Khi đổ môi trường vào đĩa phải để miệng bình sâu vào giữa đĩa rồi đổ 1 lớp mỏng, tránh để môi trường dính trên thành bình=> tránh khuẩn lạc mọc lên thành bình và tránh vi sinh vật b[r]
(1)ĐỀ CƯƠNG ÔN TẬP VI SINH VẬT MÔI TRƯỜNG
GV: Nguyễn Ngọc Tâm Huyên Buổi 1:
Phân cơng nhóm lấy mẫu: 10sv- Mt Lacto Broth
2 10sv- Mt Gause ( có mơi trường sẵn) 10sv- Mt Czapek
4 Nhóm lấy nước thải vs E.Coli
5 Nhóm lấy mẫu đất phân giải Cellulose Bước thực hành:
I. Khử trùng đĩa Peptri II. Chuẩn bị 40 ống nước cất
III. Chuẩn bị môi trường LactoBroth
IV. Lấy mẫu đất gốc cây, nước thải động vật máu nóng, cơm nguội V. Pha loãng dung dịch đất
VI. Cấy dung dịch dất qua Gauss VII. Chuẩn bị môi trường Czapek VIII. Pha loãng nước thải
IX. Cấy lên mơi trường Lacto Broth X. Pha lỗng dung dịch tinh bột XI. Cấy lên môi trường Czapek
Chi tiết thực
Cách khử trùng đĩa peptri:
1 Dùng cồn khử trùng đĩa peptri Gói đĩa peptri bang giấy báo
(2)Chuẩn bị ống nước cất
1 Cho 9ml nước cất vào ống nghiệm,
2 Sau dùng Bơng mỡ làm nút đóng kín miệng Gói giấy báo 3-4 (7 đẹp) ống nghiệm/1 tờ Đặt lên khay ống nghiệm đặt vào cốc Sau đem khử trùng ẩm chúng với Lacto-Broth
Chuẩn bị môi trường Lacto-Broth
Môi trường Lacto-Broth môi trường tăng sinh: Giàu chất dinh dưỡng cho phép Vi sinh vật tổn thương, già yếu, sinh, non phục hồi chức dinh dưỡng tạo thành hệ
Vì mơi trường có nhiều vi sinh vật phát triển sinh trưởng Bước :
Pha mt LB theo hướng dẫn, dùng cân vi lượng để cân hóa chất (tốt phải phịng kín khơng có gió, người thực hiện, để cân xác cân dễ sai số có tác động bên ngoài)
Cho ống durham vào phần miệng ống úp ngược xuống để nhận biết ecoli khí CO2 sinh ống durham, dung dịch chuyển màu, có huyền phù > ống dương tính (trong ngày có tượng)
Thêm 5ml mt LB (có thể nhiều tí, chủ yếu mt LB phải ngập qua ống durham)
Gói bơng ống nghiêm gói giấy Khử trùng ẩm
Nồi hấp: Chuẩn bị nồi hấp
Cho nước cất vào không vạch nâng đỡ đáy lồng hấp (tránh ướt lồng hấp) Cho lồng hấp vào
Đóng nắp nồi hấp, vặn khóa hai đầu đối diện ( lần đầu không chặt) sau siết chặt đơi
(3)Cách hấp:
Đóng cơng tắc ( bật lên) , chỉnh nhiệt độ ( 121oC), chỉnh thời gian (25’p) Sau đạt đủ thời gian cài trước- nồi hấp báo chuông- ngắt công tắc, đợi
cho áp suất nồi ấp giảm xuống từ từ=> tuyệt đối khơng mở van xả khí làm thay đổi áp suất đột ngột làm nứt dụng cụ thủy tinh bên trong……
Đợi áp suất giảm xuống phân nửa sau mở từ từ van xả khí, dùng gắp mang lồng hấp ngồi
Lấy mẫu đất gốc cây, nước thải động vật máu nóng, cơm nguội:
Mẫu đất:
o Hớt nhẹ lớp đất mặt từ 1-3cm bỏ để loại vsv ngoại lai, lấy phần đất phía có VSV địa
o Lấy gần gốc cây, để lấy xác vsv phân giải cellulozo cho nguyên cứu phân lập vsv p/giai cellulozo
Nước thải:
o Có ecoli (ecoli sống mt động vật máu nóng) o Khơng lấy mẫu nước thải đầy chai (???)
Cơm nguội:
o Lấy cơm qua 2-3 ngày (lên men) có nhiều vsv phân giải tinh bột
Cách đổ môi trường:
Nguyên tắc đổ môi trường vừa khử trùng vào đĩa peptri:
Sát trùng môi trường tay trước đổ mơi trường.(Cồn 700)
Cầm đĩa peptri ( ngón trỏ đặt sát mép đĩa, ngón cịn lại đặt đáy đĩa)
Hơ đĩa peptri lửa đèn cồn=>tránh vi khuẩn tràn vào mở nắp Thao tác hơ: hơ vòng xung quanh thành đĩa peptri, sau hơ từ mép ngón trỏ sang mép ngón
(4)Mọi thao tác phạm vi lửa đèn cồn 15cm
Khi đổ mơi trường vào đĩa phải để miệng bình sâu vào đĩa đổ lớp mỏng, tránh để mơi trường dính thành bình=> tránh khuẩn lạc mọc lên thành bình tránh vi sinh vật bên ngồi sinh trưởng
Đợi mơi trường đơng lại úp ngược đĩa=> Để tránh nước nắp peptri rơi xuống làm biến đổi mơi trường, kín đĩa nhằm tránh vi sinh vật ngoại lại
Sau mang hấp khử tia cực tím=> Tia UV xuyên qua màng tế bào làm bất hoạt vi sinh vật thay đổi AND gây chết VSV
Chuẩn bị dung dịch VSV Đất để cấy vào môi trường Gause:
Chuẩn bị >40 ống nước cất(20 ống cho Lactobroth, 10 ống cho Gauss, 10 ống cho tinh bột) ống ml, bịt nút bơng , gói báo (ghi tên môi trường) mang hấp chung với bình tam giác mơi trường
-Sau hấp xong lấy nước đất xóc or dùng máy khuấy từ, sau mang pha lỗng với nước cất
-Ghi số lên ống nghiệm từ 10-1 tới 10-10.
Cách pha loãng: sát trùng mặt bàn tay với cồn 70oC
Mọi thao tác phải thực phạm vi 15cm cách lửa đèn cồn Hút 1ml dung dịch nước thải micro-pipet bơm vào ống nghiệm 10-1 ,
xóc ống hút 1ml sang ống 10-2, tương tự đến ống số 10-10=> sau mỗi
lần hút Nồng độ dung dịch giảm 10 lần, tức số lượng VSV giảm 10 lần ( để tránh sai số phải xóc mẫu trước rút VSV)
Thao tác cấy sang môi trường thạch đĩa Gauss ( lỏng sang rắn):
Để phân lập vi sinh vật phân giải Cellulose
Sát trùng mặt bàn tay, thao tác cách lửa đèn cồn
(5)(10-1)=>thao tác từ nồng độ nhỏ tới nồng độ lớn để lượng vi sinh vật mang
từ nồng độ nhỏ sang nồng độ lớn không đáng kể, đồng thời giảm sai số, tránh việc thay đầu tiếp micropipet sau lần hút
Hơ đĩa peptri sau bơm 0.1 ml dung dịch chứa VSV vào đĩa đóng nắp lại Khử trùng que trang tam giác ( khử trùng lần đầu) Áp lên nắp đĩa peptri để làm nguội que , làm bốc nước nắp đĩa,…… Áp nhẹ que lên mép thạch đĩa để kiểm tra nhiệt độ (nếu có tiếng xèo nghĩa que cịn nóng) sau trang dung dịch cấy lên bề mặt đĩa peptri=> làm vi sinh vật phân bố rời rạc dễ quan sát
Chú ý từ môi trường lỏng sang rắn cấy lượng dung dịch 0.1ml điện tích bề mặt thạch đĩa nhỏ nên cấy lượng vừa đủ để vừa trang xong bề mặt khơ tạm thời, TB VSV dính vào đĩa dễ đếm, lật ngược lại
Chuẩn bị mơi trường Czapek:
Tương tự với môi trường Gauss pH từ 6- 6.5 Thay saccarose= tinh bột (20 g)
Nước cất 500ml ban đầu+ 500 cho sau => Hóa chất khơng dính lên thành bình
pH từ 6-6.5 điều chỉnh H2SO4/ NaOH 10%
Argar chia làm lần (10 g) => Đảm bảo môi trường cấy đặc (Cho vào sau cùng)
Chia làm bình Tam giác (Argar 10, 10g), sau dùng nút bơng mỡ bịt kín, Gói báo quanh miệng (dễ lấy sau hấp + ghi tên môi trường giấy tránh nhầm lẫn)
Cho vào nồi hấp khử trùng ẩm (121oC , atm , (25 đến 30) phút –
phút đầu để tăng nhiệt độ lên), thời gian phụ thuộc vào máy khử trùng ẩm
(6)Pha loãng mẫu nước thải (20 ống từ nồng độ 10-1 –> 10-20 ) tuân theo quy tắc
pha loãng
Các bước cấy mẫu nước thải lên Lacto Broth tương tự với môi trường Gauss
Các bước pha mẫu tinh bột cấy lên Czapek tương tự.
Các bước chuẩn bị môi trường Gauss:
Nuôi cấy vi sinh vật phân giải Cellulose
Cân thành phần môi trường từ KNO3 đến FeSO4.7H2O Cho vào 500 ml nước cất , khuấy từ
Riêng ý tinh bột thay CMC (là mạch cắt ngắn Cellulose) 5g/ lít Cho CMC từ từ vào CMC chất khó tan
Argar (làm giá thể) chia làm phần phần 10g
Sau hòa tan thành phần cho Argar, thêm vào 500ml Cân chỉnh pH
Làm nút bông, bọc miệng
Buổi 2:
1 Sát trùng peptri Pha dd BGBL
3 Làm ống nghiệm nước cất Sấy ẩm
5 Xác định dương tính E.coli lactobroth Đánh dấu mt dương tính vào bảng mt LB
7 lấy Mẫu đất họ đậu + Mẫu đất hoa màu Pha loãng, đồng thời dd đất
(7)10.Đất họ đậu => Ashby 11.Cấy từ LB sang BGBL
Chuẩn bị đĩa peptri:
Sát trùng cồn khử trùng khô
Pha môi trường BGBL:
Môi trường BGBL môi trường tăng sinh chọn lọc cho phép vi khuẩn gram âm phát triển (E.Coli) Do có muối mật bò
Ủ 42oC để chọn lọc nhóm VSV chịu nhiệt( có E.Coli)
Cân hóa chất giáo trình trang 31
Cho 5-6 ml vào ống nghiệm có chứa ống Durham Dùng nút bơng bịt kín
Sau mang khử trùng ẩm
Làm ống nhiệm nước cất:
Tương tự buổi
Cả môi trường nước cất đem khử trùng ẩm
Quan sát xác định dương tính mơi trường LactoBroth:
Tiêu chuẩn xác định dương tính
1 Sinh khí ống Durham (C02)
2 Dung dịch huyền phù (tế bào vi sinh vật) Dung dịch chuyển màu
(8)Nồng độ (M)
Số ống Lacto Broth dương tính (Ống)
10-1 3
10-2 3
10-3 3
10-4 3
10-5 3
10-6 3
10-7 3
10-8 2
10-9 2
10-10 2
10-11 1
10-12 2
10-13 1
10-14 1
10-15 2
10-16 2
10-17 2
10-18 0
10-19 0
(9)Lấy mẫu đất họ đậu mẫu đất hoa màu:
Quy tắc lấy lấy mẫu đất gốc buổi
Pha loãng mẫu đất
Pha loãng mẫu đất vào ống nồng độ khác
Cấy mẫu đất hoa màu vào mơi trường Pikovkaia (đổ mt?) Cách đổ Ashby: cho ½ hóa chất tránh dư mơi trường
Cấy mẫu đất họ đậu vào môi trường Ashby(đổ mt?) Quy tắc cấy buổi
Cấy từ Lacto Broth sang BGBL: Nguyên tắc cấy từ loãng sang đặc Kiểm tra độ khít vịng que cấy
Dùng que cấy vòng khử trùng lửa đèn cồn (1/3 lửa, góc 45o),
Lắc trước cấy mẫu
Cho que cấy vào LB lấy vịng nước cấy sang mơi trường BGBL ghi nồng độ tương ứng
Đem ủ 420C sau 48h đọc kết xác định dương tính.
Buổi 3:
Nội dung thực hành:
1 Đọc kết cấy mt lactobroth sang BGBL42oC
2 Đánh dấu mt dương tính vào bảng mt BGBL Cấy từ mt BGBL sang mt EMB ,ủ 37oC
(10)Chi tiết thực hiện:
1.Đọc kết mơi trường BGBL
Cách đọc ống dương tính BGBL tương tự Lactobroth gồm dấu hiệu Sinh khí ống Durham (C02)
2 Dung dịch huyền phù (tế bào vi sinh vật) Dung dịch chuyển màu
2.Đánh dấu ống dương tính điền tiếp vào bảng
\
Nồng độ (M)
Số ống Lacto Broth dương tính (Ống)
Số ống BGBL dương tính
10-1 3 3
10-2 3 2
10-3 3 2
10-4 3 3
10-5 3 2
10-6 3 2
10-7 3 0
10-8 2 0
10-9 2 0
10-10 2 0
10-11 1 1
10-12 2 0
10-13 1 0
10-14 1 0
10-15 2 0
10-16 2 0
10-17 2 0
10-18 0
10-19 0
(11)3.Cấy từ BGBL sang EMB: PP cấy chuyền?
Dùng que cấy vòng( thao tác tương tự) cấy tương ứng từ BGBL sang EMB thao tác phạm vi lửa đèn cồn
Các đường cấy không trùng khít lên nhau, khơng cấy giao nhau, khơng làm vỡ thạch
Mỗi đĩa cấy nồng độ, nồng độ có nhiều mẫu dương tính chia thạch đĩa làm phần khác
Sau đem ủ 37oC.
4.Quan sát khuẩn lạc Xạ khuẩn, Vi khuẩn, Vi nấm môi trường thạch đĩa:
Xạ khuẩn : Là sợi khuẩn có sợi khuẩn ti nhỏ vi nấm có vịng trịn đồng tâm bề mặt thơ ráp xù xì, khơng phát triển tốt vi nấm Vi nấm: loại khuẩn lạc lớn nhất,những sợi khuẩn ti nhiều mọc tua tủa
bơng gịn, hệ sợi khuẩn ti lớn
Vi khuẩn: bề mặt trơn bóng ướt nhẹp, có số mẫu vi khuẩn kéo dài vi khuẩn di chuyển để tìm nguồn thức ăn, mẫu chuyển màu vi khuẩn trình sinh sản tạo bào tử
Đặc điểm nhận dạng VK phân giải P Pikovkaia:
(12)Buổi 4:
Tóm tắt:
1 Đọc kết cấy EMB Quy tắc nhận biết:
Xác định có mặt Ecoli màu tím ánh kim Nếu để lâu ánh kim nhạt dần trở thành màu tím đậm (Quá h sau có ánh kim)
2 Đánh dấu vào bảng: Nồng độ
(M)
Số ống Lacto Broth dương tính (Ống)
Số ống BGBL dương tính (Ống)
EMB(Ống)
10-1 3 3 3
10-2 3 2 1
10-3 3 2 1
10-4 3 3 2
10-5 3 2 2
10-6 3 2 1
10-7 3 0 0
10-8 2 0 0
10-9 2 0 0
10-10 2 0 0
10-11 1 1 1
10-12 2 0 0
10-13 1 0 0
10-14 1 0 0
10-15 2 0
Đọc kết cấy mt BGBL sang EMB
Đánh dấu mt dương tính vào bảng mt EMB
Tra bảng tính tốn số lương ecoli tối đa mẫu ban đầu theo bảng MPN để đánh
(13)10-16 2 0
10-17 2 0
10-18 0
10-19 0
10-20 0
Phương pháp xác định lượng VSV lớn qua bảng MPN: 1.Điều kiện chọn ống:
-Chọn ống liên tiếp bắt đầu xuất ống dương tính -Chọn nồng độ từ lỗng đến đặc
2.Cách tính:
-Tra bảng để lấy số lượng 100 ml nhân với nồng độ (lấy mũ dương)
Kết tra bảng
(14)Số lượng ống có sinh khí
Số lượng VSV
có/ 100ml
95% giới hạn tin tưởng
3 ống 10ml ống 1ml ống có0.1ml Cận Cận
0 <0.6
Vậy số lượng VSV có mẫu ban đầu nhiều 3.1010
Thành phần số lượng VSV nói lên điều gì?
Số lượng E.coli nói lên mơi trường bị ô nhiểm chất hữu gây bệnh đường ruột
Câu hỏi:
Vì mơi trường thay đổi nhiệt độ ủ:
Chức loại mơi trường nhóm VSV chiếm ưu thế: Gauss: nơi cấy xạ khuẩn có khả phân giải Cellulose
Xạ khuẩn chiếm ưu
Czapek : Nuôi cấy VSV phân giải tinh bột Vi nấm chiếm ưu
Ashby: dùng để xác định VSV cố định nito sống tự đất Vi khuẩn chiếm ưu
(15)Phân biệt hình thái loại VSV kính hiển vi: Nấm men:
Có nhiều trạng thái khác nhau: Sinh tưởng: dạng tròn
Nảy chồi Phân chia
Phát triển tạo thành vòng trịn khép kín giai đoạn +Nấm sợi:
Có sợi khuẩn ti, có khơng có vách ngăn, từ cuống tạo thành bọng sinh dây bào tử, gần bào tử non , xa bào tử già rụng khỏi bọng rơi vãi vào môi trường tạo thành bào tử trần, gặp điều kiện thuận lợi tiếp tục nảy mầm thành sợi nấm
+Bào tử túi +Xạ khuẩn :
Bao gồm khuẩn ti chất khuẩn ti khí sinh:
Khuẩn ti chất đâm chìm vào mơi trường để lấy chất Khuẩn thi khí sinh rơi tạo thành bào tử trần
Thể bình
(16)Quan sát vi sinh vật kính hiển vi: Mẫu 1:
Hình vẽ
Hình thực tế
(17)Hình thực tế
(18)Hình vẽ
Hình thực tế
(19)Hình thực tế
(20)Hình thực tế
(21)Hình thực tế
<Khơng chụp thay đổi>
(22)