợc - Điều trị hóa chất: trƣớc áp dụng cho loại ung thƣ có tính chất tồn thân hay giai đoạn muộn, có di căn, nhƣng ngày số ung thƣ giai đoạn sớm (trên lâm sàng) nhƣng tính chất ác tính cao, dễ di nghi có vi di (ung thƣ vú, tinh hoàn, buồng trứng, ung thƣ rau ) ngƣời ta sử dụng hóa trị để phịng ngừa nâng cao hiệu điều trị - Điều trị miễn dịch: phƣơng pháp điều trị tồn thân, cịn đƣợc nghiên cứu có nhiều hy vọng Có nhiều thử nghiệm áp dụng nhƣ điều trị kích thích miễn dịch không đặc hiệu, điều trị interferon, lymphokin gần nghiên cứu dùng kháng thể đơn dòng điều trị số bệnh ung thƣ có kết tốt 2.4.Khác tiên lƣợng bệnh Tiên lƣợng ung thƣ phụ thuộc nhiều yếu tố bệnh nhân Những yếu tố là: - Giai đoạn ung thƣ: sớm tiên lƣợng tốt ngƣợc lại - Loại ung thƣ: ung thƣ bề mặt có tiên lƣợng tốt (dễ phát hiện, dễ điều trị) nhƣ ung thƣ da, ung thƣ cổ tử cung, ung thƣ vú, ung thƣ giáp trạng, ung thƣ khoang miệng, ung thƣ đại trực tràng Có ung thƣ tạng quan trọng khó phát sớm, khó điều trị, tiên lƣợng thƣờng xấu nhƣ ung thƣ phổi, gan, não, tụy, xƣơng - Tính ác tính tế bào ung thƣ: loại ung thƣ, giai đoạn lâm sàng nhƣng độ ác tính chúng khác Độ ác tính cao tiên lƣợng xấu - Thể trạng ngƣời bị ung thƣ: ngƣời già ung thƣ thƣờng tiến triển chậm nhƣng thể trạng yếu nên khó thực đƣợc phác đồ điều trị cách triệt để nên già yếu tiên lƣợng xấu Có thể phịng ngừa đƣợc nhiều loại ung thƣ Nhƣ đề cập đến tác nhân sinh ung thƣ chủ yếu từ môi trƣờng bên ngồi (trên 80%) Tác nhân nội sinh (chỉ khoảng 1%) Vì vậy, phịng bệnh ung thƣ có hiệu ngăn chặn tốt tác nhân môi trƣờng tác động vào đời sống ngƣời nhƣ: ngừng hút thuốc lá, chế độ dinh dƣỡng vệ sinh an tồn hợp lý, chống lạm dụng hóa chất cơng nghiệp, chống nhiễm mơi trƣờng, phịng bệnh nghề nghiệp làm giảm tỷ lệ mắc ung thƣ Một số loại bệnh ung thƣ có liên quan đến virus đƣợc ngƣời ta áp dụng vaccin để phòng ung thƣ nhƣ vaccin phòng viêm gan B, ngƣời ta nghiên cứu vaccin phòng Esptein-Barr gây ung thƣ vịm họng u lympho Ngồi biện pháp điều trị tổn thƣơng tiền ung thƣ, biện pháp sàng lọc phát sớm số ung thƣ hay gặp (vú, cổ tử cung, khoang miệng, đại trực tràng ) thiết thực làm giảm tỷ lệ mắc bệnh, làm giảm tỷ lệ tử vong ung thƣ [1] II ĐẠI CƢƠNG VỀ CƠ CHẾ SINH BỆNH UNG THƢ Đại cƣơng khối u lịch sử nghiên cứu Nghiên cứu chế sinh bệnh ung thƣ cần phải sâu tìm hiểu trình sinh học tế bào ung thƣ sinh học phân tử ung thƣ 1.1 Phân biệt u lành u ác tính theo đặc tính sinh học U lành tính U ác tính Tế bào biệt hóa cao Ít biệt hóa Hiếm có phân bào Ln có phân bào Phát triển chậm Phát triển nhanh Khơng xâm lấn Xâm lấn lan rộng Khơng có hoại tử Hay có hoại tử trung tâm Có vỏ bọc Khơng có vỏ ranh giới Rất tái phát Ln tái phát Khơng di Di Ít ảnh hƣởng đến thể Ảnh hƣởng nặng tới thể 1.2 Một số mốc lịch sử nghiên cứu ung thƣ - Xƣơng hóa thạch loại khủng long cách 60 triệu năm có thƣơng tổn ung thƣ - Xác ƣớp ngƣời Ai cập Gaza cách 5000 năm thấy có ung thƣ xƣơng ung thƣ bàng quang - Thời Hypocrates để lại số viết tay mô tả loại ung thƣ: loại sùi ngồi nhiều chân nhƣ lồi tơm cua gọi carcinoma loại phát triển sâu thịt gọi sarcoma - 1846 R.Virchop (ngƣời Đức) mô tả tế bào ung thƣ máu đƣa giả thuyết nguồn góc ung thƣ tế bào - 1953 J.Watson F Crick dƣa mơ hình chuỗi xoắn kép phân tử DNA mô loại gen tế bào Cơng trình nhận giải Nobel Sinh học - 1979 Richard Doll lãnh đạo nhóm nghiên cứu nguyên nhân gây ung thƣ ngƣời từ mơi trƣờng sống Trong ơng Petro nhấn mạnh vai trò quan trọng hút thuốc, dinh dƣỡng ung thƣ nghề nghiệp - 1981 Cesar Milstein phát triển kỹ thuật sản xuất kháng thể đơn dòng (nhận giải Nobel 1987) - 1981 S.D.Thomas thành công ghép tủy xƣơng ngƣời ứng dụng xạ trị tồn thân điều trị hóa chất mạnh bệnh bạch huyết cấp (nhận giải Nobel năm 1990) Tế bào ung thƣ 2.1 Nguồn gốc tế bào ung thƣ Có số giả thuyết khác nhằm giải thích quan sát quần thể tế bào ung thƣ 2.7.7 Thuyết đơn dòng tế bào Là quan niệm kinh điển: khối u sinh từ tế bào mẹ nhân lên Ví dụ: từ bệnh bạch cầu thể tủy phụ nữ da đen thấy tế bào đồng thƣơng tổn nhiễm sắc thể 10 Các tế bào ung thƣ tiết men Glucose-6-phosphate dehydrogenase 2.7.2 Thuyết đa dòng tế bào Khi quan sát hình thái chức ngƣời ta thấy: - Tổ chức ung thƣ có nhiều loại tế bào nên chẩn đốn hình thái học dễ nhầm lẫn - Về chức năng: nhiều chất điểm sinh học 2.1.3 Thuyết ổn định gen tế bào ung thƣ Có thể ban đầu dòng, gen tế bào ung thƣ khơng ổn định nên có tế bào biến dị tạo nên hàng loạt tế bào hỗn hợp Ví dụ: U lympho ác tính tế bào lớn, tế bào nhỏ Các loại ung thƣ phổi thể hỗn hợp, ung thƣ liên kết hỗn hợp 2.2 Các đặc tính tế bào ung thƣ - Hình thái học: tăng kích thƣớc nhân, tăng tỷ lệ nhân so với bào tƣơng, khơng cịn ức chế tiếp xúc - Chức năng: + Hai đặc tính cho: xâm lấn lan rộng, tế bào thoát mạch di chuyển tƣợng phân bào mạnh + Tế bào biệt hóa thấp, khơng làm đƣợc chức bình thƣờng, bị thiếu dƣỡng chất dễ bị hoại tử vùng trung tâm u + Đôi tiết hoạt chất lạ mà qua ta gián tiếp thấy đƣợc diện tế bào ung thƣ đặc hiệu: αFP: ung thƣ gan CA125: ung thƣ buồng trứng CA25: ung thƣ vú CEA: ung thƣ đại trực tràng TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Bá Đức, Bộ môn Ung thƣ - Đại học Y Hà Nội Bài giảng Ung thƣ học Nhà xuất Y học, 2001 Đỗ Trung Đàm Thuốc chữa ung thƣ Nhà xuất Y học, 1995 Phan Kim Ngọc, Nguyễn Đăng Quân, Huỳnh Thị Lệ Duyên, Nguyễn Kim Thiên Nga, Đỗ Minh Sĩ, Trần Nguyễn Bích Châu Giáo trình thực tập Cơng nghệ Sinh học Động vật sở Tủ sách Đại học Khoa học Tự nhiên Võ Hƣng Sơn 1995 Cô lập plumbagin từ rễ bạch hoa xà Plumbago zeylanica Linn, họ Plumbaginaceae Luận văn tốt nghiệp Cử nhân Hoá học ĐH Khoa học Tự nhiên TP.HCM Trần Đệ Thăng 1995 Khảo sát chất gossypol cô lập từ hột Gossypium hirsutum, họ Malvaceae Luận văn tốt nghiệp Cử nhân Hoá học ĐH Khoa học Tự nhiên TP.HCM World Health Organization 1997 Manual for the virological investigation of polio, Global programme for vaccines and immunization 35-37 Xin Lin, Wen Kui Li, Pei gen Xiao 1999 Effects of Icariside II from Epimedium koreanum on tumour cell lines in vitro - Pharm Pharmacol Commun 5:701-703 K.V.Anis, G.Kuttan, R.Kuttan 1999 Role of Berberine as an adjuvant response modifier during tumour therapy in mice Pharm Pharmacol Commun 5:697 - 700 Keyong Ho Lee, Hee Sun Hong, Chi Ho Lee, Chang Han Kim 2000 Induction of apoptosis in human leukaemic cell lines K562, HL 60 and U 937 by Diethylhexylphthalate isolated from Aloe vera Linne J Pharm.Pharmacol 52: 1037- 1041 10 Ana M Pintao, M Salome S Pais, Helen Coley, Lloyd R Kelland, Ian R Judson 1995 In vitro and in vivo antitumor activity of Benzyl Isothiocyanate: A natural product from Tropaeolum majus Planta Med 61: 233-236 11 Uma Devi, F.E Solomon, A.C Sharada 1999 Plumbagin, a plant naphthoquinon with antitumor and radiomodifying properties Pharmaceutical biology 3:231-236 28 12 V Elangovan, Nalini Ramamoorthy, S Balasubramanian, N Sekar, S Govindasamy - Studies on the antiproliferative effect of some naturally occurring bioflavonoidal compounds against human carcinoma of larynx and sarcoma - 180 cell lines - Indian Journal of Pharmacology 1994; 26: 266-269 13 Clinical pharmacology and pharmacology of gossypol http://www.med.cornell.edu/gradschool/fac/reidenberg.html 29 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC SƢ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA SINH HỌC BÁO CÁO TĨM TẮT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ NĂM 2000-2001 ĐỀ TÀI: KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG PHÂN BÀO IN VITRO CỦA GOSSYPOL VÀ PLUMBAGIN MÃ SỐ: CS 2000-15 CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI T.S Dƣơng Thị Bạch Tuyết Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 11 năm 2002 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC SƢ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA SINH HỌC BÁO CÁO TĨM TẮT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ NĂM 2000-2001 ĐỀ TÀI: KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG PHÂN BÀO IN VITRO CỦA GOSSYPOL VÀ PLUMBAGIN MÃ SỐ: CS 2000-15 Nhóm thực hiện: Dƣơng Thị Bạch Tuyết(1) Nguyễn Đăng Quân (2) Phan Kim Ngọc(2) Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng(2) (1) Khoa Sinh học - Đại học Sƣ Phạm Tp Hồ Chí Minh (2) Khoa Sinh học - Đại học Khoa học Tự nhiên Tp Hồ Chí Minh Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 11 năm 2002 Ung thƣ bệnh phổ biến có tỷ lệ gây tử vong cao nên việc nghiên cứu phƣơng pháp điều trị bệnh ung thƣ đƣợc trọng giới Một hƣớng nghiên cứu đƣợc nhiều nhà khoa học quan tâm hoạt chất thiên nhiên, đặc biệt từ thực vật, có hoạt tính kháng ung thƣ Việt Nam nƣớc nhiệt đới với nguồn tài nguyên thuốc phong phú, có nhiều thuốc chứa hoạt chất kháng ung thƣ mạnh ứng dụng vào điều trị Vì vậy, việc phát triển phƣơng pháp thử nghiệm nhằm xác định hoạt chất kháng ung thƣ cần thiết Trong đề tài này, tiến hành xây dựng phƣơng pháp khảo sát hoạt tính kháng phân bào hoạt chất gossypol plumbagin có nguồn gốc từ thuốc dân gian đƣợc biết có khả kháng ung thƣ [11,13] hai dịng tế bào ung thƣ ngƣời điều kiện in vitro I VẬT LIỆU - PHƢƠNG PHÁP: Hoạt chất: a Gossypol: Gossypol sắc tố vàng loại polyphenol có độc tính, đƣợc chiết xuất từ hạt bơng Gossypium hirsutum, họ Malvaceae, có nhiệt độ nóng chảy 182°C [5] Cơng thức hóa học: b Plumbagin: Plumbagin tinh thể màu vàng cam, hình kim, nhiệt độ nóng chảy 77 - 78°C, đƣợc chiết xuất từ rễ bạch hoa xà Plumbago zeylanica, họ Plumbaginaceae.[4] Cơng thức hóa học: Gossypol plumbagin sử dụng nghiên cứu đƣợc TS Nguyễn Kim Phi Phụng cộng sự, mơn Hố hữu cơ, khoa Hóa, ĐH.Khoa học Tự nhiên TP.HCM cung cấp Các dòng tế bào điều kiện ni cấy: Chúng tơi sử dụng hai dịng tế bào ung thƣ ngƣời: dòng tế bào ung thƣ RD (Rhabdomyosarcoma) dòng tế bào ung thƣ biểu bì HEp2 (Epidermoid carcinoma) Hai dịng tế bào đƣợc cung cấp Viện Pasteur TP.HCM Tế bào đƣợc ni cấy mơi trƣờng EMEM có chứa glutamine, penicillin, streptomycine, HEPES, NaHCO3, phenol red, pH 7.2, bổ sung 10% huyết phơi bị (FBS: Foetal Bovine Serum) Ủ 37,50 C Phƣơng pháp nhuộm tế bào với trypan blue (Trypan blue exclusion assay) Sau thời gian nuôi cấy, tế bào đƣợc tách trypsin/EDTA đƣợc cấy vào plate 24 giếng; giếng gồm 100μl dịch huyền phù tế bào 400μl môi trƣờng Tế bào đƣợc ủ 37,50C 24 Sau mơi trƣờng cũ đƣợc thay môi trƣờng chứa gossypol với nồng độ 0,lμg/ml - 20μg/ml plumbagin với nồng độ 0,lμg/ml 2μg/ml dòng tế bào RD 0,1μg/ml - 10μg/ml dịng tế bào HEp2 Lơ đối chứng đƣợc xử lý với mơi trƣờng chứa dung mơi hịa tan hoạt chất DMSO Các lô đƣợc ủ 72 37,50C Tế bào đƣợc tách trypsin/EDTA, đƣợc hịa vào 500 μl mơi trƣờng nhuộm trypan blue 0,4% theo tỷ lệ 1:1 Số lƣợng tế bào sống (tế bào không bắt màu) đƣợc xác định buồng đếm hồng cầu Mỗi thí nghiệm đƣợc lặp lại ba lần Khả ức chế phát triển dịng tế bào ung thƣ hoạt chất đƣợc tính theo công thức: Tỷ lệ ức chế (%) = Mật độ tế bào đối chứng - Mật độ tế bào thí nghiệm Mật độ tế bào đối chứng 100 % [6] Phƣơng pháp MTT (MTT assay): Phƣơng pháp MTT dựa chuyển chất MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyl tetrazolium bromide) thành MTT-formazan có màu xanh tím enzyme hơ hấp ti thể tế bào Số lƣợng tế bào sống tỉ lệ thuận với nồng độ formazan, thể qua giá trị mật độ quang (OD570 ) dung dịch Tế bào đƣợc cấy vào plate 96 giếng Các lơ thí nghiệm đối chứng đƣợc xử lý với hoạt chất tƣơng tự nhƣ phƣơng pháp Sau 72 37,50C, môi trƣờng xử lý đƣợc thay môi trƣờng chứa 0,5 mg/ml MTT Sau 37,50C môi trƣờng chứa MTT đƣợc thay hỗn hợp isopropanol-HCl (0,04M) Đo OD570 lơ thí nghiệm đối chứng Mỗi thí nghiệm đƣợc lặp lại ba lần Khả ức chế phát triển dòng tế bào ung thƣ hoạt chất đƣợc tính theo cơng thức: Tỷ lệ ức chế (%) = OD570đối chứng - OD570thí nghiệm OD570đối chứng 100 % [7,8,9,10] Phƣơng pháp clonogenic (clonegenic assay): Phƣơng pháp clonogenic dùng để xác định tỷ lệ tế bào ung thƣ bị ức chế phân bào dƣới tác động hoạt chất 5000 tế bào RD, 500 tế bào HEp2, đƣợc cấy vào giếng plate 24 giếng Các lơ thí nghiệm đối chứng đƣợc xử lý với hoạt chất tƣơng tự nhƣ phƣơng pháp Sau 72 ủ 37,50C, số cụm (colony) tế bào hình thành giếng đƣợc đếm dƣới kính hiển vi Khả ức chế phân bào hoạt chất đƣợc tính theo cơng thức : Tỷ lệ ức chế (%) = Số colony đối chứng - Số colony thí nghiệm Số colony đối chứng 100 % [9,10] Phƣơng pháp xử lý thống kê Số liệu thu đƣợc từ thí nghiệm đƣợc xử lý thống kê phần mềm MSTATC Đại học bang Michigan, Hoa Kỳ II KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN Tác động gossypol lên tế bào RD HEp2 Bảng 1: Tác động gossypol lên dòng tế bào RD Nồng độ Tỷ lệ ức chế phân bào (%) (μg/ml) Trypan blue MTT Clonogenic 0.1 18.72 ± 12.18 C 4.56 ± 10.52 C 21.98 ±23.1 B 10 20 28.68 ± 23.76 C 72.89 ± 11.98 B 86.56 ± 10.51 AB 99.77 ±0.68 A 3.52 ± 5.06 C 71.47 ± 16.86 B 78.68 ± 19.17 B 97.20 ± 2.7 A 24.78 ± 23.67 B 95.72 ± 1.93 A 100 ± 0.0 A 100 ± 0.0 A LSD ∞=0.01 17.73 13.74 18.89 Tỷ lệ ức chế(%) Biểu đồ 1: Tác dộng gossypol lên RD Nồng độ gossypol (ug/ml) Kết bảng biểu đồ cho thấy gossypol có tác động lên phát triển tế bào RD Ở nồng độ 20 μg/ml, gossypol giết chết hoàn toàn tế bào RD (khơng cịn tế bào sống giếng) thể qua tỷ lệ ức chế gần nhƣ 100% thử nghiệm trypan blue, MTT clonogenic Ở nồng độ 10-5 μg/ml, gossypol ức chế khả phân bào tế bào RD thể qua tỷ lệ ức chế đƣợc xác định thử nghiệm clonogenic gần nhƣ 100%, hay gần nhƣ khơng có colony đƣợc hình thành giếng nuôi, nhƣ tất tế bào khơng có khả phân chia nồng độ gossypol Tuy nhiên, kết thử nghiệm trypan blue MTT lại cho thấy tỷ lệ ức chế tế bào RD thấp 100% (khoảng 70-80%), nhƣ chứng tỏ tế bào RD sống đƣợc nồng độ gossypol 5-10 μg/ml Ở nồng độ thấp 5μg/ml (1, 0.1μg/ml), gossypol làm giảm số tế bào RD có khả phân chia, thể qua tỷ lệ ức chế xác định thử nghiệm clonogenic khoảng 20% Bảng 2: Tác động gossypol lên hai dòng tế bào HEp2 Nồng độ (μg/ml) Tỷ lệ ức chế phân bào (%) Trypan blue D MTT 0.00 ± 4.88 Clonogenic C 10.85 ± 16.48 B 0.1 0.00 ± 18.51 10 16.83 ±11.41 C 63.30 ±23.83 B 88.90 ± 5.35 A 0.00 ± 6.81 C 72.14+ 13.48 B 72.14 ± 10.02 B 21.23 ±26.00 B 84.65 ±11.5 A 100 ± 0.0 A 20 98.70±3.11 A 89.10 + 8.62 A 100 ± 0.0 A LSD ∞ = 0.01 18.65 10.06 18.73 Tỷ lệ ức chế(%) Biểu đồ 2: Tác động gosypol lên HEp2 Nồng độ gossypol (ug/ml) Bảng biểu đồ cho thấy tác động gossypol lên tế bào HEp2 Ở nồng độ 20 μg/ml, gossypol giết chết hồn tồn tế bào HEp2 (khơng cịn tế bào sống giếng) thể qua tỷ lệ ức chế gần nhƣ 100% thử nghiệm trypan blue, MTT clonogenic Ở nồng độ 10 μg/ml, gossypol ức chế khả phân bào tế bào HEp2 thể qua tỷ lệ ức chế đƣợc xác định thử nghiệm clonogenic 100%, hay gần nhƣ khơng có colony đƣợc hình thành giếng ni, nhƣ tất tế bào khơng có khả phân chia nồng độ gossypol Tuy nhiên, kết thử nghiệm trypan blue MTT lại cho thấy tỷ lệ ức chế tế bào HEp2 thấp 100% (khoảng 70-80%), nhƣ chứng tỏ tế bào HEp2 sống đƣợc nồng độ gossypol 10 μg/ml Ở nồng độ 5-lμg/ml, gossypol làm giảm số tế bào HEp2 có khả phân chia, thể qua tỷ lệ ức chế xác định thử nghiệm clonogenic khoảng 80 - 20% Ở nồng độ 0.1μg/ml, gossypol khơng có tác động đáng kể lên tế bào HEp2 Tác động plumbagin lên tế bào RD HEp2 Bảng 3: Tác động plumbagin lên dòng tế bào RD Nồng độ Tỷ lệ ức chế phân bào (%) (μg/ml) Trypan blue MTT Clonogenic 0.1 0.5 1.5 57.96 ± 12.06 C 92.07 ±1.57 B 99.73 ±0.82 A 98.56±3.23AB 100 ± 0.0 A 17.69 ± 21.27 C 71.46 ± 10.12 B 90.75 ± 3.3 B 91.45 ±2.11 A 95.26 ±3.03 A 71.19 ±8.41 B 100 ± 0.0 A 100 ± 0.0 A 100 ± 0.0 A 100 ±0.0 A LSD α=0.01 7.197 11.73 4.789 Tỷ lệ ức chế(%) Biểu đồ 3: Tác động plumbagin lên RD Nồng độ plumbagin (ug/ml) Bảng biểu đồ cho thấy tác động plumbagin lên phát triển tế bào RD Ở nồng độ từ lμg/ml trở lên, plumbagin giết chết gần nhƣ hoàn toàn tế bào RD (khơng cịn tế bào sống giếng) thể qua tỷ lệ ức chế gần nhƣ 100% thử nghiệm trypan blue, MTT clonogenic Ở nồng độ 0.5 μg/ml, plumbagin ức chế khả phân bào tế bào RD thể qua tỷ lệ ức chế đƣợc xác định thử nghiệm clonogenic 100%, hay gần nhƣ khơng có colony đƣợc hình thành giếng ni, nhƣ tất tế bào khơng có khả phân chia nồng độ plumbagin Tuy nhiên, kết thử nghiệm trypan blue MTT lại cho thấy tỷ lệ ức chế tế bào HEp2 thấp 100% (khoảng 80-90%), nhƣ chứng tỏ phần tế bào RD sống đƣợc nồng độ plumbagin 0.5 μg/ml Ở nồng độ 0.1μg/ml, plumbagin có khả ức chế mạnh phân chia tế bào RD, thể qua tỷ lệ ức chế xác định thử nghiệm clonogenic 70% Bảng 4: Tác động plumbagin lên dòng tế bào HEp Nồng độ Tỷ lệ ức chế phân bào (%) (μg/ml) Trypan blue MTT Clonogenic 0.1 0.5 10 14.29 ± 14.14 C 23.59 ± 13.42 C 56.41 ±8.23 B 99.10 ±0.98 A 100 ±0.0 A 4.36 ±14.55 D 17.81 ± 19.49 C 65.07 ±9.64 B 85.38 ±6.34 A 94.59 ±3.94 A 49.16 ±7.67 B 99.91 ±0.19 A 99.85 ± 0.22 A 99.82 ±0.21 A 100 ± 0.0 A LSD α = 0.01 12.08 12.53 4.38 Tỷ lệ ức chế(%) Biểu đồ 4: Tác động plumbagin lên HEp2 Nồng độ plumbagin (ug/ml) Bảng biểu đồ cho thấy tác động plumbagin lên phát triển tế bào HEp2 Ở nồng độ μg/ml, plumbagin giết chết hồn tồn tế bào HEp2 (khơng cịn tế bào sống giếng) thể qua tỷ lệ ức chế gần nhƣ 100% thử nghiệm trypan blue, MTT clonogenic Ở nồng độ khoảng 1-0.5 μg/ml, plumbagin ức chế khả phân bào tế bào HEp2 thể qua tỷ lệ ức chế đƣợc xác định thử nghiệm clonogenic 100%, hay gần nhƣ colony đƣợc hình thành giếng ni, nhƣ tất tế bào khơng có khả phân chia nồng độ plumbagin Tuy nhiên, kết thử nghiệm trypan blue MTT lại cho thấy tỷ lệ ức chế tế bào HEp2 thấp 100% (khoảng 20-60%), nhƣ chứng tỏ tế bào HEp2 sống đƣợc nồng độ gossypol - 0.5 μg/ml Ở nồng độ O.lμg/ml, plumbagin làm giảm số tế bào HEp2 có khả phân chia, thể qua tỷ lệ ức chế xác định thử nghiệm clonogenic khoảng 50% Nhƣ vậy: Ở hai hoạt chất, chúng tơi tìm thấy nồng độ mà tác động ức chế phân bào mạnh, gần tƣơng đƣơng với nồng độ cao gấp 2, lần nhƣng tính gây độc (không làm chết tế bào) lại thấp Nồng độ μg/ml gossypol 0.5 μg/ml plumbagin hai dòng tế bào thử nghiệm Điều thể rõ tế bào dòng HEp2 xử lý với plumbagin (biểu đồ 4) Các kết thu nhận từ ba phƣơng pháp thử nghiệm phù hợp với Phƣơng pháp nhuộm với trypan blue MTT cho phép đánh giá tỉ lệ sống tế bào sau xử lý với hoạt chất, cịn khả phân bào đƣợc đánh giá phƣơng pháp clonogenic Việc sử dụng phối hợp ba phƣơng pháp cho phép khẳng định kết quả, đồng thời đánh giá cách tƣơng đối toàn diện tác động hoạt chất lên dòng tế bào ung thƣ III KẾT LUẬN Gossypol plumbagin có tác động lên phát triển dịng tế bào ung thƣ RD HEp2 điều kiện khảo sát Tùy theo nồng độ tác động, gossypol plumbagin giết chết hồn tồn, ức chế phân bào hoàn toàn hay ức chế phân bào phần tế bào ung thƣ Plumbagin có tính kháng phân bào mạnh gossypol dòng tế bào khảo sát Nồng độ plumbagin giết chết 100% tế bào RD 2μg/ml, HEp2 5μg/ml với gossypol nồng độ phải 20 μg/ml Tế bào HEp2 nhạy cảm với hoạt chất so với tế bào RD Điều phù hợp với đặc tính tế bào HEp2 (phần III, mục I) Ba phƣơng pháp thử nghiệm sử dụng cho phép đánh giá xác mức độ tác động hoạt chất lên phát triển tế bào TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Bá Đức, Bộ môn Ung thƣ - Đại học Y Hà Nội Bài giảng Ung thƣ học Nhà xuất Y học, 2001 Đỗ Trung Đàm Thuốc chữa ung thƣ Nhà xuất Y học, 1995 Phan Kim Ngọc, Nguyễn Đăng Quân, Huỳnh Thị Lệ Duyên, Nguyễn Kim Thiên Nga, Đỗ Minh Sĩ, Trần Nguyễn Bích Châu Giáo trình thực tập Cơng nghệ Sinh học Động vật sở Tủ sách Đại học Khoa học Tự nhiên Võ Hƣng Sơn 1995 Cô lập plumbagin từ rễ bạch hoa xà Plumbago zeylanica Linn, họ Plumbaginaceae Luận văn tốt nghiệp Cử nhân Hoá học ĐH Khoa học Tự nhiên TP.HCM Trần Đệ Thăng 1995 Khảo sát chất gossypol cô lập từ hột Gossypium hirsutum, họ Malvaceae Luận văn tốt nghiệp Cử nhân Hoá học ĐH Khoa học Tự nhiên TP.HCM World Health Organization 1997 Manual for the virological investigation of polio, Global programme for vaccines and immunization 35-37 Xin Lin, Wen Kui Li, Pei gen Xiao 1999 Effects of Icariside II from Epimedium koreanum on tumour cell lines in vitro - Pharm Pharmacol Commun 5:701-703 K.V.Anis, G.Kuttan, R.Kuttan 1999 Role of Berberine as an adjuvant response modifier during tumour therapy in mice Pharm Pharmacol Commun 5:697 - 700 Keyong Ho Lee, Hee Sun Hong, Chi Ho Lee, Chang Han Kim 2000 Induction of apoptosis in human leukaemic cell lines K562, HL 60 and U 937 by Diethylhexylphthalate isolated from Aloe vera Linne J Pharm.Pharmacol 52: 1037 - 1041 10 Ana M Pintao, M Salome S Pais, Helen Coley, Lloyd R Kelland, Ian R Judson 1995 In vitro and in vivo antitumor activity of Benzyl Isothiocyanate: A natural product from Tropaeolum majus Planta Med 61: 233-236 11.Uma Devi, F.E Solomon, A.C Sharada 1999 Plumbagin, a plantnaphthoquinon with antitumor and radiomodifying properties Pharmaceutical biology 3:231-236 10 12 V Elangovan, Nalini Ramamoorthy, S Balasubramanian, N Sekar, S Govindasamy - Studies on the antiproliferative effect of some naturally occurring bioflavonoidal compounds against human carcinoma of larynx and sarcoma - 180 cell lines - Indian Journal of Pharmacology 1994; 26: 266-269 13 Clinical pharmacology and pharmacology of gossypol http://wwvv.med.cornell.edu/gradschool/fac/reidenberg.html 11 ... hồn toàn, ức chế phân bào hoàn toàn hay ức chế phân bào phần tế bào ung thƣ Plumbagin có tính kháng phân bào mạnh gossypol dòng tế bào khảo sát Nồng độ plumbagin giết chết 100% tế bào RD μg/ml,... hồn tồn, ức chế phân bào hoàn toàn hay ức chế phân bào phần tế bào ung thƣ Plumbagin có tính kháng phân bào mạnh gossypol dòng tế bào khảo sát Nồng độ plumbagin giết chết 100% tế bào RD 2μg/ml,... tiến hành khảo sát hoạt tính kháng phân bào hoạt chất gossypol plumbagin có nguồn gốc từ thuốc dân gian đƣợc biết có khả kháng ung thƣ [11,13] hai dòng tế bào ung thƣ ngƣời điều kiện in vitro PHẦN