Khảo Sát Thành Phần Hóa Học Cao Ethyl Acetate Của Loài Địa Y Roccella Montagnel

ĐẠI HỌC SƢ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA HÓA HỌC - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HĨA HỌC CAO ETHYL ACETATE CỦA LỒI ĐỊA Y ROCCELLA MONTAGNEI GVHD: TS DƢƠNG THÚC HUY SVTH: NGUYỄN THỊ QUỲNH NHƢ MSSV: K40.201.059 Thành phố Hồ Chí Minh, năm 2018 Xác nhận Hội đồng phản biện: KÍ TÊN VÀ DUYỆT (Kí ghi rõ họ tên) LỜI CẢM ƠN Trong thời gian học tập rèn luyện Khoa Hóa học, trường Đại Học Sư Phạm Thành Phố Hồ Chí Minh, thân em tiếp nhận nhiều kiến thức kĩ cần thiết để tự tìm tịi phát triển thân Em xin cảm ơn thầy Dương Thúc Huy tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện cho em suốt trình thực lúc hồn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô anh chị, bạn sinh viên Khoa Hóa học hỗ trợ cho em thời gian làm khóa luận tốt nghiệp Tuy nghiên, kinh nghiệm chưa thật dày dặn thời gian có hạn hạn chế mặt vật chất nên khóa luận khơng thể tránh khỏi sai sót, em mong nhận thơng cảm góp ý từ phía q thầy cô người Em xin chân thành cảm ơn! i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU iv DANH MỤC HÌNH ẢNH v DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC PHỤ LỤC v LỜI MỞ ĐẦU Error! Bookmark not defined CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Định nghĩa phân loại địa y 1.2 Vai trò sinh thái hợp chất tự nhiên địa y 1.3 Nghiên cứu hoá học hợp chất địa y 1.4 Nghiên cứu hóa học số loài địa y thuộc chi Roccella 1.5 Hoạt tính địa y hợp chất địa y 1.5.1 Hoạt tính động vật 1.5.2 Hoạt tính điều tiết tăng trưởng thực vật bậc cao 1.5.3 Hoạt tính kháng virus ức chế enzyme virus hợp chất địa y 1.5.4 Hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm hợp chất địa y 1.5.5 Hoạt tính gây độc tế bào kháng đột biến hợp chất địa y 12 CHƢƠNG THỰC NGHIỆM 15 2.1 Máy móc, thiết bị, hóa chất 15 2.2 Thu hái xử lý mẫu nguyên liệu, ly trích cô lập hợp chất 15 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18 3.1 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất DS 18 ii 3.2 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất R1 18 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 19 4.1 Kết luận 19 4.2 Đề xuất 19 TÀI LIỆU THAM KHẢO 20 PHỤ LỤC Error! Bookmark not defined iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU Ac Acetone AcOH Acid acetic br Mũi dãn rộng (Broad) C Chloroform DMSO Dimethyl sulfoxide d Mũi đôi (Doublet) EA Ethyl acetate H n-hexane HMBC Tương quan 1H-13C qua 2, nối (Heteronuclear Multiple Bond Coherence) HSQC Tương quan 1H-13C qua nối (Heteronuclear Single Quantum Correlation) IC50 Nồng độ ức chế phát triển 50% số tế bào thử nghiệm (Half Maximal Inhibitory Concentration) J Coupling constant (Hằng số tương tác spin-spin) NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) s Mũi đơn (Singlet) SKC Sắc ký cột δ Chemical shift (Độ chuyển dịch hóa học) iv DANH MỤC HÌNH ẢNH VÀ SƠ ĐỒ Hình 1.1 Ba dạng địa y Hình 1.2 Sinh tổng hợp hợp chất từ địa y Hình 1.3 Các hợp chất lập từ địa y thuộc chi Rocella Hình 1.4 Một số hợp chất lập từ địa y Hình 2.1 Địa y Rocella montagnei Hình 3.1 Một số tương quan HMBC hợp chất DS Hình 3.2 Một số tương quan HMBC hợp chất R1 Hình 4.1 Cấu trúc hai hợp chất cô lập Sơ đồ 2.1 Sơ đồ sắc ký cột cao n-hexane Sơ đồ 2.2 Sơ đồ sắc kí cột cao ethyl acetate DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Hoạt tính điều tiết tăng trưởng thực vật bậc cao Bảng 1.2 Hoạt tính kháng virus ức chế enzyme virus hợp chất địa y Bảng 1.3 Hoạt tính ức chế enzyme số hợp chất cô lập từ địa y Bảng 1.4 Hoạt tính ức chế enzyme số hợp chất lập từ địa y Bảng 1.5 Hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm hợp chất địa y Bảng 1.6 Hoạt tính gây độc tế bào kháng đột biến hợp chất địa y Bảng 3.1 So sánh số liệu phổ NMR hợp chất DS, acid lecanoric acid diorcinolic Bảng 3.2 So sánh số liệu phổ NMR hợp chất R1 lecanorin DANH MỤC PHỤ LỤC Phụ lục Phổ 1H 13C-NMR hợp chất DS Phụ lục Phổ HSQC HMBC hợp chất DS Phụ lục Phổ 1H 13C-NMR hợp chất R1 Phụ lục Phổ HSQC HMBC hợp chất R1 v LỜI MỞ ĐẦU Trong khoảng 20 năm trở lại đây, nghiên cứu hóa học sinh học địa y giới trở nên phổ biến Địa y thực vật bậc thấp, kết cộng sinh tảo nấm Nhờ dạng sống này, địa y sống nhiều nơi đất đá, thân cây, cây, điều kiện môi trường từ vùng khô hạn đến khắc nghiệt Ở Việt Nam, người ta dễ dàng tìm thấy có mặt địa y nơi quen thuộc với phân bố phong phú đa dạng Từ xưa, người biết sử dụng địa y vào nhiều mục đích khác làm thực phẩm, men rượu, phẩm nhuộm Địa y Evernia prunastri sử dụng ngành kỹ nghệ mỹ phẩm để làm chất định hương Một vài loại hợp chất polyphenol có địa y có khả hấp thu tia UVB nên chúng sử dụng làm kem chống nắng Quan trọng hết địa y sử dụng để chữa số bệnh bệnh lao, bệnh dại, cảm sốt, ho, vết thương da Địa y Lobaria pulmonaria sử dụng để chữa bệnh liên quan đến đường hô hấp, viêm khớp (Atalay 2011 [1], Suleyman 2003 [2]), địa y Parmelia sulcata chữa bệnh sọ não, loài Peltigera sử dụng để chữa trị bệnh dại (Barrington 1974 [3]) Địa y Cetraria islandica sử dụng Thuỵ Điển làm thuốc chữa bệnh đái tháo đường, viêm phổi (Ahmadjian 1963 [4]) Các nghiên cứu cho biết địa y thường chứa loại hợp chất thơm depside, depsidone, depsone, dẫn xuất dibenzofuran hợp chất có màu xanthone, antraquinone dẫn xuất acid usnic (Devehat 2007 [5]) Nhiều loại depsidone có đa dạng hoạt tính sinh học đặc biệt ức chế enzyme liên quan đến bệnh chuyển hóa người [6] Nhằm phát triển nghiên cứu thành phần hóa học loài địa y sinh trưởng Việt Nam nói chung mở rộng nghiên cứu lồi địa y Roccella montagnei, chúng tơi lựa chọn đề tài “Khảo sát thành phần hóa học cao ethyl acetate loài địa y Roccella montagnei” CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Định nghĩa phân loại địa y Địa y dạng thực vật bậc thấp đặc biệt, kết cộng sinh nấm (mycobiont) thành phần quang hợp (photobiont) thường tảo (green alga) hay vi khuẩn lam (cyanobacterium) Hiện có khoảng 17.000 lồi địa y tìm thấy Thơng thường địa y chia làm dạng: dạng khảm, dạng phiến dạng sợi (Choi cộng sự, 2008)[7]: Xanthoria sp., (Crustose lichen) Flavoparmelia caperata, (Foliose lichen) Letharia vulpina, (Fructicose lichen) Hình 1.1 Ba dạng địa y Thành phần tảo địa y sản sinh carbohydrate trình quang hợp, cịn thành phần nấm sản sinh hợp chất tự nhiên (để chống tia UV, ngăn chặn sâu bọ loài động vật ăn cỏ, …), cung cấp nước khoáng chất Kết từ cộng sinh giúp địa y sinh trưởng sống sót điều kiện khắc nghiệt, chủ yếu vùng vĩ độ cao, vùng nhiệt đới, diện khắp nơi đá, đất, cây, thân cây, kim loại, thủy tinh (Choi cộng sự, 2008)[7] Ðể hiểu chất địa y giải thích nguồn gốc chúng, nhà thực vật học thử tổng hợp địa y từ tế bào tảo nấm Mặc dù hai thành phần nuôi cấy riêng rẽ việc tổ hợp lại thành địa y thật khó khăn 1.2 Vai trò sinh thái hợp chất tự nhiên địa y  Bảo vệ trồng bậc thấp bậc cao  Các hợp chất thơm hấp thụ tia UV, bảo vệ địa y chống lại xạ có hại  Các acid carboxylic từ địa y tác chất tạo phức mạnh giúp cho địa y lấy khoáng chất từ vật chủ nơi địa y bám vào (substrate) (Choi cộng sự, 2008)[7]  Giúp xua đuổi thú ăn thịt trùng 1.3 Nghiên cứu hố học hợp chất địa y Có nhiều hệ thống phân loại hợp chất hóa học từ địa y, sử dụng nhiều hệ thống phân loại Shibata công đề nghị (Huneck 1997)[8]: Các hợp chất hóa học địa y chia làm ba nhóm dựa theo nguồn gốc sinh tổng hợp chúng (Hình 1.2)  Nguồn gốc acid shikimic: terphenylquinone dẫn xuất acid tetronic  Nguồn gốc acid mevalonic: triterpenoid  Nguồn gốc acetate-malonate: acid dây dài acid phenol Tảo Nấm Hình 1.2 Sinh tổng hợp hợp chất từ địa y 1.5.1 Hoạt tính động vật Acid caperatic cao chiết xuất từ địa y Flavoparmelia baltimorensis Xanthoparmelia cumberlvàia kìm hãm tăng trưởng lồi ốc Pallifera varia Các hợp chất phenol đơn vòng gây độc ấu trùng loài giun Toxocara canis Atranorin, pulvinic acid dilactone, calycin, parietin, acid evernic, acid psoromic, acid physodic, acid 3-hydroxyphysodic, acid fumarprotocetraric, acid stictic, acid norstictic, acid salazinic, acid vulpinic, acid rhizocarpic acid usnic làm giảm tăng trưởng ấu trùng ăn tạp Spodoptera littoralis không ảnh hưởng đến sống chúng 1.5.2 Hoạt tính điều tiết tăng trƣởng thực vật bậc cao Một số hợp chất từ địa y thể hoạt tính điều tiết tăng trưởng thực vật bậc cao Bảng 1.1 Bảng 1.1 Hoạt tính điều tiết tăng trƣởng thực vật bậc cao Địa y hợp chất địa y Hoạt tính Acid barbatic, acid 4-O-demethylbarbatic, acid Ức chế tăng trưởng rau diffractaic, acid evernic, acid lecanoric, acid β- diếp orcinolcarboxylic, acid orsellinic Ergochrome AA (acid secalonic A) Gây độc cho thực vật Acid evernic Giảm nồng độ chất diệp lục rau bina Acid lecanoric Nguyên nhân gây bất thường cho gốc Allium cepa Các hợp chất phenol đơn vịng Hoạt tính ức chế độc chất thực vật Các quinone từ Pyxine spp Ức chế nguyên phân rễ Allium cepa Acid usnic Ức chế nảy mầm phát triển Lepidium sativum 1.5.3 Hoạt tính kháng virus ức chế enzyme virus hợp chất địa y Anthraquinone emodin chất tương tự có hoạt tính kháng virus Hypericin có hoạt tính đáng kể chống lại chép ngược virus HIV (antiretroviral) Các hợp chất 7,7’-dichlorohypericin 5,7-dichloroemodin có hoạt tính mạnh virus HSV-1 (virus bệnh sinh dục herpes đơn dạng loại 1) anthraquinone monochloro có hoạt tính giảm Hoạt tính dường tăng theo số lượng nguyên tử Cl cấu trúc (Muller 2001)[18] Các hợp chất thơm lập từ lồi địa y depsidone, depside diphenyl ether thể hoạt tính ức chế mạnh nhiều loại enzyme Bảng 1.2 Hoạt tính kháng virus ức chế enzyme virus hợp chất địa y Hợp chất Virus enzyme virus Depsidone: acid virensic dẫn xuất tương tự Hệ enzyme đặc hiệu đính thể nguyên thực khuẩn vào nhiễm sắc thể virus HIV Acid butyrolactone: acid protolichesterinic Nhân HIV (+)-Acid usnic depside khác Virus Epstein-Barr (EBV) Emodin, 7-cloroemodin, 7-chloro-1-Omethylemodin, 5,7-dichloroemodin, hypericin HIV, cytomegalovirus virus khác Từ địa y Lobaria pulmonaria (L.) Hoffm, thu hái núi Zelengora (Bosnia), hai hợp chất depsidone lập, là: diacid 4-formyl-8-hydroxy-1,9-dimethyl-3methoxy-11-oxo-11H-dibenzo[b,e][1,4]dioxepin-6,7-carboxylic 7,8-diacetoxy-4- formyl-1,9-dimethyl-3-methoxy-11-oxo-11H-dibenzo[b,e][1,4]dioxepin [6] Thử nghiệm hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase phương pháp sắc ký lớp mỏng cho thấy hợp chất diacid khơng có hoạt tính hợp chất mang hai nhóm acetate lại có hoạt tính nồng độ g/ mL, so với chất đối chứng dương galanthamine hoạt tính nồng độ 0,01 g/ mL [6] Depsidone acid lobaric [9] ức chế mạnh nhiều loại enzyme 12(S)lipoxygenase platelet-type (IC50 28,5 µM), 5-lipoxygenase (IC50 7,3 µM), protein tyrosine phosphate 1B (PTP1B, IC50 0,87 µM), cyclogenase (IC50 29,2 µM) Các hợp chất diphenyl ether pseudodepsidone (H1) (H2) [7] có khả ức chế mạnh dòng enzyme PTP1B với giá trị IC50 6,86 2,48 µM depside acid baeomyceric ức chế enzyme 5-lipoxygenase với giá trị IC50 8,3 µM Một số hợp chất địa y khác ức chế vài loại enzyme thống kê Boustie (2010) [6] Muller (2001) [15], minh họa Bảng 1.1 1.2 1.5.4 Hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm hợp chất địa y Các hợp chất từ địa y hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn hiệu Acid protolichesterinic thử nghiệm in vitro kháng khuẩn Helicobacter pylori (acid thành phần thuốc cổ truyền giảm đau dày với tên Iceland moss) (Muller 2001)[18] Một số lượng lớn hợp chất địa y kiềm hãm phát triển vi khuẩn hay nấm alectosarmentin, pannarin chloropannarin, emodin physcion, acid evernic, acid leprapinic dẫn xuất, hợp chất phenol đơn vòng, acid puvinic dẫn xuất, acid usnic dẫn xuất (Bảng 1.3) (Muller 2001)[18] Khả kháng nấm hợp chất địa y đánh giá dựa giá trị MIC, thí dụ hợp chất parietin, fallacinal, emodin (Boustie 2010) [6] Trong hợp chất địa y, acid usnic dẫn xuất cho thấy hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhiều dịng vi khuẩn Hình 1.4 Một số hợp chất cô lập từ địa y 10 Bảng 1.3 Hoạt tính ức chế enzyme số hợp chất lập từ địa y [6] Tên hợp chất Loại enzyme (H8) Ức chế mức độ trung bình enzyme protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) (IC50= 63,5 µM) Depside acid baeomycesic Ức chế yếu enzyme 12(S)-lipoxygenase platelettype (100 µg/mL: 15%) Depside atranorin (H4) Ức chế enzyme 5-lipoxygenase từ porcine leukocyte (IC50= 8,3 µM) Tridepside tenuiorin (H7) Ức chế enzyme 5-lipoxygenase (IC50= 59,6 µM) Orcinol (H10) Kháng viêm: ức chế enzyme phospholipase synovial fluid A2 (IC50= 0,22 mM) Methyl β-orsellinate (H11) Kháng viêm: ức chế enzyme phospholipase synovial fluid A2 (IC50= 0,26 mM) Acid usnic (H14) Ức chế mức độ trung bình enzyme protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) (IC50= 16,4 µM) Usimines AC (H15, H16) Ức chế mức độ trung bình enzyme protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) (IC50= 16,423,0 µM) Acid (H13) protolichesterinic Ức chế enzyme 12(S)-lipoxygenase platelet-type (IC50= 77,0 µM) Ức chế enzyme 5-lipoxygenase (IC50= 20,0 µM) Acid lichesterinic (H9) Ức chế enzyme 12(S)-lipoxygenase platelet-type (IC50= 77,0 µM) Stereocalpin A (H17) Ức chế mức độ yếu enzyme protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) (IC50= 40,0 µM) cis-9-Octadecenamide (H12) Ức chế enzyme cyclogenase (IC50= 64,3 µM) 11 Bảng 1.4 Hoạt tính ức chế enzyme số hợp chất cô lập từ địa y [18] Hợp chất Enzyme Atranorin (H8) Trypsin, Pankreaselastase, Phosphorylase Bis-(2,4-dihydroxy-6-npropylphenyl)methane, divarinol, cao chiết thô địa y Cetraria juniperina, Hypogymnia physodes and Letharia vulpina Tyrosinase Chrysophanol Glutathione reductase Acid confluentic, methylperlatolic acid 2β-O- Monoaminoxidase B Acid 4-O-methylcryptochlorophaeic Prostataglandinsynthetase Acid (+)-protolichesterinic 5-Lipoxygenase (ngăn cản chép ngược virus HIV) Acid vulpinic Phosphorylase Acid norsolorinic Monoamino oxidase Acid physodic Arginine decarboxylase Acid usnic (H14) Ornithine decarboxylase 1.5.5 Hoạt tính gây độc tế bào kháng đột biến hợp chất địa y Hợp chất từ địa y có khả gây độc tế bào mạnh acid usnic Thử nghiệm kháng u (antitumour) acid usnic khám phá cách thập niên, thử nghiệm lần đầu hệ thống thử nghiệm ung thư phổi Lewis Kupchan Kopperman (1975)[20] Những nghiên cứu mối liên hệ hoạt tính cấu trúc 12 khảo sát kết tính thân dầu (lipophilicity) có ảnh hưởng quan trọng khả gây độc tế bào Hai liên kết hydrogen nội phân tử cấu trúc acid usnic làm tăng tính thân dầu tự nhiên Depside depsidone thể độc tính tế bào tương đối Acid depsidone lobaric acid depside baeomyceic có khả ức chế phát triển 14 dòng tế bào ung thư với giá trị IC50 khoảng 12-65 µg/mL (Boustie 2010) [6] Depsidone pannarin depside sphaerophin ức chế phát triển tế bào ung thư tuyến tiền liệt DU-145 tế bào ung thư da M14 với IC50 khoảng 25-30 µg/mL (Bảng 1.4) (Boustie 2010) [6] Ngồi ra, số hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme trình bày bảng 1.5 Bảng 1.5 Hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm hợp chất địa y Hợp chất Vi khuẩn Acid usnic dẫn xuất Vi khuẩn gram (+), Bacteroides spp., Clostridium perfringens, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus spp., Enterococcus spp., Mycobacterium aurum Acid protolichesterinic Helicobacter pylori Methyl orsellinate, ethyl orsellinate, methyl β-orsellinate, methyl haematommate Epidermophyton floccosum, Microsporum canis, M gypseum, Trichophyton rubrum, T mentagrophytes, Verticillium achliae, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Cvàida albicans Alectosarmentin Staphylococcus aureus, Mycobacterium smegmatitis 1´-Chloropannarin, pannarin Leishmania spp Emodin, physcion Bacillus brevis Acid pulvinic dẫn xuất Drechslera rostrata, Alternaria alternata Vi khuẩn hiếu khí vi khuẩn kỵ khí Acid leprapinic dẫn xuất Vi khuẩn Gram (+) Gram (-) 13 Bảng 1.6 Hoạt tính gây độc tế bào kháng đột biến hợp chất địa y Hợp chất Hoạt tính loại tế bào (-)-Acid usnic Kháng ung thư phổi Lewis, ung thư bạch cầu P388, ức chế phân bào, có hoạt tính chống lại tế bào sừng hóa HaCat Acid protolichesterinic Có hoạt tính chống lại tế bào ung thư bạch cầu K-562 khối u rắn Ehrlich Pannarin, 1-chloropannarin, sphaerophorin Gây độc cho trình tái tạo lympho bào Naphthazarin Có hoạt tính chống lại dịng tế bào sừng hóa Scabrosin ester dẫn xuất, euplectin Gây độc chống lại tế bào murine P815 mastocytoma dòng tế bào khác Hydrocarpone, acid salazinic, acid stitic Có hoạt tính với nhân tế bào gan chuột Acid psoromic, chrysophanol, emodin dẫn xuất Có hoạt tính chống lại tế bào ung thư bạch cầu 14 CHƢƠNG THỰC NGHIỆM 2.1 Máy móc, thiết bị, hóa chất Phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HMBC ghi máy Bruker Avance 500 Phịng Phân tích trung tâm, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP.HCM (phổ 1H-NMR đo tần số 500MHz phổ 13C-NMR đo tần số 125 MHz) Dung mơi sử dụng gồm có: ethyl acetate, acid acetic, acetone, chloroform, methanol, n-hexane cung cấp hãng Chemsol (Việt Nam) Sắc kí cột pha thường sử dụng silica gel kích thước hạt (0.040–0.063 mm, Merck) Sắc kí gel Sephadex sử dụng hạt gel LH-20 2.2 Thu hái xử lý mẫu ngun liệu, ly trích lập hợp chất Địa y Roccella montagnei, họ Rocellaceae thu hái chùa Cổ Thạch, huyện Tuy Phong, tỉnh Bình Thuận, Việt Nam từ tháng 8-2012 Tên khoa học xác định tiến sĩ Holger Thüs, Bảo tàng lịch sử tự nhiên, London, Anh Mẫu ký hiệu số US-B024 lưu tiêu thực vật mơn Hố hữu cơ, Khoa Hố học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh Hình 2.1 Địa y Roccella montagnei Bột khơ địa y nghiền nhỏ (2,600.0 g) ngâm dầm acetone dịch chiết cô quay áp suất thấp Trong trình acetone bay hơi, kết tủa trắng erythrin (204.7 g) xuất dần lọc riêng Phần dung dịch lọc cịn lại tiếp tục quay thu cao acetone thô (395.3 g) Tiến hành chiết lỏng lỏng với dung mơi có độ phân cực tăng dần cô quay dịch chiết thu cao n-hexane (53.6 g), cao ethyl acetate (200.0 g) phần lại (15.9 g) 15 Tiến hành sắc kí cột silica gel pha thường với cao n-hexane, giải ly với hệ dung môi n-hexane: ethyl acetate: acetone (5:1:0.2) để thu phân đoạn H1 (10.8 g), H2 (8.0 g), H3 (5.7 g), H4 (4.5 g), H5 (2.4 g), H6 (1.3 g), H7 (0.7 g), H8 (1.5 g), H9 (4.0 g) Sắc kí gel Sephadex với dung mơi methanol phân đoạn H5 thu phân đoạn H5.1 (516.0 mg), H5.2 (503.0 mg), H5.3 (784.0 mg), H5.4 (316.0 mg), H5.5 (178.0 mg), H5.6 (123.0 mg), H5.7 (1012.0 mg) Tiến hành sắc kí cột silica gel pha thường với phân đoạn H5.3, giải ly với hệ dung môi chloroform: ethyl acetate: acetone: nước (1:2:2:0.01) thu DS (4.2 mg) Bột địa y Roccella montagnei (2,600.0 g) - Ngâm dầm với dung môi actone (10x3.5 L) - Cô quay dịch chiết Kết tủa T (204.7 g) Cao acetone (396.0 g) -Chiết lỏng-lỏng với dung mơi có độ phân cực tăng dần - Cơ quay dịch chiết Cao n-hexane (53.6 g) Phần lại (15.91 g) Cao ethyl acetate (200.0 g) SKC H:EA:Ac (5:1:0.2) H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 (10.8 g) (8.0 g) (5.7 g) (4.5 g) (2.4 g) (1.3 g) (0.7 g) (1.5 g) (4.0 g) Sephadex LH-20 H5.1 H5.2 H5.3 H5.4 H5.5 H5.6 H5.7 (516.0 mg) (503.0 mg) (748.0 mg) (316.0 mg) (178.0 mg) (123.0 mg) (1012.0 mg) SKC C:EA:Ac:H2O (1:2:2:0.01) DS (4.2 mg) Sơ đồ 2.1 Sắc kí cột cao n-hexane 16 Rửa nhiều lần cao ethyl acetate với dung môi acetone thu phần dịch hữu phần tủa (80.0 g) Tiến hành sắc kí cột silica gel pha thường với phần dịch, giải ly với hệ dung môi n-hexane: ethyl acetate: acetone: acid acetic (5:1:2:0.2) để thu 13 phân đoạn EA1 (1.7 g), EA2 (4.1 g), EA3 (1.4 g), EA4 (6.6 g), EA5 (9.0 g), EA6 (9.5 g), EA7 (15.3 g), EA8 (9.4 g), EA9 (5.2 g), EA10 (4.2 g), EA11 (3.9 g), EA12 (10.5 g), EA13 (9.0 g) Từ phân đoạn EA1 (1.7 g) thực sắc kí cột silica gel pha thường, giải ly nhiều lần với hệ dung môi n-hexane: ethyl acetate: acetone (5:1:0.2) thu hợp chất R1 (5.0 mg) Cao ethyl acetate (200 g) Lọc nhiều lần với dung môi acetone Phần tủa (80.0 g) Phần dịch SKC Hex:EA:Ac:AcOH (5:1:2:0.2) EA1 EA2 EA3 EA4 EA5 EA6 EA7 EA8 EA9 EA10 EA11 EA12 EA13 (1.7 g) (4.1 g) (1.4 g) (6.6 g) (9.0 g) (9.5 g) (15.3 g) (9.4 g) (5.2 g) (4.2 g) (3.9 g) (10.5 g) (9.0 g) SKC Hex:EA:Ac (5:1:0.2) R1 (5.0 mg) Sơ đồ 2.2 Sắc kí cột cao ethyl acetate 17 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất DS Hợp chất DS thu từ phân đoạn cao n-hexane loài địa y Roccella montagnei chất dầu, màu vàng Phổ 1H 13C-NMR (phụ lục 1) Phổ HSQC HMBC (phụ lục 2) 3.2 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất R1 Hợp chất R1 thu từ phân đoạn cao ethyl acetate loài địa y Roccella montagnei Phổ 1H 13C-NMR (phụ lục 3) Phổ HSQC HMBC (phụ lục 4) 18 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1 Kết luận Từ mẫu địa y Roccella montagnei thu hái chùa Cổ Thạch, huyện Tuy Phong, tỉnh Bình Thuận lập hai hợp chất DS R1 Bằng phương pháp phổ nghiệm đại kết hợp với so sánh tài liệu tham khảo xác định cấu trúc hai hợp chất hữu gồm Acid diorcinolic 4-carboxydiorcinal Hình 4.1 Cấu trúc hai hợp chất lập 4.2 Đề xuất Vì điều kiện thời gian vật chất không cho phép, nên phạm vi đề tài này, khảo sát phân đoạn cao ethyl acetate Trong thời gian tới, có điều kiện chúng tơi tiến hành khảo sát phân đoạn cao cịn lại Đồng thời chúng tơi tiến hành thử nghiệm số hoạt tính sinh học loại cao hợp chất cô lập 19 TÀI LIỆU THAM KHẢO Atalay F., Halici M B., Mavi A., Cakir A., Odabasoglu F., Kazaz C., Aslan A., Kufrevioglu O I Antioxidant phenolics from Lobaria pulmonaria (L.) Hoffm and Usnea longissima Ach lichen species, Turk J Chem., 35, 647–661, 2011 Süleyman H., Odabasoglu F., Aslan A., Cakir A., Karagoz Y., Gocer F., Halici M., Bayir Y., Anti-inflammatory and antiulcerogenic effects of the aqueous extract of Lobaria pulmonaria (L.) Hoffm., Phytomedicine, 10, 552–557, 2003 Barrington E J W., Willis A J., The biology of lichens: Contemporary biology, 2nd edition, Edward Arnold, London, 10, 159–163, 1974 Ahmadjian V., Nilsson S Swedish Lichens Yb Am Swed Hist Fdn., 1963 Devehat F L.-L., Tomasi S., Elix J A., Bernard A., Rouaud I., Uriac P., Boustie J Stictic acid derivatives from the lichen Usnea articulate and their antioxidant activities, J Nat Prod., 70, 1218–1220, 2007 Boustie J., Tomashi S., Grube M., Bioactive lichen metabolites: alpine habitats as an untapped source, Phytochemistry Review, 10(3), 287–307, 2011 Yit Heng Choi, Generic potential of lichen-forming fungi in polyketide biosynthesis, A thesis for Doctor of Philosophy, RMIT University, 10-15, 2008 Huneck S., Yoshimura I., Identification of lichen substances, Springer, Berlin, 155−311, 1997 Duong T H., Huynh B L C., Chavasiri W., Chollet-Krugler M., Nguyen V K., Nguyen T H T., Hansen P E., Pogam P L., Thüs H., Boustie J., Nguyen K P P., New erythritol derivatives from the fertile form of Roccella montagnei, Phytochemistry, 137, 156-164, 2017 10 Huneck S., Jakupovic J., Follmann G., 9-Methylpannarate from the lichen Roccella capesis Z Naturforsch, 969-970, 1991b 11 Culberson C F., Chemical and botanical guide to lichen products Univ North Carolina Press, Chapel Hill, 1969 12 Alberhart D J., Overton K H., Huneck S., Studies on lichen sunstance Part LXII Aromatic constituents of the lichen Roccella fuciformis DC A recised structure for lepraric acid J Chem Soc, 704-707, 1969 20 13 Marcuccio S M., Elix J A., A structual revision of picroroccellin , Tetrahedron Lett., 1445-1448, 1983 14 O’Donovan D G., Robert G., Keogh M F., Structure of the β-orcinol depsidones, connorstictic acid and consalazinic acid, Phytochemistry, 19, 2497−2499, 1980 15 Sakurai A., Goto Y., Chemical studies on the lichen I The structure of isolecanoric acid, a new ortho-depside isolated from Parmelia tinctorum Despr., Bulletin of the Chemical Society of Japan, 60, 1917−1918, 1987 16 Le Hoang Duy, Chemical study of common lichens in the south of Vienam, A thesis for Doctor of Philosophy, Kobe Pharmaceutical University, 2-8, 2012 17 Huneck S., “The significance of lichens and their metabolites”, Naturwissenschaften, 86, 559–570, 1999 18 Muller K., Pharmaceutically relevant metabolites from lichens, Applied Microbiology and Biotechnology, 56, 9−16, 2001 19 S Morris Kupchan, Herbert L Kopperman, “l-Usnic acid: Tumor inhibitor isolated from lichens”, Experientia, 31, 625-625, 1975 20 Liu S., Wang H., Su M., Hwang GJ., Hong J., Jung JH., New metabolites from the sponge-derived fungus Aspergillus sydowii J05B-7F-4, Natural product research, 2-5, 2017 21 Choudhary M I., Meher A., Wahab A., Khan A.; Rasheed S., New antiglycation and enzyme inhibitors from Parmotrema cooperi, Science China Chemistry, 54, 19261931, 2011 21 ... tài ? ?Khảo sát thành phần hóa học cao ethyl acetate lồi địa y Roccella montagnei” CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Định nghĩa phân loại địa y Địa y dạng thực vật bậc thấp đặc biệt, kết cộng sinh nấm (mycobiont)... chúng đặc hiệu địa y hoá học hợp chất tự nhiên Tuy v? ?y, khảo sát hoá học địa y bị hạn chế nguồn cung có hạn, địa y phát triển chậm Những nghiên cứu gần cho th? ?y việc ni c? ?y địa y phịng thí nghiệm... loại địa y 1.2 Vai trò sinh thái hợp chất tự nhiên địa y 1.3 Nghiên cứu hoá học hợp chất địa y 1.4 Nghiên cứu hóa học số loài địa y thuộc chi Roccella 1.5 Hoạt tính địa