Khảo sát thành phần hóa học phân đoạn dichlomethane loài dó đất (balanophora fungosa subsp indica (arn ) b hansen)

Việc nghiên cứu, tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học cao từ nguồn thực vật này để ứng dụng trong Y học, nông nghiệp và các mục đích khác nhau trong cuộc sống của con người là một

LOÀI DÓ ĐẤT (BLANNOPHORA

FUNGOSA SUBSP INDICA

(ARN.) B HANSEN)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Hóa học hữu cơ

LOÀI DÓ ĐẤT (BLANNOPHORA

FUNGOSA SUBSP INDICA

(ARN.) B HANSEN)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Hóa học hữu cơ

Người hướng dẫn khoa học

TS BÙI HỮU TÀI

LỜI CẢM ƠN

Để có thể hoàn thiện được khóa luận tốt nghiệp, ngoài sự nỗ lực không ngừng của bản thân, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới thầy

giáo PGS.TS Nguyễn Văn Bằng và các thầy cô khoa hóa học, trường đại học

sư phạm Hà Nội 2 đã luôn quan tâm và tận tình truyền đạt những kiến thức quý báu cho em trong suốt thời gian qua

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Bùi Hữu Tài người đã trực tiếp hướng dẫn, cùng các thầy cô phòng Nghiên cứu cấu trúc, Viện Hóa sinh Biển-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi

điều kiện thuận lợi nhất cho em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp này

Cuối cùng em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể gia đình, bạn

bè, những người vẫn luôn quan tâm, động viên và đồng thời là chỗ dựa tinh thần giúp em hoàn thành tốt nhiệm vụ được giao trong suốt thời gian học tập

và quá trình nghiên cứu thực hiện khóa luận tốt nghiệp vừa qua

Hà nội, tháng 5 năm 2018

Sinh viên

Nguyễn Thị Hải

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ (Tiếng Anh) Viết đầy đủ (Tiếng Việt)

13C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic

Resonance

Cộng hưởng từ hạt nhân cacbon

13 1H-NMR Proton Nuclear Magnetic

DMSO Dimethyl sulfoxide Dimethyl sulfoxide

DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl ESI-MS Electrospray Ionization Mass

Spectrometry

Phổ khối lượng ion hóa phun

mù điện

HMBC Heteronuclear mutiple Bond

LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện

LOQ Limit of quantitation Giới hạn định lượng

RP-18 Reserve phase C-18 Chất hấp phụ pha đảo C-18 TLC Thin layer chromatography Sắc ký lớp mỏng

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về cây Dó đất 3

1.1.1 Thực vật học 3

1.1.2 Mô tả cây Dó đất 5

1.1.3 Phân bố và sinh thái 6

1.1.4 Bộ phận dùng 6

1.1.5 Tính vị và công dụng 6

1.1.6 Thành phần hóa học 6

1.1.7 Hoạt tính sinh học 11

1.2 Tổng quan về phương pháp chiết mẫu thực vật 12

1.2.1 Chọn dung môi chiết 13

1.2.2 Quá trình chiết 14

1.3 Tổng quan về phương pháp sắc ký 15

1.3.1 Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký 16

1.3.2 Cơ sở của phương pháp sắc ký 16

1.3.3 Phân loại phương pháp sắc ký 16

1.3.3.1 Sắc ký cột 17

1.3.3.2 Sắc ký lớp mỏng 17

1.4 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ 18

1.4.1 Phổ hồng ngoại (IR) 19

1.4.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 19

1.4.2.1 Phổ 1 H-NMR 20

1.4.2.2 Phổ 13 C-NMR 20

1.4.2.3 Phổ DEPT 20

1.4.2.4 Phổ 2D-NMR 20

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG THỰC NGHIỆMVÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 22

2.1 Mẫu thực vật 22

2.2 Các phương pháp phân lập các hợp chất 22

2.2.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC) 22

2.2.2 Sắc ký cột (CC) 22

2.3 Các phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất 22

2.4 Dụng cụ và hóa chất 23

2.4.1 Dụng cụ 23

2.4.2 Hóa chất 23

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 24

3.1 Phân lập các hợp chất 24

3.2 Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất 27

3.2.1 Hợp chất BF1 27

3.2.2 Hợp chất BF2 27

3.2.3 Hợp chất BF3 27

CHƯƠNG 4: THẢO LUẬN KẾT QUẢ 29

4.1 Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất BF1 (Isolariciresinol) 29

4.2 Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất BF2 (Salicifoliol) 34

4.3 Xác định cấu trúc hóa học của hợp chất BF3 (Dihydroconiferyl

alcohol) 37

KẾT LUẬN 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

DANH MỤC BẢNG

Bảng 4.1 Số liệu phổ NMR của hợp chất BF1 và hợp chất tham khảo 33 Bảng 4.2 Số liệu phổ NMR của hợp chất BF2 và hợp chất tham khảo 37 Bảng 4.3 Số liệu phổ NMR của hợp chất BF3 và hợp chất tham khảo 40

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ

Sơ đồ 3.1 Sơ đồ chiết các phân đoạn từ cây Dó đất 24

Sơ đồ 3.2 Sơ đồ phân lập các hợp chất BF1 – BF3 26

Hình 1.1 Hình ảnh một số loài thuộc chi Balanophora 4

Hình 1.2 Một số hình ảnh về loài B fungosa subsp indica 5

Hình 4.1.1 Phổ 1H-NMR của hợp chất BF1 29

Hình 4.1.2 Phổ 13C-NMR của hợp chất BF1 30

Hình 4.1.3 Phổ HSQC của hợp chất BF1 31

Hình 4.1.4 Phổ HMBC của hợp chất BF1 32

Hình 4.1.5 Cấu trúc hóa học và các tương tác HMBC chính của hợp chất BF1 32

Hình 4.2.1 Cấu trúc hóa học của hợp chất BF2 34

Hình 4.2.2 Phổ 1H-NMR của hợp chất BF2 34

Hình 4.2.3 Phổ 13C-NMR của hợp chất BF2 35

Hình 4.2.4 Phổ HSQC của hợp chất BF2 36

Hình 4.3.1 Phổ 1H-NMR của hợp chất BF3 38

Hình 4.3.2 Phổ 13C-NMR của hợp chất BF3 38

Hình 4.3.3 Phổ HSQC của hợp chất BF3 39

Hình 4.3.4 Cấu trúc hóa học của hợp chất BF3 và hợp chất tham khảo BF3a 40

MỞ ĐẦU

Là một quốc gia nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, Việt Nam

có một thảm thực vật vô cùng phong phú và đa dạng với hơn 12.000 loài thực vật bậc cao khác nhau Thiên nhiên thuận lợi là điều kiện cho sự phát triển đa dạng của hệ thực vật Thực vật không chỉ là nguồn cung cấp dinh dưỡng cho con người mà còn là những phương thuốc chữa bệnh hết sức quý giá Việc nghiên cứu, tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính sinh học cao từ nguồn thực vật này để ứng dụng trong Y học, nông nghiệp và các mục đích khác nhau trong cuộc sống của con người là một trong những nhiệm vụ quan trọng và đang được các nhà khoa học trong và ngoài nước quan tâm

Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học kĩ thuật, nền Y học cổ truyền dân tộc với các phương thuốc đông y cùng với y học hiện đại đã và đang có những đóng góp to lớn trong việc phòng và chữa bệnh cho con người, nâng cao chất lượng cuộc sống Chính vì vậy việc nghiên cứu hóa học của các loài cây thuốc có ý nghĩa vô cùng quan trọng nhằm làm cơ sở khoa học cho việc sử dụng nguồn tài nguyên một cách hiệu quả nhất và mang lại giá trị sử dụng và hiệu quả kinh tế của dược liệu

Cây Dó đất (hay còn gọi là Tỏa dương, Nấm ngọc cẩu) có tên khoa học

là Balanophora fungosa subsp indica là loại cây sống ký sinh, được dùng

trong một số bài thuốc dân gian với tác dụng bổ máu, kích thích ăn ngon miệng, phục hồi sức khỏe nhanh, Hiện nay, chúng là loài bị săn tìm ráo riết

để phục vụ cho những bài thuốc tăng cường sinh lực nên có thể dẫn đến nguy

cơ cạn kiệt, một số loài thuộc chi dó đất đã nằm trong sách đỏ của Việt Nam

Do đó, việc nghiên cứu thành phần hóa học và phát hiện các hoạt chất của loài dó đất mang nhiều ý nghĩa khoa học và thực tiễn, vừa tạo cơ sở giải thích công dụng dân gian của loài, vừa tạo cơ sở để đánh giá hiệu quả kinh tế của nó

Xuất phát từ thực tiễn trên, tôi lựa chọn và thực hiện đề tài “Khảo sát

thành phần hóa học phân đoạn dichlomethane loài Dó đất (Balanophora

fungosa subsp indica (Arn.) B Hansen)” nhằm tìm hiểu kĩ hơn về hóa học

của loài dó đất, góp phần nâng cao kiến thức bản thân, đồng thời có cách nhìn khái quát về vấn đề nghiên cứu

Nhiệm vụ của đề tài là:

1 Xử lý mẫu và tạo dịch chiết

2 Phân lập các hợp chất từ phân đoạn dichlomethane loài dó đất

3 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập đƣợc

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về cây Dó đất

1.1.1 Thực vật học

Theo khóa phân loại thực vật, chi Balanophora hay còn gọi là chi Dó đất

có vị trí phân loại như sau:

+ Ngành: Mộc lan – Magnoliphyta

+ Lớp: Hai lá mầm – Magnoliopsida

+ Bộ: Đàn hương – Santalales + Họ: Dó đất, Dương đài – Balanophoraceae + Chi: Dó đất – Balanophora

Các loài thuộc chi Balanophora là một loại thực vật hạt kín sống trong

khu vực cận nhiệt đới Họ Dó đất bao gồm các loại thực vật thân thảo, sống một năm hay nhiều năm, ký sinh bắt buộc, đáng chú ý vì sự phát triển thất thường và các mối quan hệ không rõ ràng vật chủ-vật ký sinh Các loài cây này thông thường được tìm thấy trong các khu rừng ẩm ướt, mọc trên rễ các cây khác và có cụm hoa nằm trên mặt đất với bề ngoài tổng thể trông giống như nấm, bao gồm vô số hoa nhỏ, màu nâu, hồng hay hơi tía Các cụm hoa phát triển bên trong phần ngầm dưới đất dạng củ của cây, trước khi tách khỏi

nó và xuất hiện trên bề mặt Phần ngầm dưới đất gắn với vật chủ, trông giống như củ, to cỡ như quả dứa và không phải là rễ hoàn hảo Các loài thực vật này không có diệp lục Lá suy giảm nhiều hay không có Nếu có thì các lá này dưới dạng màng nhầy

Trên thế giới, chi Balanophora đã ghi nhận có khoảng 120 loài, phân

bố ở vùng khí hậu ôn đới và nhiệt đới Châu Á và Châu Úc [21] Chi Dó đất ở Việt Nam có khoảng 7 loài, trong đó có một số loài thường gặp và được sử

dụng làm thuốc như: Balanophora fungosa, B laxiflora, B latisepala, B

polyandra, B cucphuongensis Nhiều loài thuộc chi Dó đất được các nhà

khoa học nghiên cứu sử dụng làm thuốc chữa bệnh như: trĩ nội, trĩ ngoại, làm thuốc tăng cường sinh lực, Ở Việt Nam người dân tộc miền núi thường dùng cụm hoa làm thuốc bổ, có tác dụng mạnh gân cốt, giúp cơ thể cường tráng, chữa đau bụng, nhức mỏi chân tay Người dân thường dùng dưới dạng thuốc sắc nước hoặc ngâm rượu [2]

1.1.2 Mô tả cây Dó đất

Dó đất có tên khoa học là Balanophora fungosa subsp indica, thuộc họ

Dó đất – Balanophoraceae

Tên gọi khác: Xà cô, Dương đài, Nấm ngọc cẩu, Chu ca ra

Dó đất là thực vật có hoa đặc biệt, sống kí sinh trên rễ của nhiều loại cây gỗ lớn trong rừng ẩm, không có diệp lục, thân thoái hóa thành một củ nhỏ, có kích thước và hình dạng khác nhau, thường gồm nhiều thùy, sần sùi, màu nâu sẫm, không có lá hay chỉ có lá vẩy, đến khi sinh sản thì cụm hoa của

nó mới lộ ra trên mặt đất Tùy từng loài, cây Dó đất có hoa đơn tính cùng gốc hay khác gốc Cụm hoa đực dài hình trụ, trụ hoa ở gốc có lá không có diệp lục, bao hoa có 4-7 thùy; nhị có 4-7 bao phấn hình móng ngựa Cụm hoa cái ngắn, hình thoi hay hình trứng dài 5-7 cm, mang rất nhiều hoa cực nhỏ, không

có bao hoa Thụ phấn nhờ côn trùng Mùa hoa thường vào tháng 11 đến tháng

2 năm sau Hoa rất thơm, tỏa hương vào chiều tối và sáng sớm [1]

Hình 1.2 Một số hình ảnh về loài B fungosa subsp indica

1.1.3 Phân bố và sinh thái

Cây Dó đất mọc dải rác trong các rừng cây lá rộng, nơi ẩm, ở độ cao

500 – 2600 m, nó sống ký sinh trên rễ của nhiều loại cây thân gỗ, kể cả cây gỗ

dây leo, nhƣ các loài Cissus, Tetrastigma trong họ Nho và nhiều loại cây họ

Đậu ở các vùng rừng núi Hòa Bình, Lào Cai, Lâm Đồng, Khánh Hòa

1.1.6 Thành phần hóa học

Các nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới đã chỉ ra thành phần

hóa học chính của các loài thuộc chi Balanophora là các hợp chất dạng

polyphenol có chứa nhiều các nhóm caffeoyl, coumaroyl, galloyl,… Các công

trình nghiên cứu về thành phần hóa học một số loài thuộc chi Balanophora

bắt đầu vào giữa thế kỉ 20, khởi đầu với công bố phân lập một số hợp chất

triterpen từ loài B japonica [23]

Tiếp sau đó, Mitsumara và cộng sự của ông đã thông báo phân lập và

xác định đƣợc một hợp chất neo-lignan, balanophonin (3), và 10 hợp chất

khác (4-13) từ loài B japonica [4]

Một nghiên cứu khác về thành phần hóa học loài B japonica đã được

công bố trong khoảng thời gian này, Jiang và cộng sự người Nhật đã phân lập

và xác định cấu trúc của 34 hợp chất phenolic (19-52) có cấu trúc hóa học đặc

biệt chỉ gồm một đơn vị đường liên kết qua cầu ester với các nhóm phenolic acid khác nhau gồm caffeic acid, coumaroic acid, galloic acid và hexahydroxydiphenoic acid [7]

Tuy chưa có các nghiên cứu về phân tích định lượng, các hợp chất 19-52

đã có sự phân lập được với hiệu suất 0.0012-0.7069% (các hợp chất

19,20,22,24-27) so với khối lượng mẫu khô từ phần dưới mặt đất và hiệu suất 0.0014-0.2231% (các hợp chất 19-21, 23, 28-52) từ phần trên mặt đất loài B

japonica [7]

Tiếp đó, Jiang và cộng sự tiếp tục công bố ba hợp chất balanophotanin

A-C (53-55), các lignan glycoside (56-59); balanophotanin D-G (60-63) từ

loài B japonica [8, 9] Các kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào đã phát

hiện hợp chất balannophotnanin E diệt tế bào ung thư gan tốt nhất, với giá trị

IC50 là 4.22 μM [9]

Trong thí nghiệm về sàng lọc hoạt tính chống oxi hóa (theo phương pháp DPPH) của các dịch chiết từ các cây thuốc truyền thống, Wang và cộng

sự đã phát hiện dịch chiết 80% acetone từ loài B polyandra thể hiện khả năng

thu dọn gốc tự do mạnh Các nghiên cứu về thành phần hóa học loài này đã

phân lập được 2 hợp chất, balapolyphorin A-B (64-65), cùng với 20 hợp chất dạng lignan hoặc phenolic (9, 20, 35, 37, 41, 42, 50-52, 54, 57, 66-74) Các

hợp chất này cũng đã được đánh giá hoạt tính DPPH, hầu hết các hợp chất đều thể hiện khả năng thu dọn gốc tự do với giá trị thu dọn 50% số lượng gốc

tự do DPPH (SC50) từ 8.4-68.3 µM [19]

Từ hoa loài Balanophora laxiflora, Ho và cộng sự đã tiến hành nghiên

cứu các thành phần chống oxi hóa bằng hệ thống HPLC kết hợp DPPH Trong

số các hợp chất phát hiện được, 5 hợp chất bao gồm: caffeic acid (6), 1-O-(E)- caffeoyl-β-D-glucopyranose (20), 1-O-(E)-p-coumaroyl-β-D-glucopyranose (19), 1-O-(E)-caffeoyl-4,6-(S)-hexahydroxydiphenoyl-β-D-glucopyranose (46), và 1,3-di-O-galloyl-4,6-(S)-hexahydroxydiphenoyl-β-D-glucopyranose

(52) được xác định là thành phần chống oxi hóa chính của loài này [5] Một

nghiên cứu khác của She cũng về tác dụng chống oxi hóa đã phân lập và xác

định cấu trúc của 2 hợp chất, balaxiflorins A- B (75, 76) cùng 17 hợp chất

phenolic khác (6, 20, 35, 37, 41, 48, 49, 52, 58, 68, 70, 71, 74, 77-80) [15]

Các hợp chất phenolic có chứa nhóm galloyl, cafeoyl, và (S)-

hexahydroxydiphenoyl (81-89) cũng đƣợc phát hiện thấy có trong thành phần

hóa học của loài B tobiracola [18]

Từ loài B harlandii, Wang và cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc

của hợp chất, 1-O-[(E)-p-coumaroyl]-3-O-galloyl-β-D-glucopyranose (90) và

18 hợp chất (7, 20, 30, 37, 42, 68, 71, 81-83, 86, 87, 91-96) Các hợp chất này

đã đƣợc đánh giá hoạt tính chống oxi hóa DPPH, kết quả cho thấy một số hợp chất mang khung dihydrochalcone và tannin thể hiện hoạt tính tốt nhất với giá trị SC50 trong khoảng 8.2-16.2 µM [20]

Từ loài B involucrata, Luo và cộng sự phân lập đƣợc ba hợp chất

phenolic đã biết (11, 71, 72) [12] Một nghiên cứu khác về thành phần hóa

học loài B papuana của các nhà khoa học Nhật Bản, Hosoya và cộng sự đã

phân lập đƣợc 2 hợp chất khác có khung dihydrochalcone, papuabalanols A-B

(97, 98) Các hợp chất này đã đƣợc đánh giá hoạt tính hạ huyết áp và ức chế enzyme tyrosinase [6] Kết quả cho thấy, hợp chất 97 (100 µM) phát hiện có tác dụng làm giãn mạch trong khi hợp chất 98 lại có tác dụng ức chế hoạt

động của enzym tyrosinase (33-79%) ở các nồng độ thử nghiệm 12.5, 25, và

50 µM

Từ kết quả tổng quan các nghiên cứu trên, có thể nhận thấy các nghiên cứu chủ yếu xuất phát từ các nghiên cứu của các nhà khoa học Nhật Bản và

Trung Quốc Thành phần hóa học của các loài thuộc chi Balanophora chủ yếu

là các hợp chất dạng lignan hoặc các phenolic có chứa các nhóm galloyl, caffeoyl, và hexahydroxydiphenoyl Tuy vậy, cho đến nay gần nhƣ chƣa có

nghiên cứu về hóa học loài B fungosa subsp indica

1.1.7 Hoạt tính sinh học

Các công bố về hoạt tính sinh học của chi Balanophora có thể khái

quát bao gồm: hoạt tính chống oxi hóa, hoạt tính ức chế hoạt động của enzyme tyrosinase/α-glucosidase Trong đó, đáng kể nhất là các công bố về hoạt tính chống oxi hóa Ngoài ra, một số hoạt tính khác của các hợp chất phân

lập từ chi Balanophora cũng được nhắc đến như diệt tế bào ung thư, kháng virus

HIV, giãn mạch, ức chế hoạt động của enzyme PTP1B trên chuột [21]

a) Hoạt tính chống oxi hóa

Cho đến nay, khá nhiều các công bố chứng minh rằng các hợp chất

phân lập được từ chi Balanophora có hoạt tính chống oxi hóa mạnh Phần

lớn các nghiên cứu này thực hiện dựa trên khả năng thu dọn gốc tự do DPPH Các tác giả cũng chỉ ra rằng, những hợp chất dạng tanin, hay hợp chất chứa nhiều nhóm galloyl, catechol thường thể hiện hoạt tính chống oxi hóa tốt hơn

cả [15, 19, 20]

b) Ức chế hoạt động của enzyme tyrosinase, α-glucosidase

Tyrosinase là một enzyme xúc tác cho qua trình oxi hóa tổng hợp ra melanin, một yếu tố quan trong quyết định sắc tố da Sự sản sinh quá nhiều melanin sẽ dẫn đến sạm da, đen da, và đẩy nhanh quá trình lão hóa da Ngoài

ra, melanin cũng là yếu tố gây ra các vết sạm, nám trên hoa quả Do đó các chất ức chế sự hoạt động của enzyme tyrosinase ngoài ý nghĩa ứng dụng làm trắng da trong mỹ phẩm, nó còn giúp cải thiện chất lượng của thực phẩm trong ngành công nghiệp thực phẩm Trong nghiên cứu tìm kiếm các chất có nguồn gốc thiên nhiên có tác dụng ức chế hoạt động của enzyme tyrosinase,

dịch chiết EtOH 50% từ loài B fungosa thể hiện hoạt tính tốt với giá trị IC5015.0 µg/mL Tiếp đó, nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học loài B

fungosa cho thấy hợp chất phenolic 1-O-(E)-ca HHDP-β-D- glucopyranose và 1-O-(E)-caffeoyl-3,4,6-tri-O-galloyl-β-D-

ffeoyl-3-O-galloyl4,6-(S)-glucopyranose là những chất thể hiện hoạt tính [14]

1.2 Tổng quan về phương pháp chiết mẫu thực vật

Mẫu cây sau khi thu hái về đem rửa sạch, để ráo nước sau đó làm khô, tùy thuộc vào đối tượng chất có trong mẫu khác nhau (chất phân cực, không phân cực, chất có độ phân cực trung bình,…) mà ta lựa chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau

1.2.1 Chọn dung môi chiết

Chiết suất là quá trình dùng dung môi thích hợp để hòa tan các chất tan

có trong cây, chủ yếu là các chất đang nghiên cứu, sau đó tách chúng ra khỏi phần không tan của cây Chính vì vậy, cần phải có sự hiểu biết về những đặc tính của những chất chuyển hóa thứ cấp trong cây được chiết, từ đó lựa chọn dung môi thích hợp cho sự phân hủy chất bởi dung môi và quá trình tạo thành chất mong muốn

Dung môi dùng cho các quá trình chiết phải được lựa chọn rất cẩn thận Dung môi phải hòa tan những chất chuyển hóa thứ cấp đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu), không độc, không dễ bốc cháy và giá thành phù hợp Nếu dung môi có lẫn các tạp chất có thể gây ảnh hưởng tới hiệu quả và chất lượng của quá trình chiết vì vậy những dung môi này nên được chưng cất để được dạng sạch trước khi sử dụng Thường có lẫn một số chất dẻo trong các dung môi như các diankinphtalat, tri-n-butyl-axetylcitrar, tributyl phosphat trong quá trình sản xuất hoặc trong quá trình bảo quản (dung môi trong các thùng chứa nhựa)

Methanol và chlorofrom thường chứa dioctylphtalat [di-(2etylhexyl)- phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat] Chất này làm sai lệch kết quả phân lập trong quá trình nghiên cứu hóa thực vật, thể hiện hoạt tính trong thử nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây Chlorofrom, metylen clorit và methanol là những dung môi thường được lựa chọn trong quá trình chiết sơ

bộ một phần của cây như: lá, thân, rễ, hoa, Chlorofrom có thể gây tổn thương cho gan và thận nên khi làm việc với chất này cần thao tác khéo léo, cẩn thận ở nơi thoáng mát và phải đeo mặt nạ phòng độc Metylen cloritits độc hơn và dễ bay hơi hơn chlorofrom

Methanol và ethanol 80% là những dung môi phân cực hơn các hidrocacbon thế clo Người ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rượu sẽ

thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu được lượng lớn các thành phần trong tế bào

Ngược lại chlorofrom lại có độ phân cực thấp hơn, nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào Các ancol hòa tan phần lớn các chất chuyển hóa phân cực cùng với các hợp chất phân cực trung bình và thấp Vì vậy, các chất này cũng bị hòa tan đồng thời khi chiết bằng ancol Trong quá trình chiết sơ

bộ người ta thường dùng dung môi cồn trong nước

Người ta thường ít khi sử dụng nước để thu được dịch chiết thô từ cây

mà thay vào đó là dung dịch nước của methanol Đietyl ete hiếm khi được dùng cho các quá trình chiết thực vật và nó sẽ bay hơi, bốc cháy và rất độc, đồng thời nó có xu hướng tạo thành peoxit dễ nổ Peoxit của đietyl ete dễ gây phản ứng oxi hóa với các hợp chất không có khả năng tạo cholesterol như các carotenoid Axeton cũng có thể tạo thành axetoit nếu 1,2-sis-diol có mặt trong môi trường axit Quá trình chiết dưới điều kiện axit hoặc bazơ thường được dùng với quá trình phân tách đặc trưng, cũng có khi xử lý các dịch chiết bằng axit- bazơ có thể tạo thành những sản phẩm mong muốn

Sau khi chiết dung môi được cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ không quá 30-40oC, với một vài hóa chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt

độ cao hơn

1.2.2 Quá trình chiết

Bằng cách lặp đi lặp lại việc chiết một vài lần, ta có thể tách hoàn toàn chất cần tinh chế vào dung môi đã chọn, sau đó cất loại dung môi và cất lấy chất tinh khiết ở nhiệt độ và áp suất thích hợp Đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời gian Tuy nhiên, trong quá trình chiết một mẫu thực vật chỉ thực hiện qua ba lần dung môi vì khi đó cặn thu được hầu như không còn chứa những chất giá trị nữa và bình chiết ngâm không được sử dụng như

phương pháp chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng 24 giờ, sau đó lấy chất chiết ra Việc kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một vài cách như:

- Với các ankaloid ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của hợp chất này bằng sự tạo thành kết tủa với những tác nhân đặc trưng như tác nhân Đragendroff và tác nhân Maye

- Các flavonoid thường là những chất màu vì vậy dịch chảy ra mà không có màu thì chứng tỏ đã rửa hết chất này trong quá trình chiết

- Khi chiết các chất béo thì nồng độ trong các phần của dịch chiết ra và

sự xuất hiện của cặn chiết tiếp theo sau đó sẽ biểu thị sự kết thúc quá trình chiết

Người ta cũng thường chiết một chất từ hỗn hợp rắn bằng một dung môi hoặc hỗn hợp dung môi với một dụng cụ chuyên dùng đặc biệt được gọi

là bình chiết Xoclet Phương pháp này dựa trên nguyên tắc hóa hơi Dung môi tinh khiết được đun nóng, cho bay hơi liên tục chảy vào bình chứa hỗn hợp cần chiết tách, dung môi sẽ hòa tan chất rắn cần tinh chế và nhờ một ống xiphong, dung dịch chảy suống bình cầu bên dưới, dung môi nguyên chất lại tiếp tục được cất lên Phương pháp này tiết kiệm được dung môi và hiệu quả tương đối cao

Như vậy, tùy thuộc vào mục đích cần chiết lấy chất gì mà người ta lựa chọn dung môi phù hợp và thực hiện quá trình chiết hợp lí để đạt được hiệu quả cao

1.3 Tổng quan về phương pháp sắc ký

Phương pháp sắc ký là một phương pháp phổ biến và hữu hiệu nhất hiện nay, phương pháp này được sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các chất hữu cơ nói chung và hợp chất thiên nhiên nói riêng

1.3.1 Đặc điểm chung của phương pháp sắc ký

Sắc ký là phương pháp tách, phân tích, phân li các chất dựa trên sự phân chia khác nhau của các chất khác nhau giữa hai pha luôn tiếp xúc và không hòa tan lẫn nhau: pha tĩnh và pha động Khi tiếp xúc với pha tĩnh các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan,…) Tốc độ di chuyển của các chất trong pha động khi tiếp xúc mật thiết một pha tĩnh có sự khác nhau là do khả năng bị hấp phụ và phản hấp phụ hoặc do khả năng trao đổi khác nhau của các chất ở pha động với các chất ở pha tĩnh

Kết quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tương tác yếu hơn với pha này Từ các đặc điểm trên mà người ta có thể tách các chất nhờ quá trình sắc ký

1.3.2 Cơ sở của phương pháp sắc ký

Phương pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha dộng và pha tĩnh Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật hấp phụ đơn phân tử đặc biệt langmuir mô tả sự phụ thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nồng độ của dung dịch (hoặc với chất khí là áp suất riêng phần)

α

n bCn

1.3.3 Phân loại phương pháp sắc ký

Phương pháp sắc ký là một phương pháp được sử dụng khá phổ biến và rộng rãi Tùy thuộc vào bản chất của pha tĩnh hay pha động hay cách thức triển khai sắc ký mà người ta phân loại thành các phương pháp sắc ký khác

nhau như: sắc ký khí, sắc ký lỏng, sắc ký lọc gel, sắc ký ái lực, sắc ký cột, sắc

ký, sắc ký lớp mỏng,… Tùy theo mục đích nghiên cứu và đối tượng cần phân lập người ta lựa chọn những phương pháp sắc ký phù hợp

1.3.3.1 Sắc ký cột

Sắc ký cột là phương pháp được sử dụng để phân lập các hợp chất hữu

cơ từ nguồn tự nhiên Trong phương pháp này, pha tĩnh là những hạt có kích thước tương đối lớn (50-150 μm), được nạp trên các cột thủy tinh Mẫu chất cần phân tích được đặt trên đầu cột, phía trên pha tĩnh (có một lớp thủy tinh che chở để lớp mặt không bị xáo trộn), bình chứa dung môi giải ly được đặt phía trên cao Dung môi giải ly ra khỏi cột ở phía bên dưới cột được hứng vào những lọ nhỏ đặt ngay ống dẫn ra của cột Pha tĩnh được nạp lên cột sắc ký theo hai phương pháp khác nhau là nạp ướt hoặc nạp khô

Phương pháp nạp khô, chất hấp phụ được đưa trực tiếp vào cột khi còn khô, sau đó dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành cột để chất hấp phụ sắp xếp chặt trong cột Sau đó dùng dung môi chạy cột để chạy cột đến khi cột trong suốt

Phương pháp nạp ướt, chất hấp phụ được hòa tan trong dung môi chạy cột trước với lượng dung môi tối thiểu Sau đó đưa dần vào cột đến khi đủ lượng cần thiết Khi chuẩn bị cột phải lưu ý không được để bọt khí bên trong (nếu có bọt khí gây nên hiện tượng chạy rối trong cột và giảm hiệu quả tách)

và cột không bị nứt, gãy, dò

1.3.3.2 Sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng (SKLM) hay còn gọi là sắc ký phẳng, dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp phụ Trong đó pha động là một dung môi hay một hỗn hợp dung môi, di chuyển qua một pha tĩnh là một chất hấp phụ trơ ví dụ: silicagel, oxit alumin,… Pha tĩnh được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên trên nền phẳng như tấm kính hay tấm nhôm Do chất hấp phụ được tráng

thành một lớp mỏng nên phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng

 Bình sắc ký: Một chậu, lọ bằng thủy tinh có nắp đậy

 Pha tĩnh: Một lớp mỏng khoảng 0,25-0,5 nm của một loại hợp chất hấp phụ như silicagel, alumin được tráng thành lớp mỏng, đều, phủ lên trên tấm kính, tấm nhôm Chất hấp phụ trên nhờ giá đỡ sulphat canxi khan, tinh bột hay một loại polymer hữu cơ

 Mẫu phân tích: Thường là hỗn hợp gồm nhiều chất với độ phân cực khác nhau Sử dụng khoảng 1ul dung dịch mẫu với nồng độ pha loãng 2-5%, nhờ một vi quản để chấm thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí phải trên cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng chứa trong bình

 Pha động: Dung môi hay hỗn hợp hai dung môi di chuyển chầm chậm dọc theo bản mỏng và lôi kéo mẫu chất phân tích đi theo nó Tùy theo khả năng hấp phụ - giải hấp phụ của mỗi chất mà chúng sẽ di chuyển với vận tốc khác nhau và quãng đường khác nhau trên bản mỏng

Phương pháp sắc ký lớp mỏng có ưu điểm là chỉ cần một lượng rất ít mẫu để phân tích, có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng trong cùng điều kiện phân tích, tất cả các hợp chất trong mẫu phân tích có thể được định vị trên tấm sắc ký lớp mỏng

Chính vì vậy với mục đích là phân tích định tính hay sử dụng làm chỉ thị cho sắc ký cột để phân lập các hợp chất hữu cơ người ta sẽ sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng

1.4 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ

Cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ có thể được xác định nhờ vào phương pháp phổ kết hợp Tùy thuộc vào cấu trúc hóa học của từng loại chất

mà người ta sử dụng phương pháp phổ cụ thể như: phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NRM), phổ khối lượng,… hay chuyển hóa hóa học Cấu trúc càng phức tạp thì yêu cầu phối hợp với các