Đánh giá vai trò bảo vệ vi sinh vật trong đường tiêu hóa của vi nang đông tụ alginat chitosan bao đa lớp

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HẰNG ĐÁNH GIÁ VAI TRÒ BẢO VỆ VI SINH VẬT TRONG ĐƯỜNG TIÊU HĨA CỦA VI NANG ĐƠNG TỤ ALGINAT – CHITOSAN BAO ĐA LỚP KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2020 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HẰNG MÃ SINH VIÊN: 1501143 ĐÁNH GIÁ VAI TRÒ BẢO VỆ VI SINH VẬT TRONG ĐƯỜNG TIÊU HĨA CỦA VI NANG ĐƠNG TỤ ALGINAT – CHITOSAN BAO ĐA LỚP KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS TS Đàm Thanh Xuân Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp Dược HÀ NỘI - 2020 LỜI CẢM ƠN Khóa luận thực hoàn thành tổ Vi sinh - Bộ môn Công nghiệp Dược Trong suốt thời gian thực khóa luận, tơi nhận nhiều quan tâm, giúp đỡ thầy cơ, bạn bè gia đình Với tất kính trọng lịng biết ơn, xin gửi lời cảm ơn đến PGS TS Đàm Thanh Xn, người thầy ln tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ từ ngày tơi hồn thành khóa luận Bên cạnh đó, tơi xin cảm ơn thầy giáo anh chị kỹ thuật viên môn Công nghiệp Dược Viện Công Nghệ Dược Phẩm Quốc Gia tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài Tôi xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu tồn thể thầy giáo trường Đại học Dược Hà Nội dạy dỗ, truyền đạt kiến thức cho thời gian học tập trường Cuối cùng, xin bày tỏ cảm ơn chân thành tới gia đình, người thân bạn bè ln động viên, ủng hộ tơi q trình học tập sống Hà Nội, ngày 22 tháng 06 năm 2020 Sinh viên Nguyễn Thị Hằng MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ .1 PHẦN TỔNG QUAN 1.1 Đại cương Probiotic 1.1.1 Khái niệm Probiotic 1.1.2 Các chủng probiotic phổ biến 1.1.3 Vai trò Probiotic với sức khỏe người ứng dụng 1.1.4 Loài Lactobacillus acidophilus .5 1.1.5 Xu hướng dạng chế phẩm chứa probiotic .6 1.2 Tổng quan vi nang 1.2.1 Khái niệm 1.2.2 Đặc điểm vi nang .8 1.2.3 Ưu điểm nhược điểm vi nang 1.2.4 Các phương pháp tạo vi nang .10 1.2.5 Các nguyên liệu sử dụng để tạo vi nang .14 1.2.6 Kĩ thuật bao vi nang 16 1.2.7 Một số nghiên cứu tạo vi nang cải thiện khả sống sót VSV dịch tiêu hóa mơ 18 PHẦN NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .20 2.1 Nguyên liệu thiết bị 20 2.1.1 Chủng VSV 20 2.1.2 Hóa chất, thiết bị dụng cụ 20 2.1.3 Các môi trường sử dụng nghiên cứu 21 2.1.4 Các dung dịch sử dụng nghiên cứu .21 2.2 Nội dung nghiên cứu 22 2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chitosan calci clorid đến trình tạo vi nang 22 2.2.2 Đánh giá khả bảo vệ giải phóng VSV mơi trường dịch tiêu hóa mơ vi nang đông tụ alginat – chitosan bao đa lớp 23 2.3 Phương pháp nghiên cứu 23 2.3.1 Phương pháp tiệt khuẩn [2] 23 2.3.2 Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào 23 2.3.3 Phương pháp tạo vi nang nhân alginat [6] 24 2.3.4 Phương pháp bao vi nang [6] 24 2.3.5 Phương pháp đông khô 25 2.3.6 Phương pháp pha loãng liên tục xác định số lượng VSV [2] .25 2.3.7 Phương pháp phá hạt vi nang xác định số lượng VSV 26 2.3.8 Phương pháp xác định hình ảnh vi nang .26 2.3.9 Phương pháp định tính tinh bột thuốc thử Lugol 26 2.3.10 Phương pháp đánh giá khả bảo vệ giải phóng VSV mơi trường dịch tiêu hóa mơ .27 PHẦN THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 29 3.1 Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chitosan calci clorid đến trình tạo vi nang 29 3.1.1 Khảo sát nồng độ chitosan ảnh hưởng đến khả giữ cấu trúc vi nang alginat – tinh bột – chitosan dịch tiêu hóa mơ 29 3.1.2 Khảo sát nồng độ calci clorid ảnh hưởng đến trình tạo vi nang nhân bao vi nang 32 3.2 Đánh giá khả bảo vệ giải phóng VSV mơi trường dịch tiêu hóa mơ vi nang đơng tụ alginat – chitosan bao đa lớp 38 3.2.1 Tiến hành tạo vi nang alginat – chitosan bao đa lớp chứa VSV 38 3.2.2 Đánh giá khả bảo vệ giải phóng VSV mơi trường dịch tiêu hóa mơ vi nang đơng tụ alginat – chitosan bao đa lớp 40 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 46 4.1 Kết luận 46 4.2 Đề xuất 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ATCC : Trung tâm giữ giống quốc gia Mỹ (American Type Culture Collection) B bifidum : Bifidobacterium bifidum B longum : Bifidobacterium longum CFU : Số đơn vị khuẩn lạc (Colony - Forming Units) CTS : Chitosan FAO : Tổ chức Lương thực Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (Food and Agriculture Organization of the United Nations) kl/tt : Khối lượng/thể tích L casei : Lactobacillus casei L acidophilus : Lactobacillus acidophilus LAB : Vi khuẩn lactic (Lactic acid bacterium) LbL : Kĩ thuật bao lớp (Layer by Layer) MRS : Môi trường nuôi cấy vi khuẩn (de Man, Rogosa, Sharpe) MT : Môi trường SGF : Dịch dày mô (Simulated Gastric Fluid) SIF : Dịch ruột mô (Simulated Intestinal Fluid) TB : Tinh bột VK : Vi khuẩn VSV : Vi sinh vật WHO : Tổ chức y tế giới (World Health Organization) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: So sánh phương pháp tạo vi nang [47] 14 Bảng 2.1: Các nguyên liệu hóa chất sử dụng 20 Bảng 2.2: Các thiết bị sử dụng 20 Bảng 3.1: Các nồng độ chitosan cần khảo sát .29 Bảng 3.2: Thời gian bắt đầu xuất vết nứt thời gian rã hoàn toàn vi nang ủ môi trường dịch ruột mô 32 Bảng 3.3: Kết trình tạo vi nang đánh giá khả rã với hai mẫu vi nang sử dụng calci clorid nồng độ 2% 10% 34 Bảng 3.4: Số lượng VSV mẫu vi nang bao trước sau ủ SGF 41 Bảng 3.5: Số lượng VSV giải phóng sống sót sau ủ dịch tiêu hóa mơ thời điểm khác 43 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1: Hình ảnh vi khuẩn Lactobacillus acidophilus quan sát kính hiển vi điện tử kính hiển vi thường [42] .5 Hình 1.2: loại vi nang chứa VSV thường gặp [46] Hình 1.3: Quá trình tạo vi nang probiotic phương pháp tách pha đơng tụ [46] 11 Hình 1.4: Q trình tạo vi nang phương pháp phun sấy [46] .12 Hình 1.5: Mơ tả q trình tạo vi nang chứa VSV phương pháp tạo nhũ tương [46] .13 Hình 1.6: Cấu trúc Alginat [40] 14 Hình 1.7: Cấu trúc hóa học Chitosan Chitin [49] 16 Hình 1.8: Sơ đồ sử dụng kĩ thuật LbL tạo màng bao đa lớp [33] 17 Hình 3.1: Ảnh chụp camera thường mẫu vi nang AC-0, AC-0,5, AC-3 AC5 sau đông khô .31 Hình 3.2: Kết thử định tính tinh bột dịch ủ SGF sau 60 phút mẫu vi nang AC-0, AC-0,5, AC-3 AC-5 (theo thứ tự từ trái qua phải) 31 Hình 3.3: Hình ảnh vi nang Agl-TB-CTS tạo với dung dịch gel hóa calci clorid 2% 35 Hình 3.4: Hình ảnh vi nang Agl-TB-CTS tạo với dung dịch gel hóa calci clorid 10% 35 Hình 3.5: Sơ đồ quy trình tạo vi nang bao với nồng độ CaCl2 thay đổi 36 Hình 3.6: Hình ảnh mẫu vi nang bao sau đông khô 37 Hình 3.7: Sơ đồ bước tạo vi nang alginat – chitosan bao đa lớp chứa L acidophilus .40 Hình 3.8: Biểu đồ biểu diễn số lượng VSV vi nang bao trước sau ủ SGF .41 Hình 3.9: Biểu đồ biểu diễn số lượng VSV sống sót dịch tiêu hóa mơ thời điểm khác 44 ĐẶT VẤN ĐỀ Probiotic biết đến nhóm vi sinh vật mang lại nhiều lợi ích cho người Các vi sinh vật (VSV) sản xuất dạng chế phẩm probiotic bổ sung vào thức ăn Sự có mặt probiotic đường tiêu hóa có tác dụng cạnh tranh, ức chế loại trừ VSV có hại đường ruột, trì hệ vi sinh đường ruột trạng thái cân [4] Tiềm điều trị probiotic có ý nghĩa chúng cung cấp vào thể với lượng đủ lớn đảm bảo ổn định hoạt tính [11] Tuy nhiên, đưa vào thể theo đường uống có vấn đề thường gặp phải: (i) tỉ lệ sống sót thấp qua dày; (ii) số lượng VSV tiếp cận đích tác dụng thấp [25] Thực tế, có nhiều chủng probiotic phát huy tác dụng tối ưu đưa đến vị trí cuối ruột non – đầu đại tràng Vi nang hóa sử dụng alginat – chitosan phương pháp sử dụng rộng rãi nhằm bao gói vi sinh vật tăng cường khả sống sót qua vùng pH thấp dày đồng thời đưa vi sinh vật đến vị trí thích hợp đường ruột [13] Xu hướng bào chế vi nang có khả bảo vệ vi sinh vật probiotic đồng thời kiểm sốt giải phóng quan tâm Những nghiên cứu trước cho kết khả quan khả bao gói bảo vệ vi sinh vật sử dụng alginat – tinh bột – chitosan [6], [9] Tiếp nối cho hướng tiềm nghiên cứu này, đề tài “Đánh giá vai trò bảo vệ vi sinh vật đường tiêu hóa vi nang đơng tụ alginat – chitosan bao đa lớp” tiến hành với mục tiêu sau: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chitosan calci clorid đến trình tạo vi nang Đánh giá khả bảo vệ giải phóng VSV mơi trường dịch tiêu hóa mơ vi nang đông tụ alginat – chitosan bao đa lớp PHẦN TỔNG QUAN 1.1 Đại cương Probiotic 1.1.1 Khái niệm Probiotic Thuật ngữ “probiotic” bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp có nghĩa “dành cho sống” có số ý nghĩa khác ngày “Probiotic” xuất phát từ “biotic” tiếng Hy Lạp có nghĩa đời sống “pro” thân thiện, từ tên gọi probiotic hiểu thân thiện với đời sống Ngay từ năm đầu kỉ XX, khái niệm probiotic đề cập tới sách “Essais optimistes” (1907) Elie Metchnikoff (1845-1916) VSV có lợi có khả chống lại VSV xấu đường ruột giúp người kéo dài tuổi thọ Nhưng phải đến năm 1965, thuật ngữ Lilley Stillwell sử dụng lần để mô tả chất tiết vi sinh vật có tác dụng kích thích phát triển VSV khác [23] Năm 1989, Fuller, để chất vi sinh probiotic, định nghĩa lại từ bổ sung thức ăn vi sinh sống, mà tác động có lợi đến sức khỏe vật chủ cách cân hệ vi sinh đường ruột [19] Tiếp nối định nghĩa đưa cá nhân nhà khoa học, năm 2002 Tổ chức Y tế giới (WHO) tổ chức Nông lương giới (FAO) phát triển đưa khái niệm ngắn gọn, hoàn chỉnh probiotic sau: “Probiotic vi sinh vật sống mà đưa vào thể với lượng đủ lớn đem lại tác động có lợi cho sức khỏe vật chủ” [20] Khái niệm trì Hiệp hội khoa học quốc tế chế phẩm sinh học Prebiotic (ISAPP) sử dụng hầu hết ấn phẩm khoa học 1.1.2 Các chủng probiotic phổ biến Nghiên cứu hai thập kỉ qua cung cấp chứng cho thấy việc bổ sung probiotic giúp tối ưu hóa hệ VSV đường ruột, ngăn ngừa điều trị loạt bệnh [27] Tuy nhiên, khơng phải tất VSV có lợi probiotic Theo FAO WHO, VSV sử dụng làm probiotic phải có đặc tính: (i) Có nguồn gốc từ người, có khả bám chặt vào niêm mạc ruột ngăn không cho vi khuẩn gây bệnh bám; (ii) Chống chịu tác động dịch dày muối mật để đến ruột Tại ruột, probiotic phải phóng thích tốt sản sinh nhanh chóng để phát huy tối đa tác dụng cân hệ vi sinh vật; (iii) Có khả thật kháng vi khuẩn gây bệnh; (iiii) Được toàn Tiến hành đếm VSV mẫu tính tốn kết theo phương pháp nêu mục 2.3.6 2.3.10 Kết quả: Kết trình bày bảng 3.4 Bảng 3.4: Số lượng VSV mẫu vi nang bao trước sau ủ SGF Số lượng VSV (log CFU/g) Thời gian ủ SGF Vi nang Vi nang Vi nang AC3-AC AC3-ACA AC3-ACAC (trước ủ) 9,49 9,28 9,27 8,54 8,61 8,63 89,99% 92,79% 93,09% Phần trăm VSV bảo vệ Nhận xét Số lượng L acidophilus mẫu vi nang sau đông khô đạt log CFU/g Sau lắc dịch dày mô (SGF), tỷ lệ VSV cịn sống sót vi nang đạt mức cao Cụ thể, vi nang bao hai lớp alginat cho tỷ lệ bảo vệ VSV 90%, cao so với vi nang bao lớp alginat Số lượng VSV (log CFU/g) 12 10 9.49 9.28 9.27 8.61 8.54 8.63 AC3-AC AC3-ACA Trước ủ SGF AC3-ACAC Sau ủ SGF Hình 3.8: Biểu đồ biểu diễn số lượng VSV vi nang bao trước sau ủ SGF Bàn luận Số lượng VSV bao mẫu vi nang AC3-AC, AC3-ACA, AC3ACAC sau đông khô 9,49, 9,28 9,27 log CFU/g, đạt log 41 CFU/g đáp ứng yêu cầu chế phẩm probiotic FAO/WHO [20] Tuy nhiên, với lượng sinh khối vi sinh vật ban đầu, vi nang bao lớp alginat/chitosan (AC3-AC) cho kết bao gói vi sinh vật tốt (9,49 log CFU/g) so với mẫu bao hai lớp alginat/chitosan Điều trình bao lớp alginat thứ 2, VSV vi nang bị thất bên ngồi hay bị chết trình bao ngâm dịch gel hóa kéo dài Dẫn đến kết số lượng VSV vi nang sau đông khô mẫu AC3-AC cao hai mẫu lại tương đương Các mẫu vi nang bao cho kết bảo vệ VSV dịch dày mô với tỷ lệ sống sót cao Cơ chế bảo vệ VSV dịch dày lý giải sau: trình tạo vi nang, ion Ca2+ liên kết với nhóm –COO- đơn vị polyguluronat alginat tạo thành mơ hình “hộp trứng” chứa bảo vệ VSV đó; ủ pH dày, ion Ca2+ trao đổi với ion H+ môi trường acid, làm ion Ca2+ khớp vào khoảng trống theo mơ hình “hộp trứng”, làm VSV thoát khỏi vi nang bị ảnh hưởng trực tiếp acid dày Vi nang có sử dụng lớp màng bao bổ sung lớp áo polycation bên tạo rào cản ion H+ mơi trường acid Do làm giảm tác động tới phức hợp calci alginat lõi, bảo vệ VSV môi trường acid Theo kết đếm số lượng VSV bảng 3.4, thấy khả bao gói VSV vi nang AC3-AC tốt so với hai mẫu bao hai lớp alginat, nhiên, tỷ lệ VSV bảo vệ sau ủ SGF lại Điều lý giải việc tồn màng bảo vệ alginat/chitosan đa lớp làm cản trở thấm ion H+ từ môi trường acid vào vi nang nhân tốt so với vi nang bao lớp alginat/chitosan, dó tỷ lệ VSV bị ngồi Một nghiên cứu đưa kết tương tự, môi trường pH 1,5 lớp màng bao alginat đa lớp làm gia tăng đáng kể số lượng VSV sống sót sau Cụ thể, số lượng L acidophilus vi nang calci alginat đạt 2,3±0,2 x 105 CFU/g, vi nang calci alginat bao thêm lớp alginat bên đạt 3,9±0,1 x 107 CFU/g vi nang calci alginat bao hai lớp alginat bên đạt 1,7±0,2 x 108 CFU/g [38] Như vậy, việc gia tăng số lượng lớp bao alginat có hay khơng có chitosan bao phủ bên ngồi làm gia tăng khả bảo vệ VSV dịch dày mô so với bao lớp alginat/chitosan Tuy nhiên, tỷ lệ VSV sống sót sau ủ SGF vi nang AC3-ACA AC3-ACAC khác biệt lớn (lần lượt 92,79% 42 93,09%), qua thấy vai trị bảo vệ VSV dịch dày mô chitosan chưa rõ ràng 3.2.2.2 Đánh giá khả giải phóng VSV dịch tiêu hóa mơ ❖ Xác định số lượng VSV giải phóng SGF sau dịch tiêu hóa mơ Ủ 1,00 g vi nang loại vào 100 ml dung dịch SGF pha mục 2.1.4 tiệt khuẩn Tiến hành ủ trong máy lắc tốc độ 75 vòng/phút, nhiệt độ 37oC Sau thời gian ủ, hút xác 1,00 ml dịch, xác định số lượng L acidophilus sống sót phương pháp pha lỗng liên tục (nêu mục 2.3.6) Tách vi nang khỏi dịch acid, rửa nước cất tiệt khuẩn chuyển sang môi trường SIF ❖ Xác định số lượng VSV giải phóng dịch SIF sau ủ sau môi trường tiêu hóa mơ Vi nang sau ủ SGF chuyển vào SIF tiếp tục lắc với tốc độ 75 vòng/phút, nhiệt độ 37oC Tại thời điểm sau sau SIF (tương đương với sau sau dịch tiêu hóa mơ phỏng) hút xác 1,00 ml dịch, xác định số lượng L acidophilus sống sót phương pháp pha loãng liên tục (nêu mục 2.3.6) Lặp lại thí nghiệm lần, lấy kết trung bình Kết quả: Kết đếm số lượng VSV giải phóng sống sót thời điểm dịch tiêu hóa mơ trình bày bảng 3.5 Bảng 3.5: Số lượng VSV giải phóng sống sót sau ủ dịch tiêu hóa mơ thời điểm khác Thời gian ủ dịch tiêu Số lượng VSV (log CFU/g) Vi nang Vi nang Vi nang AC3-AC AC3-ACA AC3-ACAC Trong SGF sau - - - Trong SIF sau 6,72 6,01 5,68 Trong SIF sau 7,93 8,49 8,58 hóa mơ Kí hiệu (-): số lượng VSV g mẫu ngưỡng phát phương pháp phát 43 Nhận xét Tại thời điểm sau ủ dịch dày mô (SGF), ba mẫu vi nang cho thấy khơng có thất VSV ngồi mơi trường Tại thời điểm sau ủ với dịch ruột mô (SIF) (tương đương ủ dịch tiêu hóa mơ phỏng), số lượng VSV giải phóng vi nang AC3-ACAC thấp (5,68 log CFU/g) Cho đến thời điểm ủ SIF (tương đương ủ dịch tiêu hóa mơ phỏng) số lượng VSV giải phóng cịn sống sót ba mẫu vi nang tăng so với thời điểm ủ SIF cho kết lớn log CFU/g, đáp ứng yêu cầu số lượng probiotic tối thiểu đích để có tác dụng với sức khỏe ( – log CFU/g theo tiêu chuẩn FAO/WHO chế phẩm probiotic) Số lượng VSV (log CFU/g) 10 1 giờ Thời gian vi nang đường tiêu hóa AC3-AC AC3-ACA AC3-ACAC Hình 3.9: Biểu đồ biểu diễn số lượng VSV sống sót dịch tiêu hóa mô thời điểm khác Bàn luận Trong môi trường dịch dày mô (SGF), ba mẫu vi nang bao cho kết VSV thất ngồi lượng VSV q không đạt đến giới hạn phát phương pháp sau Theo công bố trước đây, L acidophilus tự bị tiêu diệt hồn toàn pH sau [21] Do đó, lượng VSV ngồi mơi trường acid bị tiêu diệt phần hoàn toàn nên phát 44 Trong môi trường dịch ruột mô (SIF), sau ủ, mẫu vi nang bao lớp alginat AC3-ACA AC3-ACAC cho số lượng vi sinh vật giải phóng nhiên thời điểm ủ SIF số lượng VSV giải phóng hai mẫu lại nhiều so với mẫu AC3-AC (bao lớp alginat/chitosan) Thể đồ thị đường thẳng ứng với mẫu vi nang AC3-ACA AC3-ACAC có độ dốc lớn đường biểu diễn số lượng VSV giải phóng vi nang AC3-AC khoảng thời gian từ – dịch tiêu hóa mơ (Hình 3.9) Điều chứng tỏ, vi nang bao lớp alginat (có khơng có chitosan lớp ngồi cùng) có khả giữ VSV lâu so với vi nang bao lớp alginat/chitosan Đồng thời, sau giờ, vi nang bao đa lớp có khả giữ vận chuyển VSV đến đích xa đường tiêu hóa So sánh hai mẫu vi nang bao lớp alginat, thời điểm dịch tiêu hóa mơ phỏng, số lượng VSV giải phóng vi nang AC3-ACA 6,01 log CFU/g 8,49 log CFU/g vi nang AC3-ACAC 5,68 log CFU/g 8,58 log CFU/g Có thể thấy tốc độ giải phóng VSV vi nang AC3-ACAC đầu chậm so với vi nang AC3-ACA, giai đoạn từ – ủ với dịch tiêu hóa mơ tốc độ giải phóng VSV vi nang AC3-ACAC lại nhanh so với vi nang AC3-ACA Điều giải thích chitosan khơng tan nước pH lớn 5,4 [26] pH 6,8 ban đầu làm cản trở giải phóng VSV khỏi vi nang Sau đó, vi nang hút nước vào bên trương nở hoàn toàn rã ra, vai trị chitosan khơng cịn Một điều rõ ràng là, mẫu vi nang bao alginat/chitosan có khả bảo vệ tốt VSV dịch tiêu hóa mơ Về khả giải phóng VSV thấy thời điểm dịch tiêu hóa mơ phỏng, mẫu vi nang bao lớp alginat/chitosan cho số lượng VSV giải phóng cao (6,72 log CFU/g) Đối với vi nang bao lớp alginat (đặc biệt vi nang có chitosan lớp bao cuối cùng) có số lượng VSV giải phóng thấp kỳ vọng vi nang có khả lưu giữ VSV lâu mơi trường tiêu hóa mơ phỏng, giúp đưa VSV xa hệ tiêu hóa Như vậy, vi nang bao alginat/chitosan đa lớp giúp gia tăng khả bảo vệ lưu giữ VSV ủ dịch tiêu hóa mơ so với bao lớp alginat/chitosan Tuy vai trò bảo vệ VSV dịch dày mô chitosan chưa rõ ràng việc sử dụng chitosan đem lại kì vọng định việc lưu giữ hướng giải phóng VSV vi nang alginat – chitosan bao đa lớp 45 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1 Kết luận Sau thời gian nghiên cứu, đề tài đạt mục tiêu đề có số kết luận sau: Đã khảo sát lựa chọn thông số thành phần công thức để tạo vi nang nhân tối ưu bao gồm: natri alginat 3%, tinh bột 10% gel hóa dung dịch calci clorid 2% chitosan 3% Nhằm gia tăng khả bảo vệ hướng giải phóng VSV vi nang nhân bao đa lớp sử dụng hỗn dịch natri alginat 0,5% tinh bột 10% với dịch gel hóa dung dịch calci clorid 2% chitosan 3% Trong q trình bao có tiến hành khuấy trộn với tốc độ 100 vòng/phút giúp màng bao bám chặt Đã đánh giá khả bảo vệ giải phóng VSV vi nang đông tụ alginat – chitosan bao đa lớp dịch tiêu hóa mơ Kết cho thấy: + Việc gia tăng số lượng lớp bao alginat có hay khơng có chitosan bao phủ bên ngồi làm gia tăng khả bảo vệ VSV dịch dày mô so với bao lớp alginat/chitosan Cụ thể, sau ủ pH 1,2 tỷ lệ VSV bảo vệ vi nang bao đa lớp 90% số lượng VSV sống sót đạt log CFU/g Tuy nhiên, vai trò bảo vệ VSV khỏi tác động từ acid chitosan chưa rõ ràng + Màng bao alginat, chitosan đa lớp giúp kéo dài thời gian ổn định cấu trúc vi nang môi trường dịch ruột mô Sau giờ, số lượng VSV giải phóng vi nang bao lớp alginat (có chitosan bao phủ bên ngoài) thấp mặt khác mẫu vi nang cho kết giải phóng VSV thời điểm cao Kết cho thấy chitosan có vai trị việc bảo vệ, lưu giữ VSV môi trường dịch ruột mô vi nang bao đa lớp alginat – chitosan có khả vận chuyển VSV đến vị trí xa hệ tiêu hóa 4.2 Đề xuất Bên cạnh kết đạt được, thời gian có hạn, đề tài xin đưa số đề xuất nhằm hồn thiện nâng cao tính ứng dụng thực tế sau: Tiếp tục đánh giá cấu trúc bên vi nang độ ổn định trình bảo quản vi nang alginat – chitosan bao đa lớp 46 Cải tiến đánh giá khả bảo vệ giải phóng VSV vi nang dịch tiêu hóa mơ cách: đảm bảo kín khí lắc, thêm số enzym mô dịch dày dịch ruột 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Bộ môn Bào chế - Đại học Dược Hà Nội (2005), Một số chuyên đề bào chế đại, Nhà xuất Y học, Hà Nội, tr 112-128 Bộ Y Tế (2017), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất Y học Nguyễn Lân Dũng (2000), Vi sinh vật học, Nhà xuất Giáo dục, Hà Nội, tr 221228 Trần Cát Đông (2015), Xu hướng nghiên cứu ứng dụng chủng lợi khuẩn probiotic y học thực phẩm chức năng, Trung tâm Thông tin Khoa học Cơng nghệ TP HCM, TP Hồ Chí Minh Nguyễn Trọng Hiệp, Bùi Tùng Hiệp (2009), "Bàn việc đảm bảo khả sống sót vi sinh vật sản phẩm probiotic", Tạp chí Dược học, (393), tr 2-5 Võ Thị Thúy Ngân (2019), Nghiên cứu tạo vi nang Alginat - Chitosan hướng bảo vệ giải phóng Lactobacillus acidophilus mơi trường tiêu hóa mơ phỏng, Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội Lê Quan Nghiệm, Huỳnh Văn Hóa (2007), Bào chế sinh dược học, Nhà xuất Giáo dục, Hà Nội Đàm Thanh Xuân cộng (2016), "Nghiên cứu bào chế vi nang probiotics phương pháp đơng tụ", Tạp chí Dược học, 56(5), tr 61-65 Đàm Thanh Xuân cộng (2017), "Nghiên cứu khả bảo vệ Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 vi nang alginat-tinh bột bao chitosan", Tạp chí Dược học, 57(4), tr 10-11 Tài liệu tiếng Anh 10 Amara AA, Shibl A (2015), "Role of Probiotics in health improvement, infection control and disease treatment and management", Saudi pharmaceutical journal, 23(2), pp 107-114 11 Anal Anil Kumar, Singh Harjinder (2007), "Recent advances in microencapsulation of probiotics for industrial applications and targeted delivery", Trends in Food Science & Technology, 18(5), pp 240-251 12 Ansari Fereshteh, Pourjafar Hadi, et al (2017), "Effect of Eudragit S100 nanoparticles and alginate chitosan encapsulation on the viability of Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus rhamnosus", AMB Express, 7(1), pp 144 13 Anselmo Aaron C, McHugh Kevin J, et al (2016), "Layer‐by‐layer encapsulation of probiotics for delivery to the microbiome", Advanced Materials, 28(43), pp 9486-9490 14 Borges Joao, Mano Joao F (2014), "Molecular interactions driving the layer-bylayer assembly of multilayers", Chemical reviews, 114(18), pp 8883-8942 15 Bull Matthew, Plummer Sue, et al (2013), "The life history of Lactobacillus acidophilus as a probiotic: a tale of revisionary taxonomy, misidentification and commercial success", FEMS microbiology letters, 349(2), pp 77-87 16 Cremonini Filippo, Di Caro Simona, et al (2002), "Meta‐analysis: the effect of probiotic administration on antibiotic‐associated diarrhoea", Alimentary pharmacology & therapeutics, 16(8), pp 1461-1467 17 D'souza Aloysius L, Rajkumar Chakravarthi, et al (2002), "Probiotics in prevention of antibiotic associated diarrhoea: meta-analysis", Bmj, 324(7350), pp 1361 18 de Araújo Etchepare Mariana, Raddatz Greice Carine, et al (2016), "Effect of resistant starch and chitosan on survival of Lactobacillus acidophilus microencapsulated with sodium alginate", LWT-Food Science and Technology, 65, pp 511-517 19 FAO/WHO (2006), Probiotics in food: Health and nutritional properties and guidelines for evaluation 20 FAO/WHO (2002), Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food, Report of a Joint FAO/WHO Working Group on Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food, FAO, London Ontario, Canada, pp 1-8 21 Favaro-Trindade CS, Grosso CRF (2002), "Microencapsulation of L acidophilus (La-05) and B lactis (Bb-12) and evaluation of their survival at the pH values of the stomach and in bile", Journal of microencapsulation, 19(4), pp 485-494 22 Fijan Sabina (2014), "Microorganisms with claimed probiotic properties: an overview of recent literature", International journal of environmental research and public health, 11(5), pp 4745-4767 23 Fuller Ray (2012), Probiotics: the scientific basis, Springer Science & Business Media, pp 1-56 24 Gaggìa Francesca, Mattarelli Paola, et al (2010), "Probiotics and prebiotics in animal feeding for safe food production", International journal of food microbiology, 141, pp S15-S28 25 Gardiner Gillian E, Casey Pat G, et al (2004), "Relative ability of orally administered Lactobacillus murinus to predominate and persist in the porcine gastrointestinal tract", Appl Environ Microbiol., 70(4), pp 1895-1906 26 Gbassi Gildas K, Vandamme Thierry (2012), "Probiotic encapsulation technology: from microencapsulation to release into the gut", Pharmaceutics, 4(1), pp 149-163 27 Gill Harsharnjit S, Guarner F (2004), "Probiotics and human health: a clinical perspective", Postgraduate Medical Journal, 80(947), pp 516-526 28 Heidebach Thomas, Först Petra, et al (2012), "Microencapsulation of probiotic cells for food applications", Critical reviews in food science and nutrition, 52(4), pp 291-311 29 Holmes Elaine, Li Jia V, et al (2011), "Understanding the role of gut microbiome– host metabolic signal disruption in health and disease", Trends in microbiology, 19(7), pp 349-359 30 Kailasapathy Kaila (2002), "Microencapsulation of probiotic bacteria: technology and potential applications", Current issues in intestinal microbiology, 3(2), pp 3948 31 Kailasapathy Kaila, Chin James (2000), "Survival and therapeutic potential of probiotic organisms with reference to Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium spp", Immunology and cell biology, 78(1), pp 80-88 32 Kareem Karwan Yassen, Ling Foo Hooi, et al (2014), "Inhibitory activity of postbiotic produced by strains of Lactobacillus plantarum using reconstituted media supplemented with inulin", Gut pathogens, 6(1), pp 23 33 Keeney M, Jiang XY, et al (2015), "Nanocoating for biomolecule delivery using layer-by-layer self-assembly", Journal of Materials Chemistry B, 3(45), pp 87578770 34 Krasaekoopt Wunwisa, Bhandari Bhesh, et al (2003), "Evaluation of encapsulation techniques of probiotics for yoghurt", International dairy journal, 13(1), pp 3-13 35 Lammers Karen Manon, Brigidi Patrizia, et al (2003), "Immunomodulatory effects of probiotic bacteria DNA: IL-1 and IL-10 response in human peripheral blood mononuclear cells", FEMS Immunology & Medical Microbiology, 38(2), pp 165172 36 McAloney Richard A, Sinyor Mark, et al (2001), "Atomic force microscopy studies of salt effects on polyelectrolyte multilayer film morphology", Langmuir, 17(21), pp 6655-6663 37 Metchnikoff Ilya Ilyich (2004), The prolongation of life: optimistic studies, Springer Publishing Company, pp 116 38 Mokarram RR, Mortazavi SA, et al (2009), "The influence of multi stage alginate coating on survivability of potential probiotic bacteria in simulated gastric and intestinal juice", Food Research International, 42(8), pp 1040-1045 39 Mortazavian Amir, Razavi Seyed Hadi, et al (2007), "Principles and methods of microencapsulation of probiotic microorganisms", Iranian Journal of Biotechnology 5(1), pp 1-18 40 Murtaza Ghulam, Waseem Amir, et al (2011), "Alginate microparticles for biodelivery: a review", African Journal of Pharmacy and Pharmacology, 5(25), pp 2726-2737 41 Oyetayo VO, Oyetayo FL (2005), "Potential of probiotics as biotherapeutic agents targeting the innate immune system", African Journal of biotechnology, 4(2), pp 123-127 42 Ozogul Fatih, Hamed Imen (2016), "Lactic Acid Bacteria: Lactobacillus spp.: Lactobacillus acidophilus", pp 91-95 43 Pereira Dora IA, Gibson Glenn R (2002), "Effects of consumption of probiotics and prebiotics on serum lipid levels in humans", Critical reviews in biochemistry and molecular biology, 37(4), pp 259-281 44 Rinaudo Marguerite (2006), "Chitin and chitosan: properties and applications", Progress in polymer science, 31(7), pp 603-632 45 Rowe Raymond C, Sheskey Paul J, et al (2006), Handbook of pharmaceutical excipients, Pharmaceutical press London 46 Serna-Cock Liliana, Vallejo-Castillo Vladimir (2013), "Probiotic encapsulation", African Journal of Microbiology Research, 7(40), pp 4743-4753 47 Singh MN, Hemant KSY, et al (2010), "Microencapsulation: A promising technique for controlled drug delivery", Research in pharmaceutical sciences, 5(2), pp 65 48 Sinha VR, Singla Anil Kumar, et al (2004), "Chitosan microspheres as a potential carrier for drugs", International journal of pharmaceutics, 274(1-2), pp 1-33 49 Younes Islem, Rinaudo Marguerite (2015), "Chitin and chitosan preparation from marine sources Structure, properties and applications", Marine drugs, 13(3), pp 1133-1174 50 Zanjani Mohammad Ali Khosravi, Tarzi Babak Ghiassi, et al (2014), "Microencapsulation of probiotics by calcium alginate-gelatinized starch with chitosan coating and evaluation of survival in simulated human gastro-intestinal condition", Iranian journal of pharmaceutical research: IJPR, 13(3), pp 843 PHỤ LỤC Hình ảnh số mẫu vi nang alginat – tinh bột – chitosan sau đơng khơ chụp từ kính lúp soi có độ phóng đại 10X: Vi nang nhân Alg 3% – TB 10% Vi nang nhân Alg 3% – TB 10% (CTS 0% - CaCl2 2%) (CTS 0,5% - CaCl2 2%) Vi nang nhân Alg 3% – TB 10% Vi nang nhân Alg 3% – TB 10% (CTS 3% - CaCl2 2%) (CTS 5% - CaCl2 2%) Vi nang nhân Alg 3% – TB 10% (CTS 3% - CaCl2 10%) Vi nang Alg 3% – TB 10% Vi nang Alg 3% – TB 10% (CTS 3% - CaCl2 10%) bao lớp alginat/chitosan (CTS 3% - CaCl2 2%) bao lớp alginat/chitosan Vi nang Alg 3% – TB 10% Vi nang Alg 3% – TB 10% (CTS 3% - CaCl2 2%) bao lớp alginat (khơng có chitosan phủ bên ngoài) (CTS 3% - CaCl2 2%) bao lớp alginat ( có chitosan phủ bên ngồi) ... vi nang nhân bao vi nang 2.2.2 Đánh giá khả bảo vệ giải phóng VSV mơi trường dịch tiêu hóa mơ vi nang đông tụ alginat – chitosan bao đa lớp - Tiến hành tạo vi nang alginat – chitosan bao đa lớp. .. HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HẰNG MÃ SINH VI? ?N: 1501143 ĐÁNH GIÁ VAI TRÒ BẢO VỆ VI SINH VẬT TRONG ĐƯỜNG TIÊU HÓA CỦA VI NANG ĐÔNG TỤ ALGINAT – CHITOSAN BAO ĐA LỚP KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người... ? ?Đánh giá vai trò bảo vệ vi sinh vật đường tiêu hóa vi nang đông tụ alginat – chitosan bao đa lớp? ?? tiến hành với mục tiêu sau: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chitosan calci clorid đến trình tạo vi