Khảo sát thành phần hóa học cao ethyl acetate lá cây me rừng phyllanthus emblica

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA HĨA HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CAO ETHYL ACETATE LÁ CÂY ME RỪNG PHYLLANTHUS EMBLICA Giảng viên hướng dẫn : TS Nguyễn Thị Ánh Tuyết Sinh viên thực : Bùi Thị Hồng Lĩnh Mã số sinh viên : K38.201.062 Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2016 NHẬN XÉT CỦA HỘI ĐỒNG: Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Hồng Lĩnh LỜI MỞ ĐẦU Ngày với phát triển kinh tế xã hội, chất lượng sống ngày cao, người quan tâm đến việc chăm sóc sức khoẻ Thế bệnh tật khơng mà giảm đi, tỷ lệ mắc bệnh tăng lên ngày xuất phát từ nhiều nguyên nhân nhiễm mơi trường, hóa chất thực phẩm, hay di truyền nhiều ngun nhân khác… Trước tình trạng đó, nhiều quốc gia giới tiến hành tìm kiếm loại thuốc có nguồn gốc từ thiên nhiên với hi vọng tìm hợp chất trị bệnh cách an toàn, thân thiện với sức khỏe người Việt Nam nằm vùng khí hậu nhiệt đới nên thừa hưởng nguồn thiên nhiên vô phong phú với nhiều lồi dược liệu q Các hợp chất thiên nhiên thể hoạt tính sinh học đa dạng nên định hướng để nghiên cứu, chiết xuất tìm loại thuốc đường tổng hợp Nhằm đóng góp phần hiểu biết thêm thành phần hóa học thuốc dân gian, thực đề tài “Khảo sát thành phần hóa học cao ethyl acetate me rừng” Me rừng loài mà hầu hết phận rễ, thân, lá, hoa, quả, hạt dùng làm thuốc trị bệnh Rễ me rừng trị viêm ruột, đau bụng ngoài, cao huyết áp, hạt sử dụng để trị hen hay viêm khí quản, dùng làm thuốc trị phù thũng, viêm da mẩn ngứa, eczema hay dùng nấu nước tắm rửa phịng trị bệnh ngồi da, me chế thành thuốc long đờm, hạ nhiệt, lợi niệu, trị tiêu chảy, chống bệnh thiếu vitaminC… Hi vọng với đề tài đóng góp phần nhỏ chứng khoa học có giá trị vào kho dược liệu Y học dân tộc Việt Nam Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Hồng Lĩnh Chương I TỔNG QUAN 1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT Me rừng gọi chùm ruột núi hay du cam tử, ngưu cam tử, dư cam tử Tên khoa học: Phyllanthus emblica Linn Thuộc họ thầu dầu Euphorbiaceae [1] Hình 1.1 Cây me rừng Hình 1.2 Quả me rừng Cây me rừng phân bố chủ yếu khu vực nhiệt đới cận nhiệt đới Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia Malaysia Ở nước ta, me rừng mọc phổ biến đồi trọc, bãi hoang, rừng thưa [1] Me rừng ưa ánh sáng, chịu khô hạn, nhỡ cao 3m, phân nhiều cành nhỏ mềm, có lơng, dài 20cm Hoa nhỏ, cụm hoa thành xim co mọc nách phía dước cành, gồm nhiều hoa đực vài hoa Hoa mọc từ tháng đến tháng 11 Lá xếp thành hai dãy cành nhỏ trông giống kép lông chim, cuống ngắn Lá kèm nhỏ hình ba cạnh Quả hình cầu trước mọng, sau khơ thành nang, hạt hình ba cạnh, màu hồng nhạt[1] 1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH 1.2.1 Dược tính theo y học cổ truyền Ở Việt Nam: Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Hồng Lĩnh Quả có vị chua, ngọt, đắng, tính mát, có tác dụng nhuận phế, hóa đờm, sinh tân, chữa cảm, phát sốt ho, đau cổ họng [1] Rễ có tác dụng trị viêm ruột, đau bụng ngoài, cao huyết áp: ngày dùng 15-20g rễ sắc uống [1] Lá có tác dụng trị lở loét, mẩn ngứa [1] Ở Ấn Độ: Cây me rừng loài thảo dược sử dụng phổ biến Ấn Độ coi nguồn cung cấp vitamin C Quả tươi vị thuốc mát, lợi tiểu, nhuận tràng , khơ dùng chữa lỵ, ỉa chảy Cây có tác dụng hạ men gan, tăng hấp thụ thức ăn, cân lượng acid dày, tăng cường phổi hệ miễn dịch, kích thích nhuận tràng, hỗ trợ hệ tiết niệu, tốt cho da, mắt tóc.[3] 1.2.2 Một số nghiên cứu dược tính + Hoạt tính kháng herpes simplex virus (HSV) loại loại Năm 2011, Yangfei Xiang cộng [16] thử nghiệm khả kháng viêm nhiễm HSV-1 HSV-2 hợp chất 1,2,4,6-tetra-O-galloyl-β-D-glucose (1246TGG) (62) cô lập từ me rừng Kết cho thấy 1246TGG nồng độ 31,70 µM có khả ức chế phát triển virus Herpes dùng điều trị HSV + Tác dụng gây độc tế bào ung thư Năm 2011, Xiaoli Liu với cộng [15] tiến hành nghiên cứu khả điều hòa miễn dịch gây độc tế bào ung thư số hợp chất phenol cô lập từ me rừng Kết cho thấy hai hợp chất isocorilagin (49) geraniin (50) có khả gây độc tế bào ung thư vú (MCF-7) người với IC 50 13,2 80,9 µg/ml Ngồi ra, isocorilagin (49) cịn có tác dụng gây độc tế bào ung thư phổi (HELF) người với IC 50 51,4 µg/ml + Tác dụng phục hồi tổn thương tinh hoàn tác dụng phụ thuốc động kinh Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Hồng Lĩnh Valproic acid sử dụng rộng rãi điều trị bệnh động kinh lại gây tác dụng phụ ảnh hưởng đến khả sinh sản nam giới Theo nghiên cứu vào năm 2015 Sitthichai Iamsaard cộng [9], dịch chiết từ cành me rừng có tác dụng cải thiện nồng độ tinh dịch chuột đực tiêm valproic acid + Hoạt tính kháng khuẩn, kháng oxi hóa Theo nghiên cứu vào năm 2007 Xiaoli Liu cộng [14] nghiên cứu vào năm 2010 Wei Luo cộng [11], số hợp chất phenol 3-O-galloyl mucic acid 1,4-lactone (29), kaempferol 3-β-D-glucopyranoside (46), kaempferol (47), quercetin (48), isocorilagin (49), geraniin (50) isomallotusinin (59), chebulagic acid (60), chebulanin (61) cô lập chủ yếu từ vỏ me rừng có tác dụng kháng khuẩn, kháng oxi hóa hiệu + Tác dụng phục hồi chức gan hạ men gan Theo nghiên cứu Sharma Bhawna cộng thực vào năm 2010 [8], dịch chiết ethanol me rừng có tác dụng hạ men gan, phục hồi chức tế bào gan với liều lượng 75mg/kg/ngày thử nghiệm chuột 1.3 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HOÁ HỌC Các nghiên cứu từ năm 1998 trở trước cho thấy me rừng có hợp chất: zeatin (1), zeatin nucleotide (2), zeatin riboside (3), chebulic acid (4), chebulinic acid (5), corilagin (6), 3,6-di-O-galloyl glucose (7), gallic acid (8), ethyl gallate (9), gluco-gallin (10), ellagic acid (11), gibberellin (A1, A3, A4, A7, A9) (12-16), leucodelphinidin (17), rutin (18), β-sitosterol (19) [4] NH OH N N N HO N H (1) N NH O HO P O OH N OH N N N O OHOH (2) N N H OH O HO OH N N (3) Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Hồng Lĩnh RO OR O OR OR O HO O HO O HOOC O O O COOH OH O HO OH OH HOOC R=Galloyl (5) COOH (4) O OH O HO O HO O O HO OH HO OH R=Galloyl (6) OH OR O OH RO HO RO O OH HO OH R=Galloyl (7) O R2 O HO O OH HO O OH O H OH O H O H OH OR OH R=Galloyl (10) OH (8) R=H (9) R=C2H5 O O HO HO OH H R1 HO O O (11) OH OH OH HO R (13) R=OH (15) R=H (12) R1=R2=OH (14) R1=H, R2=OH (16) R1=R2=H O HO O OH OH OH OH (17) OH H H OR OH O H R=Rha-glu (18) HO H H (19) Từ 1999-2001, Ying-Jun Zhang cộng nghiên cứu thành phần từ phận khác me rừng Kết cho thấy nhóm tác giả lập nhận danh hợp chất sau: phyllaemblic acid (20), phyllaemblicin A-C (21-23), sáu hợp chất phenolic 2-O-galloyl L-malic acid(24), 2-O-galloyl mucic acid (25) ba dẫn xuất methyl ester (26-28), 2-O-galloyl mucic acid 1,4-lactone (29) dẫn xuất methyl ester (30), 5-O-galloyl mucic acid 1,4-lactone (31) dẫn xuất methyl ester (32), 3-O5 Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Hồng Lĩnh galloyl mucic acid 1,4-lactone (33), 3,5-di-O-galloyl mucic acid 1,4-lactone (34), phyllaemblic acid B (35) phyllaemblic C (36), phyllaemblicin D (37), với hai hợp chất mới, 2-carboxylmethylphenol 1-O-β-D-glucopyranoside (38) 2,6-dimethoxy4-(2-hydroxyethyl)phenol 1-O-β-D-glucopyranoside (39), phyllanemblinin A-F (4045) [10, 17, 18, 20, 21] O O HO HO O O O O O OH O OH OH O HO HO O O O O O (21) OH OH (20) O O HO HO O OH HO HO O O HO O HO OH HO O HO OH O O OH (22) HOOC RO H COOH R=Galloyl (24) O OH OH O HO HO O HO O O HO HO O OH O O O O (23) ORH H OH R1OOC COOR2 H OHOHH R=Galloyl (25) R1=R2=H (26) R1=R2=CH3 (27) R1=H, R2=CH3 (28) R1=CH3, R2=H H OR3 OR4 O HO R1O OR2 = allo R 29 G yl, R2=R3=R4=H ( ) = allo (30) R1 G yl, R2=R3=H, R4=CH3 (33) R1=R3=R4=H, R2=G (34) R1=R4=H, R2=R3=G RO H R1O O O O H HO OH R=Galloyl (31) R1=H (32) R1=CH3 O O O O Khóa luận tốt nghiệp OH H R1 Bùi Thị Hồng Lĩnh OH H O O OH HO OR2 COOH O O OR HOOC (35) R1=OH, R2=H (36) R1=R2=H (37) R1=H, R2=Glu OR R=Glu (39) R=Glu (38) OH HO HO OH HO HO OH O HO HO OR O O O O O HO OH O HO H R=Galloyl (41) R=Galloyl (40) O OH OH O O O HO HO O O HO O O O O OR O OG O O O OH OH H HOOC OH HO O COOH OH R=Galloyl (42) OR4 R3O R2O O OR1 OH (43) R1=Galloyl, R2=neoche, R3=R4=H (44) R1=Galloyl, R2=H, R3=neoche, R4=H (45) R1=Galloyl, R2=R3=H, R4=neoche Năm 2007, Xiaoli Lin cộng cô lập hợp chất từ me rừng, bao gồm: kaempferol 3-β-D-glucopyranoside (46), kaempferol (47), quercetin (48), isocorilagin (49) geraniin (50) [14] Cũng vào năm này, hợp chất phyllanthunin (51) cô lập với hợp chất biết: daucosterol (52), stearic acid (53), lauric acid (54), cinnamic acid (55) [2] Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Hồng Lĩnh HO R OH HO O HO OH O O HO O HO HO O OH O OH HO OH O O HO HO OH HO (46) R=Galloyl (49) (47) R=H (48) R=OH OH HO HO OR OH OH O O HO O OH HO OH O OR O O O OH OR OH O O O O O O O H O HO OH O HO OHOH O OH O O O O HO OH O HO OH OH O OH R=Galloyl (51) R=Galloyl (50) H O OH H HO HO O OH H R O COOH (53) R=n-C17H35 (54) R=n-C11H23 (52) OH (55) Năm 2008, S K EL-DESOUKY cộng cô lập hợp chất acylated apigenin glucoside (apigenin-7-O-(6”-butyryl-β-glucopyranoside)) (56) hợp chất khác 1,2,3,4,6-penta-O-galloyglucose (57) Xiaoli Liu cộng cô lập thêm quercetin-3-O-β-D-glucopyranoside (58) [7, 13] LỜI CẢM ƠN Đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới cô Nguyễn Thị Ánh Tuyết, người theo sát tận tình truyền đạt cho em kiến thức chun mơn kinh nghiệm nghiên cứu suốt trình thực đề tài khóa luận tốt nghiệp Cảm ơn ln nhắc nhở, động viên nhiệt tình hướng dẫn, hỗ trợ chúng em vượt qua khó khăn ban đầu hồn thành tốt cơng việc Cơ gương sáng niềm đam mê tận tụy cống hiến cho khoa học Em xin gửi lời cảm ơn tới thầy phịng Hợp chất thiên nhiên tận tình bảo giúp đỡ, tạo điều kiện cho chúng em học tập, nghiên cứu Và lời cảm ơn chân thành em xin gửi tới quý thầy cô trường Đại học Sư Phạm thành phố Hồ Chí Minh trực tiếp giảng dạy, truyền đạt kiến thức bổ ích cho chúng em Đó tảng bản, hành trang vơ q giá để chúng em trở thành nhà giáo tương lai có đủ đức đủ tài phục vụ cống hiến cho giáo dục Việt Nam Em xin cảm ơn gia đình ln bên cạnh em lúc khó khăn, động viên tinh thần giúp em hồn thành tốt khóa luận Lời cảm ơn cuối em xin gửi tới bạn phòng hợp chất thiên nhiên kề vai sát cánh, học tập, nghiên cứu giúp đỡ em nhiều qua trình làm đề tài sống Một lần em xin chân thành cảm ơn! TPHCM ngày 14 tháng năm 2016 Bùi Thị Hồng Lĩnh Khóa luận tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ DANH MỤC CÁC HÌNH LỜI MỞ ĐẦU CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1.ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT 1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH 1.2.1 Dược tính theo y học cổ truyền 1.2.2 Một số nghiên cứu dược tính 1.3 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CHƯƠNG THỰC NGHIỆM 12 2.1 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 12 2.1.1 Hóa chất 12 2.1.2 Thiết bị 12 2.1.3 Phương pháp tiến hành 12 2.1.3.1 Phương pháp phân lập hợp chất 12 2.1.3.2 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học hợp chất 12 2.2 NGUYÊN LIỆU 13 2.2.1 Thu hái nguyên liệu 13 2.2.2 Xử lí mẫu nguyên liệu 13 2.3 ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO 13 2.4 CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CAO ETHYL ACETATE 14 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18 3.1 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT PAL3 18 3.2 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT PAL4 19 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 21 4.1 KẾT LUẬN 21 4.2 ĐỀ XUẤT 21 TÀI LIỆU THAM KHẢO Bùi Thị Hồng Lĩnh Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu, chữ viết tắt H-NMR Tiếng Anh Proton (1) Nuclear Magnetic Resonance 13 Carbon (13) Nuclear Magnetic Resonance HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation HMBC Heteronuclear Multiple Bond Coherence d dd S T m δ J ppm RP-18 Rf Ac AcOH EA C Me H SKC SKLM G mg µM MHz Hz Doublet Doublet-doublet Singlet Triplet Mutilet Chemical shift Coupling constant Part per million Reversed Phase-18 Retention factor Acetone Acetic acid Ethyl Acetate Chloroform Methanol n-Hexane C-NMR Gam Miligam Micro Mol Mega Hertz Hertz Tiếng Việt Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1) Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon (13) Phổ tương tác dị hạt nhân qua liên kết Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết Mũi đôi Mũi đôi đôi Mũi đơn Mũi ba Mũi đa Độ chuyển dịch hoá học Hằng số ghép spin Một phần triệu Pha đảo C-18 Axeton Axit axetic Etyl acetat Cloroform Metanol Hexan Sắc ký cột Sắc ký lớp mỏng Bùi Thị Hồng Lĩnh Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Sắc kí cột silica gel cao ethyl acetate me (143,1g) 15 Bảng 2.2 Sắc kí cột sillica gel phân đoạn EA1 (16,50 g) 15 Bảng 2.3 Sắc kí cột sillica gel phân đoạn EA1.9 (9,73 g) 16 Bảng 2.4 Sắc kí cột sillica gel phân đoạn EA4 (33,40 g) 16 Bảng 2.5 Sắc kí cột silica gel phân đoạn EA4.7 17 Bảng 3.1 Dữ liệu phổ hợp chất PAL3 19 Bảng 3.2 Dữ liệu phổ hợp chất PAL4 20 Bùi Thị Hồng Lĩnh Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Quy trình điều chế loại cao 14 Bùi Thị Hồng Lĩnh Khóa luận tốt nghiệp DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cây me rừng Hình 1.2 Quả me rừng Hình 3.1 Một số tương quan HMBC PAL4 20 Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Hồng Lĩnh PHỤ LỤC Phụ lục Phổ 1H- NMR hợp chất PAL3 (Acetone d ) Phụ lục Phổ 13C –NMR hợp chất PAL3 (Acetone d ) Phụ lục 3a Phổ 1H- NMR hợp chất PAL4 (MeOD) Phụ lục 3b Phổ 1H- NMR dãn rộng hợp chất PAL4 (MeOD) Phụ lục Phổ 13C –NMR hợp chất PAL4 (MeOD) Phụ lục 5a Phổ HSQC hợp chất PAL4 (MeOD) Phụ lục 5b Phổ HSQC dãn rộng hợp chất PAL4 (MeOD) Phụ lục Phổ HMBC hợp chất PAL4 (MeOD) ... Nhiều vết Khảo sát Chưa khảo sát Chưa khảo sát Chưa khảo sát Chưa khảo sát Chưa khảo sát Chưa khảo sát Chưa khảo sát Khảo sát Chưa khảo sát EA1.1 C EA1.2 C EA1.3 C EA1.4 C : Me 9:1 EA1.5 C : Me 9:1... Kéo vệt Có vết tách rõ Kéo vệt Ghi Đã khảo sát Chưa khảo sát Chưa khảo sát Chưa khảo sát Đã khảo sát Chưa khảo sát Khảo sát Chưa khảo sát Khóa luận tốt nghiệp Bùi Thị Hồng Lĩnh Bảng 2.5 Sắc kí... 1,62 Nhiều vết Khảo sát Đã khảo sát Đã khảo sát Chưa khảo sát Chưa khảo sát Khảo sát thu PAL3 Chưa khảo sát STT Phân đoạn 2.4.2 EA1.9.7 DCM :Me 9:1 Ghi chú: DCM (dichloromethane) SẮC KÍ CỘT SILICAGEL