Khảo Sát Thành Phần Hóa Học Của Các Cao Petroleum Ether Từ Nấm Đông Trùng Hạ Thảo

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TPHCM KHOA HÓA HỌC – BỘ MƠN HĨA HỮU CƠ - - VÕ THỊ BÍCH PHƯỢNG KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HĨA HỌC CỦA CÁC CAO PETROLEUM ETHER TỪ NẤM ĐƠNG TRÙNG HẠ THẢO (Cordyceps sinensis) CBHD : TS BÙI XUÂN HÀO TS ĐẶNG HỒNG PHÚ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 04/2019 TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TPHCM KHOA HÓA HỌC – BỘ MƠN HĨA HỮU CƠ - - VÕ THỊ BÍCH PHƯỢNG KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÁC CAO PETROLEUM ETHER TỪ NẤM ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO (Cordyceps sinensis) CBHD : TS BÙI XUÂN HÀO TS ĐẶNG HOÀNG PHÚ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 04/2019 NHẬN XÉT CỦA HỘI ĐỒNG Xác nhận Giảng Viên LỜI CẢM ƠN Đề tài thực hồn thành phịng thí nghiệm Hóa Hữu Cơ với hướng dẫn thầy Bùi Xuân Hào thầy Đặng Hồng Phú Trong suốt q trình thực hoàn thành đề tài, em xin gởi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến thầy Đặng Hoàng Phú thầy Bùi Xuân Hào dành nhiều thời gian, tâm huyết chia sẻ kinh nghiệm, truyền đạt kiến thức dẫn tận tình, chu đáo, tạo điều kiện để hoàn thành tốt đề tài Cảm ơn anh chị, bạn phòng thí nghiệm Hóa Hữu Cơ chia sẻ, giúp đỡ hỗ trợ nhiều thời gian thực đề tài Xin chân thành cảm ơn MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI MỞ ĐẦU TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung Đông Trùng Hạ Thảo (Cordyceps sinensis) 1.1.1 Tên gọi 1.1.2 Nguồn gốc 1.1.3 Mô tả thực vật 1.1.4 Phân bố .2 1.1.5 Trồng trọt, thu hái .3 1.2 Thành phần hóa học .3 1.3 Hoạt tính sinh học THỰC NGHIỆM Điều kiện thực nghiệm Giới thiệu chung 10 Tiến hành thực nghiệm 10 Sơ đồ q trình lập hợp chất 11 Q trình lập phân đoạn P3.1 12 KẾT QUẢ, BIỆN LUẬN 13 KẾT LUẬN PHỤ LỤC i DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Nấm Đơng trùng hạ thảo tự nhiên Hình 1.2: Cordyceps sinensis tìm thấy đồng cỏ độ cao 4200m mực nước biển Tibet Hình 2.1: Cấu trúc hợp chất CS .13 ii DANH MỤC BẢNG BIỂU, SƠ ĐỒ Bảng 2.1: Bảng liệu phổ NMR hợp chất CS so sánh với hợp chất 22-hydroxyisohopane dung môi chloroform-d 14 Sơ đồ 2.1: Q trình lập hợp chất 11 iii DANH MỤC KÝ HIỆU VIẾT TẮT PE Petroleum ether D Doublet (Mũi đôi) Dd Doublet of doublets (Mũi đôi - đôi) S Singlet (Mũi đơn) SKLM Sắc ký lớp mỏng SKC Sắc ký cột NMR Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy Hz, MHz Hertz, Megahertz ppm Part per million J Hằng số ghép 𝛿 Độ dịch chuyển hóa học Proton Nuclear Magnetic Resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân H NMR proton 1H) 13 C NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13C) iv DANH MỤC PHỤ LỤC Phụ lục 1.1: Phổ 1H NMR hợp chất CS dung môi chloroform-d Phụ lục 1.2: Phổ 13C NMR hợp chất CS dung môi chloroform-d v LỜI MỞ ĐẦU Ngày nay, xã hội ngày phát triển, chất lượng sống người ngày nâng cao nhu cầu sức khỏe Việc tìm kiếm sử dụng loại dược liệu quý với nguồn gốc từ thiên nhiên quan tâm phổ biến Đông trùng hạ thảo số dược liệu quý đó, sử dụng lâu đời lịch sử Đông y Đông trùng hạ thảo dạng kí sinh lồi nấm túi Cordyceps với ấu trùng số lồi trùng Ngồi ra, Đơng trùng hạ thảo biết đến với ứng dụng y học như: điều trị ho, điều trị bệnh thận, suy nhược, tăng cương chức hệ miễn dịch,… Do vậy, việc ni trồng phân tích thành phần hoạt tính sinh học từ Đơng trùng hạ thảo để thu hợp chất có tính ứng dụng lĩnh vực nhà khoa học quan tâm Tuy nhiên, Việt Nam, việc nghiên cứu nấm Đông trùng hạ thảo cịn gặp nhiều khó khăn sở vật chất kiến thức Vì vậy, đề tài nhằm nghiên cứu cấu trúc, khảo sát thành phần hóa học cao petroleum ether từ nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps sinensis) vi PHẦN 2: THỰC NGHIỆM THỰC NGHIỆM Điều kiện thực nghiệm Việc nghiên cứu thành phần hóa học cao petroleum ether từ nấm Đông trùng hạ thảo thực với điều kiện sau:  Sắc kí cột - Silica gel pha thường (Merk, DC Kieselgel 60 F254)  Sắc kí lớp mỏng - Silica gel pha thường (Merk, DC Kieselgel 60 F254) - Silica gel pha đảo RP18 (Whatman, KC18F, 200𝜇𝑚)  Thuốc thử - Dung dịch vanillin  Máy ghi phổ cộng hưởng từ hạt nhân: - Máy Bruker Avance 500 [500 MHz (1H) 125 MHz (13C)]  Máy ghi phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS: - Máy Bruker Micro OTOF-QII  Đèn UV: - Máy Spectroline MODEL ENF-240C/FE (USA) hai bước sóng 254nm 365nm  Dung mơi thực nghiệm: Là dung môi chưng cất: - Methanol - n-Hexane - Ethyl acetate - Acetone - Chloroform  Phổ cộng hưởng từ hợp chất CS1 CS2 ghi phịng phân tích trung tâm, trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, 227 Nguyễn Văn Cừ, Quận 5, Tp.HCM  Phổ HR-ESI-MS ghi Viện hàn lâm khoa học công nghệ, số Mạc Đĩnh Chi, Quận 1, Tp.HCM Giới thiệu chung Trong đề tài chúng tơi tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps sinensis) nuôi cấy Phịng thí nghiệm Sinh Hóa, trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên Sinh khối nấm định danh PGS TS Lê Huyền Ái Thúy, giảng viên Khoa Công Nghệ Sinh Học trường Đại học Mở, Tp.HCM Tiến hành thực nghiệm Sinh khối nấm C sinensis sau chiết ngấm kiệt với ethanol Dung môi thu hồi áp suất kém, thu cao ethanol thô Cao ethanol khơ hịa tan vào nước trích lỏng-lỏng với dung môi petroleum ether, ethyl acetate n-butanol, thu cao tương ứng dịch nước sau chiết Cao petroleum ether (15.3 g), sử dụng sắc ký cột silica gel pha thường với hệ giải ly n-hexane: ethyl acetate (độ phân cực tăng dần từ 0% - 100% ethyl acetate), thực sắc ký mỏng thu 250 lọ Từ gom lại thành 10 phân đoạn (P1-10) Trong khóa luận này, tiến hành khảo sát phân đoạn P3 10 Sơ đồ q trình lập hợp chất 250 g Sinh khối nấm Chiết ngấm kiệt với EtOH Thu hồi dung môi áp suất 51.021 g Cao ethanol Hịa tan vào nước chiết với dung mơi: petroleum ether, ethyl acetate, n-butanol Thu hồi dung môi áp suất Cao n-butanol (4.329 g) Cao ethyl acetate (0.247 g) Cao nước (5.435 g) SKC (n-hexane : ethyl acetate) (0 → 100%) thu 10 phân đoạn từ P1 → P10 P3 (2.6172 g) SKC (n-hexane : ethyl acetate) (0 → 100%) thu 12 phân đoạn từ P3.1→ P3.12 Phân đoạn P3.1 (104.3 mg) Sắc kí điều chế H : CHCl3 (8:2) CS (3.0 mg) Sơ đồ 2.1: Quá trình lập hợp chất 11 Q trình lập phân đoạn P3.1 Trong khóa luận này, chúng tơi tiến hành khảo sát thành phần hóa học cao petroleum ether trích ly từ nấm Đơng trùng hạ thảo Sắc kí cột hấp phụ silica gel cao petroleum ether (15.3 g) với hệ dung môi nhexane : ethyl acetate có độ phân cực tăng dần (0→100% EtOAc), dựa sắc kí lớp mỏng màu dung dịch vanilin nung nóng gom thành 10 phân đoạn (P1 → P10) Sắc kí cột hấp phụ silica gel phân đoạn P3.1 (104.3 mg) với hệ dung ly n-hexane : chloroform có độ phân cực tăng dần (0→100% CHCl3), dựa sắc kí lớp mỏng màu với dung dịch vanilin nung nóng thu phân đoạn (𝑃3.1.1 → P3.1.5) Thực tách phân đoạn mỏng silica gel pha thường (Merk DC Kieselgel 60 F254) phân đoạn P3.1.2 (11.6 mg) phân đoạn P3.1.3 (27.9 mg) Sau tiến hành sắc kí mỏng điều chế với hệ dung môi giải ly n-hexane : chloroform : acid acetic (8 : : 0.01) thu hợp chất CS 12 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN KẾT QUẢ, BIỆN LUẬN Hợp chất CS thu có đặc điểm sau: màu trắng, kết tủa vơ định hình, tan dung mơi chloroform Sắc ký lớp mỏng với hệ giải ly H : CHCl3 : AcOH (9 : : 0.01) cho vết không hấp thu UV, màu dung dịch vanillin/H2SO4 nung nóng cho màu hồng Phổ 1H NMR hợp chất CS (phụ lục 1.1) cho thấy xuất tín hiệu proton nhóm methyl δH (ppm) 0.76 (3H, s), 0.81 (3H, s), 0.82 (3H, s), 0.85 (3H, s), 0.96 (6H, s), 1.18 (3H, s), 1.21 (3H, s) Đây tín hiệu đặc trưng khung lupan Phổ 13C NMR (phụ lục 1.2) cho thấy xuất tín hiệu carbon gắn với oxygen 𝛿𝐶 (ppm) 73.6, tín hiệu carbon nhóm methyl 𝛿𝐶 (ppm) 33.4, 21.5, 16.1, 16.7, 17.0, 15.8 tín hiệu carbon nhóm methylene, carbon tứ cấp 𝛿𝐶 (ppm) 18.7 – 54.0 Từ liệu phổ trên, kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo hợp chất 22hydroxyisohopane cho thấy có tương đồng Vậy cấu trúc hợp chất CS2 đề nghị 22-hydroxyisohopane Hình 2.1: Cấu trúc hợp chất CS 13 Bảng 2.1: Bảng liệu phổ NMR hợp chất CS so sánh với hợp chất 22hydroxyisohopane dung môi chloroform-d CS2 Vị trí 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 δH (ppm) Tín hiệu khung lupan (27H vùng δH 0.72 – 2.40) 0.96 (6H, s) 0.96 (6H, s) 0.79 (3H, s) 0.82 (3H, s) 0.85 (3H, s) 0.76 (3H, s) 1.18 (3H, s) 1.21 (3H, s) 22-hydroxyisohopane δC (ppm) 40.3 18.7 42.1 33.3 56.1 18.7 34.4 41.9 50.4 37.4 20.9 22.0 49.9 41.9 33.3 26.6 54.0 44.1 41.3 24.2 51.2 74.0 33.4 21.6 16.1 16.7 17.0 15.8 30.8 33.4 δH (ppm) Tín hiệu khung lupan (27H vùng δH 0.72 – 2.40) 0.95 (6H, s) 0.95 (6H, s) 0.79 (3H, s) 0.81 (3H, s) 0.81 (3H, s) 0.76 (3H, s) 1.18 (3H, s) 1.21 (3H, s) δC (ppm) 40.3 18.7 42.1 33.3 56.1 18.7 34.4 41.9 50.4 37.4 20.9 22.0 49.9 41.9 33.3 26.6 53.9 44.1 41.3 24.2 51.1 74.0 33.4 21.6 16.2 16.7 17.0 15.8 30.9 33.4 14 KẾT LUẬN Trong đề tài nghiên cứu này, tiến hành khảo sát thành phần hóa học phân đoạn P3 cao petroleum ether từ nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps sinensis) Bằng phương pháp sắc ký cột sắc ký mỏng silica gel pha thường pha đảo, sắc kí mỏng điều chế hệ dung môi giải ly khác cô lập hợp chất ký hiệu CS Thơng qua kết phân tích phổ nghiệm (1H NMR, 13C NMR) so sánh với tài liệu tham khảo, xác định cấu trúc hợp chất là: 22-hydroxyisohopane 22-hydroxyisohopane Trong đó, hợp chất CS lần cô lập chi Cordyceps 15 TÀI LIỆU THAM KHẢO Hui-Chen Lo,1 Chienyan Hsieh, Fang-Yi Lin, and Tai-Hao Hsu3, “A Systematic Review of the Mysterious Caterpillar Fungus Ophiocordyceps sinensis in DongChongXiaCao (冬蟲夏草 Dōng Chóng Xià Cǎo) and Related Bioactive Ingredients”, J Tradit Complement Med, vol.3, no.1, pp 16–32, 2013 W Chen, W Zhang, W Shen and K.Wang, “Effects of the acid polysaccharide fraction isolated from a cultivated Cordyceps sinensis on macrophages in vitro”, Cell Immunol, vol 262, no 1, pp 69-74, 2010 J S Zhu, G M Halpern and K Jones, “The Scientific Rediscovery of an Ancient Chinese Herbal Medicine: Cordyceps sinensis Part I”, J Altern Complement Med, vol 4, no 3, pp 289-303, 1998 S P Li, F Q Yang and K W K Tsim, “Quality control of Cordyceps sinensis, a valued traditional Chinese medicine”, J Pharm Biomed Anal, vol 41, no 5, pp 1571-1584, 2006 J Wang, YM Liu, W Cao, KW Yao, ZQ Liu, JY Guo, “Anti-inflammation and antioxidant effect of cordymin, a peptide purified from the medicinal mushroom Cordyceps sinensis, in middle cerebral artery occlusion-induced focal cerebral ischemia in rats”, Metab Brain Dis, vol.27, pp 159–65, 2012 G.D Wang, “Cordyceps: Ecology Culture and Application”, Science & Technology Documents Publishing House, Beijing, 1995 ML Yang, PC Kuo, TL Hwang, TS Wu, “Anti-inflammatory principles from Cordyceps sinensis”, J Nat Prod, vol 74, pp 1996–2000, 2011 H John, C Matt, M Inc Aloha, SantaCruz, California, U.S.A, “Cordyceps Wasser SP Institute of Evolution”, University of Haifa, Mt.Carmel, Haifa, Israel, 2005, thesis M G Shaashidhar, P Giridhar, K Udaya Sankar and B Manohar: “Bioactive principles from Cordyceps sinensis: A potent food supplement – A review”, J Funct Foods, vol 5, no 3, pp 1013-1030, 2013 16 10 J C Holliday, P Cleaver, M Loomis-Powers and D Patel, “Analysis of quality and techniques for hybridization of medicinal fungus Cordyceps sinensis (Berk) Sacc (Ascomycetes)”, Int J Med Mushroom, vol 6, pp 151-164, 2004 11 C H Dong and Y J Yao, “In vitro evaluation of antioxidant activities of aqueous extracts from natural and cultured mycelia of Cordyceps sinensis”, LWT – Food Sci Technol, vol 41, no 4, pp 669-677, 2008 12 FQ Yang, K Feng, J Zhao, SP Li, “Analysis of sterols and fatty acids in natural and cultured Cordyceps by one-step derivatization followed with gas chromatography-mass spectrometry”, J Pharm Biomed Anal, vol.49, no 8, pp 1172, 2009 13 JH Xiao, “Current status and ponderation on preparations and chemical structures of polysaccharide in fungi of Cordyceps (Fr.) Link”, Chin Tradit Herb Drugs, vol.39, no 60, pp 454, 2008 14 J Guan and S P Li, “Discrimination of polysaccharide from traditional Chinese medicines using saccharide mapping-Enzymatic digestion followed by chromatographic analysis”, J Pharm Biomed Anal, vol 51, no 3, pp 590-598, 2010 15 J Guan, J Zhao, K Feng D J Hu and S P Li, “Comparision and characterization of polysaccharides from natural and cultured Cordyceps using saccharide mapping”, Anal Bioanal Chem, vol 99, no 10, pp 3465-3474, 2011 16 Y Wu, N Hu, Y Pan, L Zhou and X Zhou, “Isolation and characterization of a mannoglucan from edible Cordyceps sinensis mycelium”, Carbohydr Res, vol 342, no 6, pp 870-875, 2007 17 T Miyazaki, N Oikawa and H Yamada, “Studies on Fungal Polysaccharides XX Galactomannan of Cordyceps sinensis”, Chem Pharm Bull, vol 25, no 12, pp 3324-3328, 1977 18 K D Shonkor, F Shinya, M Mina and S Akihiko, “Efficient Production of Anticancer Agent Cordycepin by Repeated Batch Culture of Cordyceps militaris Mutant”, Lecture Notes in Engineering and Computer Science vol 38, pp.20-22, 2010 17 19 J Guan, F Q Yang and S P Li, “ Evaluation of carbohydrates in natural and cultured Cordyceps by pressurized liquid extraction and gas chromatography coupled with mass spectrometry”, Molecules, vol 15, no 6, pp 4227-4241, 2010 20 S.P Li a, F.Q Yang a, Karl W.K Tsim, “Quality control of Cordyceps sinensis, a valued traditional Chinese medicine”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, vol.41, pp.1571–1584, 2006 21 S Zhong, H Pan, L Fan, Lv G, Y Wu, B Parmeswaran, et al “Advances in research of polysaccharides in Cordyceps species”, Food Technol Biotechnol, vol.47, pp 304-12, 2009 22 R Singh, PS Negi, Z Ahmed, “Genetic variability assessment in medicinal caterpillar fungi Cordyceps spp (Ascomycetes) in central himalayas”, India Int J Med Mushrooms., vol.9, no 11, pp 185, 2009 23 R Russell, M Paterson, “Cordyceps – A traditional Chinese medicine and anotherfungal therapeutic biofactory” Phytochemistry, vol 69, pp 1469–1495, 2008 18 PHỤ LỤC Phụ lục 1.1: Phổ 1H NMR hợp chất CS dung môi chloroform-d Phụ lục 1.2: Phổ 13C NMR hợp chất CS dung môi chloroform-d ... cứu cấu trúc, khảo sát thành phần hóa học cao petroleum ether từ nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps sinensis) vi PHẦN 1: TỔNG QUAN vii TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chung Đông Trùng Hạ Thảo (Cordyceps...TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TPHCM KHOA HÓA HỌC – BỘ MƠN HĨA HỮU CƠ - - VÕ THỊ BÍCH PHƯỢNG KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HĨA HỌC CỦA CÁC CAO PETROLEUM ETHER TỪ NẤM ĐƠNG TRÙNG HẠ THẢO (Cordyceps... 33.4 14 KẾT LUẬN Trong đề tài nghiên cứu này, tiến hành khảo sát thành phần hóa học phân đoạn P3 cao petroleum ether từ nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps sinensis) Bằng phương pháp sắc ký cột sắc